肽抗生素，控制感染的新希望

传统的抗生素都是由霉菌产生的 ,霉菌是寻找抗生素的传统领域。然而 ,新近的研究表明 ,动物、植物和人体的基因组中也有编码抗生素的基因。这些基因编码的多为一些短肽 ,富含带阳离子的氨基酸残基 ,称为肽抗生素 (ｐｅｐｔｉｄｅａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ)或抗微生物肽 (ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌｐｅｐｔｉｄｅ) [1] 。肽抗生素和干扰素、补体等一样是宿主免疫防御系统的重要组成部分。因肽抗生素具有抗菌活性强 ,抗菌广谱性等特点 ,其研究受到广泛重视。1.肽抗生素的特点及其分类肽抗生素在自然界中广泛存在 ,代表宿主防御系统进化的古老…     

抗菌肽牛乳铁蛋白肽衍生肽在毕赤酵母中的表达及活性鉴定

利用巴斯德毕赤酵母系统表达抗菌肽牛乳铁蛋白肽衍生肽简称LfcinBD,获得的表达产物具有较强的抗菌活性.将人工设计的用化学合成法合成的以酵母偏爱密码子编码的LfcinBD基因片段克隆到巴斯德毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9K中,获得的重组质粒pPIC9K-LfcinBD通过限制性内切酶Sac Ⅰ酶切线性化,电击法转化毕赤酵母GS115宿主菌,G418抗性筛选,得到高拷贝转化子.经PCR检测,LfcinBD基因与毕赤酵母染色体稳定整合.阳性克隆经甲醇诱导表达LfcinBD,诱导表达5 d,每24 h取上清1 mL,进行抑菌试验.结果表明,抗菌肽牛乳铁多肽衍生肽基因已整合到酵母细胞基因组中并获得表达,经0.5%甲醇在30℃诱导48 h可产生较强抗菌活性的抗菌肽,而且对氨苄青霉素抗性的大肠杆菌亦有较强的抑菌作用.     

噬菌体裂解酶——现状与未来

噬菌体裂解酶是一种由DNA噬菌体基因编码的高特异性酶, 可高效消化细菌细胞壁。革兰氏阳性菌噬菌体裂解酶的结构域相似, 裂解效率高, 与抗生素具协同抗菌作用, 且不易产生耐受性菌株, 抗体等体液因子对裂解酶的裂解活性影响小, 裂解酶作为一种潜在抗感染药物具有重要的研究价值。目前已建立了多种病原菌裂解酶应用的动物模型, 在防控耐药性病原菌感染上取得重要进展。本文就噬菌体裂解酶的抗菌作用进行综述。     

人β-型肽抗生素研究进展

肽抗生素是生物体免疫防御系统的一个重要组成部分,有的为组成型表达,有的则只因微生物等因素的侵染而产生,肽抗生素带正电荷,对热稳定,具有广谱的抗菌活性,在迫切需要解决细菌对传统抗生素产生耐药性问题的今天,肽抗生素的研究为人类寻找新型的抗菌药物开辟了一条全新的道路。     

斑点叉尾鮰NK-lysin基因的cDNA克隆及融合表达质粒构建

以斑点叉尾鮰(Ictalurus punctatus)NK-lysin-type1的成熟肽为研究目标,首先通过RT-PCR和巢式PCR从斑点叉尾鮰的鳃中克隆到编码NK-lysin成熟肽的基因,该基因编码由92个氨基酸残基组成的成熟肽;6个高度保守的半胱氨酸残基位于成熟肽内,它们被推测与NK-lysin的抗菌活性有关。为了进一步构建原核表达系统用于成熟肽的表达,pET-32a(+)被选择作为融合表达质粒,该质粒含有1个trxA融合头基因,与目的片段mNK-lysin连接后形成融合基因trxA-mNK-lysin,进而有助于在工程菌E.coliBL21(DE3)中的可溶性融合表达。通过PCR、EcoR I和HindⅢ双酶切处理以及DNA测序鉴定,证明pET-32a-mNK-lysin重组融合表达质粒已经被成功构建;将其转化至工程菌E.coliBL21(DE3)后的测序结果表明该重组质粒未发生任何DNA变异。     

