超声微泡介导EGFP质粒转染视网膜母细胞瘤细胞与传统转染方法效率对比

目的探讨超声微泡造影剂在一定能量的超声波辐照下，介导EGFP质粒转染视网膜母细胞瘤（RB）细胞的效率及可行性。 方法将RB细胞分为6组，1组以一定能量的超声波辐照，2组加适当剂量的微泡造影剂，3组加入质粒，4组加入质粒与微泡，5组加入质粒、微泡，并用一定能量的超声辐照，6组予脂质体与质粒。转染24-48h后观察EGFP表达，并用RT—PCR进行检测。同时对1、2组予以染色。 结果超声微泡介导的DNA质粒对RB细胞的转染效率，与脂质体介导的质粒转染效率相似，明显高于其他实验组。一定能量和时间的超声波辐照，及适当浓度的微泡，对RB细胞的活性无明显抑制。 结论利用低频率和一定能量的超声击碎携带EGFP质粒的超声微泡造影剂，能够有效地提高DNA质粒在RB细胞中的转染效率。     

超声介导白蛋白微泡破裂对外源性基因在ECV304细胞和BALB/c鼠心肌中的表达

目的 探讨经超声介导白蛋白微泡破裂对外源性基因在体外ECV304细胞的转染效率及表达情况和在BALB／c鼠心肌中的表达及显像效果。方法 18只BALB／c小鼠分为裸质粒组（P组）、质粒＋超声介导转化组（P＋U组）、质粒＋白蛋白微泡＋超声介导转化组（P＋M＋U组），每组6只。选择携带增强绿色荧光蛋白基因（EGFP）的质粒DNA并与自制的白蛋白微泡相混，以超声介导白蛋白微泡破裂方法分别在体外对ECV304细胞及体内对BALB／c鼠心肌细胞进行基因转染，并测定基因转染和表达效率。结果 体内和体外研究表明，超声介导的白蛋白微泡破裂组（P＋M＋U组）与P和P＋U组相比可明显提高外源性基因转染及表达效率（P〈0．01）。体外采用频率0．8MHz、声强1．0W／cm^2、10％占空比，并30s两次的超声介导白蛋白微泡破裂可有效稳定地转染EGFP基因在ECV304细胞中的表达，并对细胞无毒副作用；体内超声介导白蛋白微泡破裂后具有良好的心肌灌注显像效果。结论 超声介导的白蛋白微泡破裂是一种安全且有效的基因转染方法，在一定的超声条件下可明显提高外源性基因在体内和体外的转染和表达。     

超声微泡造影剂介导EGFP质粒转染大鼠视网膜的实验研究

目的探讨超声破坏微泡介导EGFP质粒转染大鼠视网膜的效率及可行性，为实现外源基因高效、定向的转移目的奠定基础。方法将30只Long-evans大鼠分为6组，第1组仅以0．5w／cm。的超声波辐照大鼠眼球，第2组于尾静脉输入适当剂量的微泡造影剂，并立即以相同能量的超声波辐照大鼠眼球，第3组于尾静脉输入质粒，第4组于尾静脉输入质粒，并以超声辐照大鼠眼球，第5组于尾静脉输入质粒与微泡，第6组尾静脉输入质粒、微泡，并用超声辐照眼球。转染2周后，在激光共聚焦显微镜下观察EGFP表达情况。结果超声微泡介导的EGFP质粒对大鼠视网膜的转染效率，明显高于其他实验组。一定能量和时间的超声波辐照，及适当浓度的微泡，对大鼠视网膜脉络膜无明显损伤。结论利用低频率和一定能量的超声击碎携带EGFP质粒的超声微泡造影剂，能够有效地提高EGFP质粒在大鼠视网膜的转染效率。     

