miR-195-5p通过靶向调控FBXW7基因对氧化型低密度脂蛋白诱导的血管内皮细胞损伤的影响研究

目的：探讨miR-195-5p对氧化型低密度脂蛋白（oxidized low-density lipoprotein, ox-LDL）诱导的人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells, HUVECs）损伤的影响及其作用机制。方法：RT-PCR检测miR-195-5p在ox-LDL诱导的HUVECs细胞中的表达;CCK-8、ELISA和流式细胞仪分别检测细胞增殖、氧化应激和凋亡;双荧光酶素报告分析实验检测miR-195-5p的潜在作用靶点;Western blot检测靶蛋白在ox-LDL诱导的HUVECs细胞中的表达及其与miR-195-5p表达之间的关系。结果：miR-195-5p在ox-LDL诱导的HUVECs细胞中的表达显著高于正常HUVECs细胞。随后,在ox-LDL诱导的HUVECs细胞中沉默miR-195-5p能有效促进HUVECs细胞增殖,并抑制氧化应激因子［丙二醛（malondialdehyde, MDA）和乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase, LDH）］表达和凋亡水平。双荧光酶素实验和Western blot结果分别显示miR-195-5p可以直接靶向FBXW7蛋白基因并负调控FBXW7的表达。最后,miR-195-5p能通过调节FBXW7的表达影响ox-LDL诱导的HUVECs细胞增殖、氧化应激和凋亡。 结论：miR-195-5p在ox-LDL诱导的HUVECs细胞中高表达。此外,miR-195-5p能通过抑制FBXW7的表达来加剧ox-LDL诱导的HUVECs细胞毒性、氧化应激和凋亡损伤。     

妊娠期糖尿病中患者miR-138-5p通过调控缺氧诱导因子1α保护β细胞功能

目的:探讨在妊娠期糖尿病(GDM)患者中miR-138-5p对胰岛β细胞功能的影响及其相关作用机制。方法:通过RT-qPCR对比15例GDM患者与15例的正常健康孕妇外周血中miR-138-5p的表达差异;miR-138-5p mimic及inhibitor分别转染入β细胞系INS-1细胞中,过表达或抑制其在该细胞中的表达水平,并通过RT-qPCR验证转染效率;利用MTT增殖实验、Annexin V-FITC凋亡实验及胰岛素释放实验分别检测miR-138-5p对INS-1细胞的增殖、凋亡和胰岛素释放能力的影响;通过miRNA靶基因预测软件TargetScan筛选miR-138-5p的目标靶基因,并利用双荧光素酶基因报告及Western blot实验进行验证;功能挽救实验证实miR-138-5p是否通过靶向调控其目标基因而发挥对INS-1细胞的增殖、凋亡及胰岛素释放能力影响;Western blot实验检测miR-138-5p在INS-1细胞中作用的分子信号通路。结果:与正常健康孕妇相比,GDM患者外周血中miR-138-5p的表达显著低表达;在INS-1细胞中转染miR-138-5p mimic及inhibitor后可显著促进或抑制miR-138-5p的表达;过表达miR-138-5p可明显促进INS-1细胞的增殖,抑制其发生凋亡并促进细胞对胰岛素的释放能力;而下调miR-138-5p的表达,可显著抑制INS-1细胞的增殖,促进其发生凋亡及抑制细胞的胰岛素释放能力;通过miRNA靶基因预测软件TargetScan筛选缺氧诱导因子1α(hypoxia-inducible factor-1α, HIF-1α)为miR-138-5p的目标靶基因,双荧光素酶基因报告实验及Western blot实验提示miR-138-5p可抑制INS-1细胞中HIF-1α的表达;功能挽救实验证实miR-138-5p通过调控HIF-1α的表达,影响INS-1细胞的增殖、凋亡及胰岛素释放能力;Western blot实验明确miR-138-5p可能通过靶向调控HIF-1α的表达,影响PI3K/AKT信号通路中PI3K、AKT及其磷酸化后的p-PI3K、p-AKT蛋白而发挥对INS-1细胞的作用。结论:在GDM患者中,miR-138-5p可能通过靶向调控HIF-1α的表达,进而影响PI3K/AKT信号通路,促进β细胞的增殖、抑制其凋亡,并促进其胰岛素释放能力从而保护β细胞的功能。     