人源肽抗生素hBD—2表达质粒的构建及其在大肠杆菌中的表达

为了构建人源肽抗生素hBD－2的表达质粒燕在大肠杆中表达,将化学合成的hBD-2全基因原核融合蛋白靛质粒pinpointXa-3的多克隆位 构建成表达质粒,按常规方法转化大肠杆菌JM109,筛选阳性重组子并诱导融合蛋白的表达,结果经酶切鉴定获得7个阳性克隆,序列分析表明其中4个克隆的插入序列与hBD-2基因完全一致,另3个克隆插入序列的39位由C突变为5T,89 多了一个Go,正确的阳性克隆子在大肠杆菌中产生了约18kD的特异性诱导蛋白,hBD-2的成功表达为进一步研究hBD-2的抗菌活性,抗菌机理打下了一定的基础。     

重组人肽抗生素hPAB—β及其突变体的活性测定与筛选

从人体基因组中克隆了一个编码肽抗生素样的基因。按基因编码产物的氨基酸序列 ,化学合成目的产物 ,药物敏感测定法证实产物具有杀菌活性后 ,又用基因工程法人工表达了目的产物。测定表达的重组人肽抗生素hPAB β及其突变体的抗菌活性 ,筛选理想的活性分子。方法是应用平板法和最小抑菌浓度 (MinimumInhibitionConceng tration ,MIC)测定法检测重组表达的hPAB β及突变体hPAB β38,hPAB β34对 8株实验室保存菌株及 10株临床分离菌株的杀菌能力 ,并以化学合成的肽抗生素hPAB β作对照 ;根据各目的分子抗菌能力的强弱 ,筛选理想的目…     

可剪切多拷贝抗菌肽融合表达载体的构建

抗菌肽是生物体防御系统产生的一类对外源病菌具有高效杀灭活性的小分子多肽, 在植物抗病基因工程中具有重要的应用价值。Thanatin是刺肩蝽(Podisus maculiventris)成虫经诱导产生的一种抗菌肽, 由21个氨基酸残基组成, 该抗菌肽对革兰阳性、革兰阴性菌以及真菌都有很强的抗菌活性。为研究该抗菌肽转入油菜对菌核病抗性提高的效果, 采用同尾酶反复酶切连接的方法构建了分别含1~5拷贝的Thanatin串联融合表达载体, 并导入农杆菌用于油菜的遗传转化。研究采用引物重叠法扩增并克隆了抗菌肽基因, 并采用了一种在植物体内可被特异性切割的短肽作为连接肽, 使多拷贝融合表达的抗菌肽在植物体内可自动剪切为有功能活性的单个抗菌肽单元, 以增加抗菌肽表达丰度和抗菌肽的稳定性。研究还采用了大豆几丁质酶的信号肽作为引导肽引导多拷贝融合表达的抗菌肽分泌到细胞间隙, 以增强抗菌肽作用效果。     

重组人脑源性神经营养因子在大肠杆菌中的可溶性表达及纯化

按照人脑源性神经营养因子(hBDNF)基因成熟肽编码序列设计合成引物,从人基因组DNA中扩增出360bp的片段,插入到改构载体pTIG-trx上,获得了pTIG-trx—BDNF原核表达重组质粒,限制性酶切分析和DNA序列测定均证实该克隆插入片段为hBDNF基因成熟肽编码序列。将该重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达,在大肠杆菌表达系统中获得了高效可溶表达,并对表达产物进行了分离纯化,得到纯度大于83％的样品,Western杂交证实该蛋白具有hBDNF抗原活性。     

人造抗瘤活性肽的构建及其抗瘤作用

通过构建融合RGD肽的NF-κB抑制肽,获取新型抗瘤融合肽,研究其抗肿瘤效果。构建人造抗瘤活性肽p EGFP-C1-ARP表达载体,转染COS7细胞,获取人造抗瘤活性肽,利用Western blotting法检测PC-3M细胞A20、Bcl2、CCND1;通过观察ARP对荷人前列腺癌PC-3M裸鼠肿瘤抑制实验,研究人造抗瘤活性肽的抗肿瘤效果。限制性内切酶酶切鉴定与DNA测序证实合成人造抗瘤活性肽真核载体寡核苷酸链插入正确。Western blotting检测结果表明转染后PC-3M细胞A20蛋白表达增加。并抑制凋亡抑制基因Bcl2的表达,动物实验证实人造抗瘤活性肽可显著抑制肿瘤生长。本研究成功构建人造抗瘤活性肽,其对肿瘤细胞具有明显的消除效应。     