超声和微泡造影剂介导细胞基因转染的实验研究

目的 探讨低频超声对细胞基因转染的作用。方法 超声治疗仪频率1MHz，脉冲重复频率100Hz，占空系数20％。质粒DNA为含编码绿荧光蛋白的pEGFP。应用荧光显微镜和流式细胞仪评价细胞基因转染率，台盼蓝染色计算细胞成活率。选用C2C12、3T3-MDEI和CHO3种细胞系为研究对象，加入DNA后辐照不同声强、时间或加入超声造影剂，观察各条件下的细胞基因转染率和成活率。结果 ①超声介导的基因转染与声强和辐射时间有关，最佳剂量为1w／cm^2 20s；②同样超声剂量，较高的声强较早达到最大基因转染率；③较低剂量时，微泡造影剂可使超声介导的基因转染提高2～3倍并可显著提高最高基因转染率。结论 低频超声可介导细胞基因转染，基因转染率不但与超声辐射剂量有关，而且同样剂量时，高声强较早达到最大基因转染率，最佳剂量是1w／cm^2 20s。同时，微泡造影剂可提高超声介导基因转染的最高转染率。     

自制脂质微泡联合超声辐照介导pGL3-Promoter-EGFP质粒转染卵巢癌细胞的实验研究

目的 探讨超声微泡介导基因转染卵巢癌细胞的可行性及转染效率.方法 (1)以不同声强作用SKOV3细胞60 s,筛选出对细胞活性无明显抑制的声强;(2)将筛选出的声强分别与不同浓度的微泡联合作用于SKOV3细胞,筛选出对细胞无明显抑制的最适声强和微泡浓度的组合;(3)将SKOV3细胞分成5组,不同方式转染pGL3-Promoter-EGFP质粒:(1)裸质粒组;(2)质粒 微泡组;(3)质粒 超声组;(4)质粒 超声 微泡组;(5)质粒 脂质体组,比较各组转染效率.结果 (1)声强0.5、0.75 W/cm2的超声辐照,细胞死亡率＜10%;(2)0.24×108/ml或0.12×108/ml浓度的微泡联合0.5W/cm2超声辐照,细胞死亡率＜10%;(3)第4组与第5组转染效率无区别(P=0.133),但高于第1、2、3组(P＜0.001).结论 适当浓度微泡联合超声辐照能将外源基因在卵巢癌细胞中高效转移.     

超声辐照SonoVue增强脂质体介导pEGFP-N1转染乳腺癌细胞

目的 探讨超声辐照SonoVue介导增强型绿色荧光蛋白报告基因质粒(pEGFP-N1)转染乳腺癌MCF-7细胞的最优条件以及超声联合微泡造影剂增强脂质体转染的效果.方法 体外培养人乳腺癌MCF-7细胞,按照不同的辐照条件分组:不处理组,超声辐照十质粒组,微泡浓效组,超声声张组,辐照时间组及工作周期组.分别进行超声辐照,辐照后以MTT法测细胞存活度,流式细胞仪测pEGFP-N1瞬时转染率,取得最佳的辐照条件.重新准备细胞后先以脂质体转染细胞,2 h后加入超声微泡并以最佳条件辐照,用同样的方法测细胞存活率及转染率.结果 20%的造影剂浓度、1.5 W/cm2的声强、90 s的辐照时间、20%的工作周期(占空比)为超声辐照SonoVue介导pEGFP-N1转染MCF-7细胞的最优条件,转染率为(14.21±2.55)%,细胞存活率为(84.60±2.85)%.在增强脂质体转染的实验中,超声微泡脂质体组的转染率最高(22.15±2.69)%,与其他各组相比差异有统计学意义(P<0.05),此时细胞存活率为(80.13±3.61)%.结论 20%的造影剂浓度、1.5 W/cm2的声强、90 s的辐照时间、20%的工作周期是MCF-7细胞的最佳转染条件,超声联合微泡能够增强脂质体转染的效果.     