miR-34a通过调控雄激素受体基因抑制前列腺癌细胞系LNCaP增殖

目的：探究miR-34a对雄激素受体（AR）基因的调控作用及对前列腺癌（PCa）LNCaP细胞增殖、凋亡的影响。方法：收集2016年10月至2019年9月本院泌尿外科行前列腺穿刺活检确诊为PCa患者组织标本36例,另取同期行手术治疗切除的良性前列腺增生（BPH）组织标本41例。体外培养LNCaP细胞,分别转染miR-34a mimics（mimics组）,miR-34a mimic NC（NC组）,设正常生长细胞为空白对照组（BC组）,另在mimics组基础上转染AR过表达（AR过表达组）载体及其对照（AR对照组）,采用CCK-8试剂盒检测细胞活性,Annexin V-FITC/PI双染色流式细胞凋亡检测试剂盒检测细胞凋亡率,实时定量PCR（RT-qPCR）检测miR-34a及AR mRNA表达水平,免疫印迹法检测AR蛋白、细胞周期蛋白D1（cyclinD1）及原癌基因产物（c-Mcy）、细胞凋亡相关蛋白（Bcl-2、Bax、capase-3）的表达水平。结果：与BPH组织比较,PCa组织中miR-34a表达水平显著降低（P<0.05）,AR mRNA及蛋白表达水平均显著增加（P<0.05）;与BC、NC组比较,mimics组LNCap细胞miR-34a表达水平、细胞凋亡率、Bax蛋白表达水平显著增加（P<0.05）,AR、Cyclin D1、Bcl-2、Bax蛋白表达水平显著降低（P<0.05）,同一时间LNCap细胞活力均显著降低（P<0.05）;双荧光素酶实验结果显示,miR-34a与AR可能存在一定的调控关系,过表达AR基因可逆转miR-34a mimics对LNCaP细胞增殖抑制,促进凋亡作用。 结论：miR-34a可能通过调控AR抑制前列腺癌LNCaP细胞增殖,促进其凋亡。     

miR-142-5p通过DNA甲基转移酶1抑制胃癌细胞增殖迁移的机制研究

目的:探究miR-142-5p在胃癌（GC）细胞中的作用并研究其机制。方法:qRT-PCR检测miR-142-5p表达;CCK-8和Transwell实验研究miR-142-5p对细胞增殖及迁移的影响;双荧光素酶报告基因和Western blot验证miR-142-5p的作用靶点。结果:miR-142-5p在GC组织及细胞系中的表达分别低于人正常胃组织及胃正常上皮黏膜细胞系GES-1,且其表达水平与胃癌肿瘤大小及淋巴结转移密切相关。在MKN28细胞中过表达miR-142-5p及在BGC-823细胞中沉默miR-142-5p能够分别抑制及促进胃癌细胞的增殖和迁移。DNA甲基转移酶1（DNMT1）是miR-142-5p直接作用靶点,miR-142-5p能够直接调节DNMT1的表达,并通过DNMT1调控胃癌细胞增殖及迁移。结论:miR-142-5p在GC中的表达降低,并在胃癌细胞中发挥抑癌基因的作用,能够通过抑制DNMT1来抑制胃癌细胞的增殖和迁移。     