pGEM-8Hepc克隆载体的构建与序列分析

hepcidin是一种由肝脏合成的富含半胱氨酸的小分子肽,它的主要生物学功能是维持机体铁稳态,并且具有抗菌活性.本实验从大鼠肝脏组织克隆出hepcidin基因,用同尾酶法构建多拷贝串联基因克隆载体pGEM-nHepc(n=1,2,4,8)(单个hepcidin基因之间用一段连接肽的DNA连接),分别含有不同拷贝首尾串连的hepcidin cDNA,并在大肠杆菌DH5 α中扩增.重组体经双酶切和PCR鉴定后进行序列测定,所得结果与genbank中的大鼠序列比对,结果完全正确,为后续进一步的表达纯化奠定了基础.     

透明颤菌血红蛋白基因在提高枯草芽孢杆菌产脂肽功能中的研究

脂肽是一类具有特殊作用的生物表面活性剂。本实验将血红蛋白基因(vhb)置于RDR细菌启动子驱动下的质粒PSET中,构建PSET-RDR-vhb重组质粒,并通过电激作用转入脂肽代谢菌株-枯草芽孢杆菌株(bacillus subtilis)ZW-3中,转化菌株经酶切和PCR电泳检测鉴定,Southern-blot杂交显示部分转化菌株中外源基因插入基因组DNA,采用一氧化碳差异色谱法测定了血红蛋白的表达量。实验进一步对转化菌株的生长曲线、总蛋白量、过氧化氢酶活性、脂肽的产率进行了测定,结果显示,相比于原始菌株,转化菌株数据均有明显提高。     

节杆菌BT801基因文库构建及其乙内酰脲酶基因分离与表达

L-乙内酰脲酶产生菌节杆菌 BT801的染色体DNA经Sau3A I 部分酶切后分离30kb左右的片段,与经HpaI和PstI酶切的黏粒载体Pkc505进行连接,将连接产物用包装蛋白包装,转染大肠杆菌DH5α得到10 000多个转化子,构建成节杆菌BT801的基因组文库。通过薄层层析等方法筛选得到了1个阳性克隆,通过亚克隆得到了乙内酰脲酶的完整基因,该基因能分别利用自身的启动子和T5启动子在大肠杆菌中进行表达产生有活性的蛋白。     

用DNA重组技术获得乙型肝炎病毒e抗原及其在临床检测中的应用

HBeAg和抗－Hbe是乙型肝炎的经典标志物。HBeAg基因与HBcAg基因在DNA c区上相重叠。为要获得重组DNA衍生的HBeAg,本文从adw2亚型HBv 3．2 kb全长DNA上切取带有HBc基因的BamHI-EcoRI片段,用Bal3l和Hpa I酶处理产生一系列长度不同的片段,与载体pUR222和pUC 18构成不同的重组质粒,转化到大肠杆菌。通过平板筛选、质粒酶切图谱和抗原抗体反应等筛到高效表达HBeAg的转化株YG30l和YG302,中和试验证明了重组HBeAg的血清学特异性。用凝胶过滤、离子交换层析和亲和层析对其进行提纯并用聚丙烯酰胺凝胶电泳结合western印迹法进行纯度鉴定、含量分析和分子量测定。重组HBeAg制品具有高活性、稳定和安全等特点,实验证明它可以代替血源HBeAg制成酶联药盒用于乙肝诊断检测。     