超声辐照微泡声学造影剂增强脂质体介导肝细胞基因转染的体外实验研究

目的研究超声破坏微泡声学造影剂提高脂质体介导肝细胞生长因子质粒（plRES—EGFP—HGF）在肝细胞中转染率的可行性。 方法将培养的肝细胞分为4组：（1）单纯对照组，（2）脂质体转染组，（3）超声辐照脂质体转染组，（4）超声辐照微泡＋脂质体转染组。第（4）组按照每孔加入造影剂剂量又分为1）10μl组，2）20μl组，3）30μl组，4）40μl组4亚组。超声辐照微泡＋脂质体转染组在脂质体介导肝细胞生长因子转染肝细胞1h后，在24孔板中每孔加入微泡声学造影剂10，20，30或40μl，超声辐照60s。24h后用荧光显微镜观察绿色荧光蛋白表达情况、MTT法检测肝细胞增殖率和流式细胞仪检测基因转染率。 结果超声频率1MHz，功率0．5W／cm。辐照60S，每孔加入造影剂30μl时肝细胞基因转染效率最高，与脂质体转染组比较有显著性。 结论在一定条件下，超声辐照微泡声学造影剂可明显提高脂质体介导肝细胞基因转染效率，为基因治疗提供了新的思路。     

超声辐照和SonoVue微泡在介导hAng-1基因体外转染时的作用和量效关系探讨

目的 探讨超声辐照和SonoVue微泡分别使用和联用在介导hAng-1基因体外转染过程中的作用以及辐照强度和微泡浓度对转染效率和细胞活性的影响.方法 实验分四组A组:单纯超声辐照+质粒组;B组:微泡+质粒组;C组:超声辐照+微泡+质粒组和空白对照组D组. C组内转染参数分别设置为超声照射强度0.5、1.0 、1.5和2.0 W/cm~2,微泡浓度5%、10%、20%、30%和40%.将连接有eGFP-C_3-hAng-1质粒的SonoVue微泡对293T细胞进行转染,48 h后检测各组基因转染效率和细胞存活率. 结果转染48 h后C组转染效率最高,荧光阳性细胞数最多,强度最大;A组转染效率很低,见少量荧光表达;B、D组无明显基因转染发生.随着超声照射强度和微泡浓度的增加,基因转染效率会逐步升高,具有统计学意义.微泡浓度大于20%、超声照射强度超过1.5 W/cm~2后基因转染效率不再升高甚至降低,细胞死亡率显著增高(P<0.01).结论 SonoVue微泡介导外源基因转染必须联合超声辐照才能获得较好的转染效率.对于hAng-1基因和SonoVue微泡,选择声强1.5 W/cm~2,微泡浓度20%是相对最佳转染条件.     

脂质体微泡促进超声波溶栓作用的体外实验

目的在体外循环条件下，评价脂质体造影剂微泡对超声溶栓的影响及其与超声波频率、强度之间的关系。方法以健康成人静脉全血37℃恒温水浴孵育2h制备体外血栓80份。40份样本被分为单纯超声组、单纯微泡组、微泡＋超声组和对照组。辐照超声为2MHz-1．8W／cm^2、占空比95％的脉冲式超声波，脂质体微泡用量为50μl，各组处理时间为10min。比较各组溶栓率。其余血栓样本分为4组，加入50μl微泡后分别给予2MHz-0．7W／cm^2、2、MHz-1．4W／cm^2、1、MHz-0．7W／cm^2和0．5MHz-0．7W／cm^2的脉冲式超声波辐照10min。计算溶栓率与频率、声强之间的相关性。结果微泡＋超声组溶栓率明显高于单纯超声组（P〈0．05）、单纯微泡组（P〈0．01）和对照组（P〈0．01）。溶栓率与超声频率呈负相关（r1=1．000，P〈0．01），与声强呈正相关（r=-1．000，P〈0．01）。结论在体外循环条件下，脂质体微泡能显著增强超声波溶栓作用，且其效果与超声频率成反比，与声强成正比。     