当归红芪超滤物对miR-21-5P靶向调控TGF-β1介导放射性心肌纤维化的干预效应

目的：揭示miR-21-5P靶向调控TGF-β1是介导心肌成纤维细胞活化的关键机制,明确当归红芪超滤物对miR-21-5P靶向调控TGF-β1机制的干预效应。方法：（1）将细胞随机分为正常组、辐照组,辐照组接受6Gry单次照射,后采用RT-PCR检测miR-21-5P,Western Blot检测α-SMA、TGF-β1的表达;（2）细胞随机分为正常组、辐照组、miR-21-5PNC+辐照组、miR-21-5Pinhibitor+辐照组,后采用RT-PCR检测miR-21-5P,Western Blot检测TGF-β1、Smad3、Smad7的表达,免疫荧光染色检测MMP-9、TIMP1表达,EDU染色检测细胞凋亡;（3）将细胞随机分为正常组、辐照组、RAS-RH+辐照组,后采用RT-PCR检测miR-21-5P,Western Blot 检测TGF-β1、Smad3、Smad7的表达,免疫荧光染色检测MMP-9、TIMP1表达,EDU染色检测细胞增殖。结果：（1）辐照组miR-21-5P、α-SMA、TGF-β1的表达明显高于正常组（P<0.01）,表明X线辐射可诱导心肌成纤维细胞活化,同时miR-21-5P、TGF-β1与心肌纤维化的发生密切相关;（2）miR-21-5Pinhibitor+辐照组中miR-21-5P、TGF-β1、Smad3、TIMP1表达明显低于辐照组、miR-21-5PNC+辐照组,MMP-9、Smad7表达明显高于辐照组,EDU染色阳性率降低、细胞数目减少,表明miR-21-5P靶向调控TGF-β1是介导心肌纤维化的关键机制;（3）RAS-RH+辐照组miR-21-5P、α-SMA、TGF-β1、Smad3、TIMP1表达明显低于辐照组,MMP-9、Smad7表达明显高于辐照组,EDU染色阳性率、细胞数目略有降低,表明RAS-RH可通过抑制miR-21-5P靶向调控TGF-β1机制干预放射性心肌纤维化的发生。结论：RAS-RH可通过抑制miR-21-5P靶向调控TGF-β1的机制干预心肌纤维化的发生。     

下调lncRNA LINC00176对肺癌A549/DDP细胞顺铂耐药和自噬的影响

目的：研究下调lncRNA LINC00176对肺癌A549/DDP细胞顺铂耐药和自噬的影响及机制。方法：qRT-PCR方法测定正常支气管上皮16HBE细胞和肺癌A549、A549/DDP、NCI-H1299、SK-MES-1细胞中LINC00176的表达。将A549/DDP细胞分成对照组、si-NC组、si-LINC00176组、si-LINC00176+Anti-miR-NC组、si-LINC00176+Anti-miR-138-5p组。MTT实验检测顺铂对A549/DDP的半数抑制浓度（IC50）。流式细胞术测定细胞凋亡。Western blot测定LC3-I、LC3-II、Beclin 1、C-Caspase-3蛋白表达。利用荧光素酶报告系统鉴定LINC00176和miR-138-5p的靶向关系。结果：与16HBE细胞比较，A549、A549/DDP、NCI-H1299、SK-MES-1细胞中LINC00176表达水平显著升高（P<0.01）。与A549细胞比较，A549/DDP细胞中LINC00176表达水平显著升高（P<0.01）。与对照组、si-NC组比较，si-LINC00176组A549/DDP细胞IC50显著降低（P<0.01），LC3-II/LC3-I、Beclin 1蛋白表达显著降低（P<0.01），凋亡率、C-Caspase-3蛋白表达、miR-138-5p表达水平显著升高（P<0.01）。LINC00176与miR-138-5p直接结合。与si-LINC00176+Anti-miR-NC组比较，si-LINC00176+Anti-miR-138-5p组A549/DDP细胞IC50显著升高（P<0.01），LC3-II/LC3-I、Beclin 1蛋白表达显著升高（P<0.01），凋亡率、C-Caspase-3蛋白表达显著降低（P<0.01）。 结论：下调lncRNA LINC00176通过靶向上调miR-138-5p能够抑制肺癌A549/DDP细胞顺铂耐药，抑制细胞自噬，诱导细胞凋亡。     