螺旋霉素聚酮合成酶基因和抗性基因的克隆与表达的研究

根据不同聚酮合成酶基因DNA的同源性,利用放线紫红素聚酮合成酶基因act Ⅰ,actⅢ作探针,从螺旋霉索产生菌Str．spiramyceticus U-1941基因文库中检测并分离了螺旋霉素聚酮合成酶基因pCN3H8。限制酶酶切分析表明,其分子量为44kb。通过分子杂交实验,将螺旋霉素聚酮缩合酶基因(与act Ⅰ有同源性)及聚酮氧化还原酶基因(与actⅢ有同源性)进行了定位。pCN3H8 DNA在麦迪霉素产生菌变株Str.mycarofaciens sub sp．68中的表达产物,经紫外光谱分析与麦迪霉素相似。pCN3H8在放线紫红素聚酮缩合酶基因缺陷型变株Str．coelicolor TKl7中的表达产物,不具有放线紫红素的色素,其纸层析谱型与螺旋霉素有显著差别。pCN3H8在变青链霉菌Str．lividans TK24中的表达产物,也具有抗菌活性。将pCN3H8 DNA转化对螺旋霉素敏感的Str.griseofuscus原生质体,获得了螺旋霉素抗性的表达。从转化子中分离得到了质粒DNA pSG3,其分子量为7．0kb,可能是pCN3H8DNA转化Str．grlseofuscus时在体内缺失而形成。再转化实验证明,宿主菌对螺旋霉索的抗性,确实是由于pSG3 DNA作用的结果。含质粒pCG4,pSG3的螺旋霉素产生菌Str．Ambofaciens转化子螺旋霉素的产率明显提高。     

炭疽芽孢杆菌保护性抗原在大肠杆菌中的表达及纯化

按照炭疽芽孢杆菌保护性抗原（PA）基因成熟肽编码序列设计引物,从炭疽杆菌pOX1质粒中扩增出PA基因片段,将该片段定向插入到原核表达载体pET-28a中,获得了pET-PA原核表达重组质粒,限制性酶切分析和DNA序列测定均证实该克隆插入片段为PA基因的成熟呔编码序列。将该重组质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）,经IPTG诱导,重组蛋白在大肠杆菌表达系统中获得了高效表达;Western印迹分析表明表达产物具有良好的免疫学活性。     

肝脏表达的抗菌肽-2

抗菌肽是在多种生物体中表达的具有抗菌活性的肽类物质的总称.肝脏表达的抗菌肽-2(liver-expressed an-timicrobial peptide-2,LEAP-2)在肝脏中产生后分泌到血液中参与血液循环,从而发挥抗菌活性等作用.本文简要介绍LEAP-2的发现过程,对LEAP-2的基因组成、结构、诱导表达机理、抗菌活性以及基因调控等方面的研究进行综述,并展望LEAP-2可能的生理功能.     

抗菌肽Diptericin cDNA的克隆及在E.coli中的融合表达

 从果蝇成虫中抽提总 RNA,RT- PCR扩增编码伏蝇素 diptericin的 c DNA,克隆并测定了全序列 .将该 c DNA亚克隆到融合表达载体 p MAL- CR1上 ,转化大肠杆菌 BL2 1菌株 ,进行了高效的可溶性融合表达 .通过离子交换层析纯化融合蛋白 ,经 Xa因子酶切后得到的重组 diptericin具有抗菌活性 .     

牛乳铁蛋白肽转基因小鼠的构建

目的:探讨牛乳铁蛋白肽在转基因鼠乳汁中的表达及其抑菌活性。方法:将实验室构建并保存的包含山羊β-酪蛋白基因启动子和牛乳铁蛋白肽基因的乳腺特异表达载体PI-bcp-LfcinB,用Xho I和Nru I双酶切,得到含有全部表达盒的显微注射DNA片段,采用常规显微注射技术获得转基因小鼠。并通过对泌乳期转基因雌鼠乳腺组织的RT-PCR检测,确定了牛乳铁蛋白肽在mRNA水平的表达,同时利用琼脂板扩散法检测了转基因鼠乳汁中表达产物的抑菌活性。结果:获得了牛乳铁蛋白肽转基因小鼠,且转基因小鼠乳汁中能够表达具有抑菌活性的牛乳铁蛋白肽。结论:通过转基因动物乳腺可以获得具有生物活性的牛乳铁蛋白肽,为进一步研究抗菌肽转基因牛、培育抗乳房炎奶牛新品种以及通过建立转基因动物生物反应器进行抗菌肽的大量生产奠定了基础。     

人工会成柞蚕杀菌肽D基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

以质粒pWR450为载体,克隆了人工合成的柞蚕杀菌肽D基因(122bp),构建的重组子pWR450-Cec转化大肠杆菌JM103、用限制性内切酶酶切鉴定。产物经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,结果显示可表达杀菌肽-β-gal融合蛋白。