共聚物P85和微泡造影剂对小鼠骨骼肌超声介导基因转染的影响

目的 探讨共聚物P85、微泡造影剂和超声在质粒DNA对小鼠骨骼肌基因转染中的影响.方法 应用共聚物P85、微泡造影剂Optison与DNA混合后直接小鼠胫前肌(TA)注射,并辐照超声.1周后取出胫前肌并快速冰冻切片,荧光显微镜计数表达GFP转染的肌纤维数,HE染色评价肌肉损伤情况.结果 共聚物P85和微泡造影剂Optison均可促进质粒DNA的基因转染(P<0.01,P<0.05).辐照超声可使P85介导的基因转染效率显著提高(P<0.01),但对微泡造影剂介导的基因转染却无显著提高(P>0.05),并且P85所介导的基因转染效率高于微泡造影剂介导的基因转染效率(P<0.01).微泡造影剂和P85耦合并辐照超声可使质粒的基因转染效率显著提高,与所有各组的差异有统计学意义(P<0.01).同时辐照超声显著增加含微泡造影剂组骨骼肌的损伤面积(P<0.01).结论 共聚物P85和微泡造影剂可介导质粒DNA的基因转染,辐照超声对其有促进作用,三者联合应用具有协同作用.     

低频超声照射SonoVue对绿色荧光蛋白质粒在小鼠肝癌移植瘤中表达的作用

目的 研究物理参数对体内基因转染率的影响,确定最佳剂量-效应关系.方法 建立小鼠(C57BL/6J)肝癌皮下移植瘤模型,经尾静脉注入绿色荧光蛋白质粒(pEGFP)和SonoVue混合物,给予不同辐照声强(1 W/cm2、2 W/cm2、3 W/cm2)、辐照时间(1 min、5 min、10 min)以及不同剂量SonoVue(30μl、60μl、90μl).流式细胞仪和荧光显微镜检测肿瘤细胞内绿色荧光蛋白表达.结果 pEGFP在肿瘤组织内的表达随辐照时间、辐照声强、造影剂剂量的增加而增多,持续增加辐照时间、声强和造影剂剂量并不能有效增加其转染率,2 W/cm2[(21.02±1.45)%]、5 min(23.22±1.91)%]、60μl SonoVue[(21.02±1.45)%]时,pEGFP在肿瘤组织内的表达达到最大.结论 不同物理参数对体内基因转染率有明显影响,2 W/cm2、5 min、60μl SonoVue的参数条件下,可达到最佳剂量-效应关系.     

超声辐照声诺维与重组腺相关病毒经不同途径转染大鼠视网膜的实验研究

目的 探讨超声辐照微泡造影剂声诺维(SonoVue)能否增强rAAV2-EGFP转染视网膜的效率.方法 62只Wistar大鼠进行玻璃体腔(10只)及视网膜下(52只)注射.实验分组:病毒+生理盐水、病毒+微泡、病毒+生理盐水+超声辐照和病毒+微泡+超卢辐照.第4、7、35、49、120 d分别用荧光体视镜观察,利用软件进行定量分析,并进行组织切片光镜检查.结果 玻璃体腔注射组持续观察2个月未见荧光;视网膜下注射组的超声辐照微泡组在第4、7、35 d较其他组转染效率高,超声辐照微泡造影剂对眼底组织无明显损伤.结论 超声辐照SonoVue可在体内促进rAAV2-EGFP转染大鼠视网膜.     

Ultrasound-targeted microbubble destruction enhances naked plasmid DNA transfection in rabbit Achilles tendons in vivo

The study was to investigate the probability of increasing the transfection of the gene in tendons by ultrasound-targeted microbubble destruction (UTMD), and to search for the most suitable transfection conditions. A mixture of microbubbles and enhanced green fluorescent protein (EGFP) plasmids was injected into rabbit Achilles tendons by different administration routes and the tendons were ultrasound pulse by different ultrasonic conditions in order to determine the most appropriate conditions. Then, the rabbits were divided into four groups: (1) ultrasound + microbubbles + plasmid; (2) ultrasound+ plasmid; (3) microbubble + plasmid; (4) plasmid only. EGFP expression in the tendons and other tissues, and the damage to tendon and paratenon were all observed. The results showed that EGFP expression in the tendon was higher by ultrasound pulse with 2 W cm(-2) of output intensity and a 20% duty cycle for 10 min. Local injection was determined to be the better administration route. Among the four groups, EGFP expression in Group 1 was higher than that in other groups. EGFP expression was highest on seventh day, then it gradually decrease over time, and lasted more than 56 days. EGFP expression was not found in other tissues. There was no obvious injury caused by UTMD. Under suitable conditions, it is feasible to use UTMD as a safe and effective gene transfection therapy for tendon injuries.     