miR-34a-5p在膀胱癌组织中的表达及其对膀胱癌细胞侵袭迁移的影响和机制

目的:研究miR-34a-5p在膀胱癌组织中的表达及其对膀胱癌细胞侵袭迁移的影响和机制。方法:收集50例膀胱癌组织及对应的癌旁组织，qRT-PCR检测miR-34a-5p表达差异。在膀胱癌细胞中转染miR-34a-5p mimics，qRT-PCR、Transwell小室和Western blot分别检测miR-34a-5p水平、侵袭迁移数目和E-cadherin、N-cadherin、Vimentin蛋白表达水平。靶基因预测软件发现肿瘤蛋白D52（TPD52）可能为miR-34a-5p的靶基因，构建荧光素酶报告载体鉴定靶基因。Western blot检测miR-34a-5p mimics对膀胱癌细胞中TPD52表达的影响。以qRT-PCR检测膀胱癌组织和癌旁组织中TPD52表达变化，分析膀胱癌组织中TPD52表达水平与miR-34a-5p表达水平的相关性。将miR-34a-5p mimics和pcDNA3.1-TPD52共转染至膀胱癌细胞中，按照上述方法检测细胞中TPD52蛋白、侵袭迁移数目及E-cadherin、N-cadherin、Vimentin蛋白表达变化。 结果:miR-34a-5p在膀胱癌组织中表达水平降低，miR-34a-5p mimics提高膀胱癌细胞中miR-34a-5p表达水平，降低膀胱癌细胞侵袭和迁移能力，降低膀胱癌细胞中N-cadherin、Vimentin蛋白表达水平，提高E-cadherin蛋白表达水平。miR-34a-5p靶向调控TPD52表达，并且miR-34a-5p mimics抑制细胞中TPD52蛋白表达。TPD52在膀胱癌组织中高表达，其在膀胱癌组织中的表达水平与miR-34a-5p呈负相关。与共转染miR-34a-5p mimics和pcDNA3.1的细胞比较，miR-34a-5p mimics和pcDNA3.1-TPD52共转染提高膀胱癌细胞中TPD52蛋白表达水平，提高膀胱癌细胞侵袭和迁移能力，促进细胞中N-cadherin、Vimentin蛋白表达，降低E-cadherin蛋白表达水平。结论:miR-34a-5p在膀胱癌组织中低表达，上调miR-34a-5p靶向TPD52抑制膀胱癌细胞侵袭和迁移。     

白藜芦醇调控miR-409-3p/FKBP14抑制胃癌细胞BGC823恶性进程

目的：探究白藜芦醇（resveratrol, RES）调控miR-409-3p/FKBP14对胃癌（gastric cancer, GC）细胞恶性生物学进程的影响。方法：CCK-8实验研究RES对BGC823细胞活性的影响；qRT-PCR检测RES对miR-409-3p表达的调控；EdU实验研究RES对BGC823细胞增殖的影响；Transwell实验研究RES对BGC823细胞迁移和侵袭的影响；双荧光素酶报告基因和Western blot实验检测miR-409-3p对FKBP14表达的调控。结果：RES（>200 μmol/L）能够显著抑制BGC823细胞活性。RES通过上调miR-409-3p抑制胃癌细胞增殖、迁移和侵袭。FKBP14是miR-409-3p的靶基因，RES能够通过上调miR-409-3p抑制胃癌细胞中FKBP14的表达。过表达FKBP14后减弱RES的抑癌作用。 结论：RES可通过调控miR-409-3p/FKBP14信号通路在胃癌中发挥肿瘤抑制作用，RES有应用于临床胃癌治疗的潜力。     

白藜芦醇通过miR-937/FOXQ1信号通路抑制视网膜母细胞瘤细胞增殖

目的:研究白藜芦醇（RES）对视网膜母细胞瘤Y79细胞增殖的影响及其可能的作用机制。方法:CCK-8方法和流式细胞术分析细胞增殖和凋亡情况;TargetScan软件预测miR-937与叉头框蛋白Q1（FOXQ1）之间的关系,并采用双荧光素酶报告基因系统检测它们之间的相互作用;miR-937和FOXQ1 mRNA和蛋白表达水平分别采用逆转录-定量聚合酶链反应法（RT-qPCR）和Western blot法检测。结果:RES抑制Y79细胞增殖,诱导其凋亡;视网膜母细胞瘤细胞系中miR-937表达水平较正常组织明显降低,而RES可明显诱导Y79细胞中miR-937表达;FOXQ1可以与miR-937直接相互作用,且其表达水平与miR-937呈负相关性;视网膜母细胞瘤细胞系中FOXQ1表达水平较正常细胞明显增高,而RES可明显抑制Y79细胞中FOXQ1表达;与RES单纯处理组相比,RES+miR-937 inhibitor组明显降低miR-937表达,促使了FOXQ1表达,诱导Y79细胞增殖,并降低其凋亡。结论:RES通过上调miR-937水平降低FOXQ1表达,进而抑制视网膜母细胞瘤细胞增殖、诱导其凋亡,提示miR-937/FOXQ1信号通路可能是视网膜母细胞瘤治疗的新靶标。     

microRNA-1304通过靶向血红素氧合酶-1对人肺癌细胞的抑制作用

目的:探讨miR-1304对肺癌细胞增殖和侵袭的作用及机制。方法:应用实时定量PCR检测miR-1304在不同转移能力肺癌A549和NCI-H1975细胞中的表达水平;脂质体2000介导分别转染miR-1304类似物和抑制物入A549 和 NCI-H1975细胞;应用MTT法和细胞集落形成实验分别检测miR-1304对肺癌细胞增殖活性的作用及生长抑制作用;细胞凋亡和细胞周期分别采用膜联蛋白V-PE/7-AAD和PI染色分析进行检测。双荧光素酶报告基因验证miR-1304是否作用于血红素氧合酶（heme oxygenase-1,HO-1） mRNA的3'UTR区预测靶位;Western blot检测HO-1蛋白水平。结果:miR-1304高表达可显著抑制肺癌细胞形成的数量和生存能力,以及诱导细胞凋亡和G0/G1期细胞周期阻滞。体外侵袭实验及细胞增殖实验结果显示,miR-1304可抑制肺癌细胞侵袭和增殖;经双荧光素酶报告基因验证HO-1是miR-1304的靶基因。结论:miR-1304在肺癌中表达,通过直接作用于HO-1可抑制肺癌细胞的侵袭和增殖,miR-1304是肺癌的一个潜在治疗靶点。     

结肠癌患者血清中miR-186-5p表达的研究

目的：探讨miR-186-5p在结肠癌中的表达及其对于结肠癌的影响,为结肠癌的治疗和预后治疗提供新的治疗靶点。方法：收集本院符合条件的病人血清样本,分为健康组、临床I、II、III、IV期5个组别（n=20）,利用miRVana microRNA分离试剂盒提取病人血清中的miRNA,利用荧光实时定量PCR检测miR-186-5p在不同阶段结肠癌病人血清中表达的差异。将miR-186-5p的全长基因克隆到pENTR/D-Topo载体,构建miR-186-5p高表达的细胞系,利用miR-186-5p抑制剂,降低miR-186-5p表达。利用细胞增殖ELISA试剂盒,将5×103/孔的细胞接种到96孔板中,孵育24 h后加入BrdU标记24 h,在370和492 nm测定吸光度,测定miR-186-5p对肿瘤细胞增殖的影响。用MTT法检测miR-186-5p对结肠癌细胞系对化疗药物敏感性的影响。结果：结肠癌病人血清中miR-186-5p呈低表达状态,与正常组相比,临床I、II、III、IV期病人血清中miR-186-5p表达明显减少（P<0.01）。利用质粒构建miR-186-5p高表达的细胞系,利用miR-186-5p抑制剂（hsa-miR-186-5p inhibitor）降低SW480、HCT116两种细胞内miR-186-5p的表达。与对照组相比,过表达miR-186-5p的HCT116细胞和SW480细胞增殖能力减弱,说明miR-186-5p表达增多抑制了HCT116细胞和SW480细胞的增殖。miR-186-5p抑制剂处理后,与对照组相比,HCT116细胞和SW480细胞的增殖能力均升高,说明miR-186-5p表达降低可以增加HCT116细胞和SW480细胞的增殖。不同浓度顺铂处理24 h后,高表达miR-186-5p的HCT116和SW480细胞死亡率均高于对照组（P<0.01）,miR-186-5p表达降低后,死亡率低于对照组（P<0.01）。在miR-186-5p高表达的结肠癌细胞系中,PLK1蛋白表达降低,而抑制miR-186-5p表达后,PLK1蛋白表达升高。 结论：结肠癌患者中miR-186-5p表达降低,过表达miR-186-5p可以抑制结肠癌细胞增殖生长,并降低结肠癌细胞的耐药性,抑制miR-186-5p表达可以增加结肠癌细胞增殖,并增强细胞的耐药性。     

miR-1-3p/206/613对LXRα和OATP1B1蛋白表达的影响及其机制研究

目的: 探究miR-1-3p、miR-206和miR-613对肝X受体α (LXRα)和有机阴离子转运多肽1B1（OATP1B1）蛋白表达及OATP1B1转运能力的影响及其机制研究。方法:通过生物信息学数据库预测可靶向作用于LXRα和OATP1B1 mRNA 3'-UTR的miRNAs;采用RT-qPCR、Western blot方法检测miR-1-3p/206/613及LXRα和OATP1B1 蛋白水平;采用LC-MS/MS方法检测HepG2细胞中瑞舒伐他汀（RSV）的含量;应用双荧光素酶报告基因法,研究miR-1-3p/206/613影响LXRα和OATP1B1表达的分子机制。结果: 预测结果表明miR-1-3p/206/613与LXRα和OATP1B1 mRNA 3'-UTR互补配对,且具有较高的特异性、保守性及结合稳定性。与对照组相比,miR-1-3p/206/613 mimics能明显下调HepG2细胞中LXRα蛋白表达水平16.5%、16.0%、25.1%,OATP1B1蛋白30.4%、30.5%、44.4%;相反,miR-1-3p/206/613 inhibitors明显上调LXRα蛋白表达水平13.3%、13.3%、16.0%,OATP1B1蛋白25.0%、25.6%、30.4%。当RSV浓度为5、60、125 μmol/L时,miR-1-3p/206/613 mimics显著减少HepG2细胞对RSV的摄取至对照组的0.50、0.19、0.30倍,0.49、0.24、0.23倍和0.64、0.48、0.31倍;与之相反,miR-1-3p/206/613 inhibitors上调1.26、1.59、2.07倍,1.97、2.44、2.63倍,2.22、2.86、2.93倍。与对照组相比,miR-1-3p/206/613 mimics或miR-1-3p/206/613 inhibitors,pGL/LXRα-WT报告基因荧光素酶活性分别下降38.5%、32.5%、32.8%或升高137.0%、75.8%、55.7%,而pGL/LXRα-Mut报告基因荧光素酶活性未见明显改变;同上,pGL/OATP1B1-WT报告基因荧光素酶活性下降24.3%、28.9%、32.1%或升高33.5%、48.3%、61.6%,而pGL/OATP1B1-Mut报告基因荧光素酶活性也未见明显改变。结论: miR-1-3p/206/613既可通过直接靶向作用于OATP1B1 mRNA 3'-UTR而调控OATP1B1的蛋白表达和转运功能,也可通过靶向作用于LXRα mRNA 3'-UTR而发挥间接调控作用。