脉冲超声辐照微泡增强脂质体介导基因转染的体外实验研究

目的 探讨脉冲超声辐照微泡超声造影剂提高脂质体介导增强型绿色荧光蛋白质粒在肝癌,细胞(HepG2)中转染率的可行性.方法 将HepG2接种在24孔板中,随机分为以下6组:①空白对照组;②质粒+脂质体组;③超声+质粒组;④超声+质粒+微泡组;⑤超声+质粒+脂质体组;⑥超声+质粒+脂质体+微泡组.荧光显微镜及流式细胞仪检测增强型绿色荧光蛋白表达及转染效率;MTT法检测此转染方法对HepG2生长活性的影响.结果 超声+质粒+脂质体组的转染效率最高,并对细胞活性无明显影响;而超声+质粒+脂质体+微泡组转染效率与超声+质粒+脂质体组比较差异无统计学意义(P＞0.05),但细胞活性与空白组比较差异有统计学意义(P＜0.05).结论 脉冲超声辐照可介导基因转染,并能提高脂质体基因转染效率.同时,在一定条件下,超声微泡造影剂可提高超声介导基因转染效率,此方法可为基因转染提供新的思路.     

超声联合微泡对不同细胞周期血管平滑肌细胞增殖和凋亡的影响

目的 探讨超声联合微泡对不同细胞周期血管平滑肌细胞(VSMCs)增殖和凋亡的影响.方法 组织贴块法培养大鼠胸主动脉VSMCs,采用血清饥饿法和胸苷双阻断法使细胞同步化, 并用流式细胞仪分析同步化结果.以频率1 MHz、声强0.3 W/cm2的连续波超声联合脂质微泡辐照不同细胞周期的VSMCs 120 s,分别用噻唑蓝(MTT)比色法、流式细胞仪AnnexinV/PI染色、免疫细胞化学技术检测VSMCs的增殖、凋亡和增殖细胞核抗原(PCNA)表达.结果 成功获得同步化的G0/G1期和S期VSMCs,其同步化率分别为89.53%和66.87%.超声联合微泡可显著抑制S期细胞的增殖并下调PCNA蛋白表达,对G0/G1期细胞的增殖和PCNA表达无明显影响;G0/G1期和S期细胞的凋亡率均较辐照前增高,且对于S期细胞超声联合微泡诱导凋亡的作用更为显著.结论 超声联合微泡对处于增殖状态的VSMCs具有显著的抑制增殖和诱导凋亡的作用.     

低频超声联合微泡影响前列腺癌DU145细胞血管内皮细胞生长因子表达的实验研究

目的探讨低频超声联合微泡对前列腺癌DUl45细胞血管内皮细胞生长因子（VEGF）表达的影响。方法体外培养前列腺癌DUl45细胞,细胞呈对数生长时分为4组进行实验：对照组（细胞悬液1ml）、单纯微泡组（800μl细胞悬液加入200μl微泡剂SonoVue）、单纯低频超声组（1ml细胞悬液以频率80kHz、声强0．45W／cm2超声辐照30S）、低频超声联合微泡组（800μl细胞悬液加入200μl微泡剂SonoVue后立即以频率80kHz、声强0．45W／cm2超声辐照30s）。MTT法检测细胞存活率,流式细胞术检测凋亡率,Western印迹法检测细胞VEGF蛋白的表达。采用单因素方差分析比较对照组、单纯微泡组、单纯低频超声组、低频超声联合微泡组细胞存活率、凋亡率、VEGF蛋白表达量差异,进一步组间两两比较采用SNK-q检验。结果对照组、单纯微泡组、单纯低频超声组、低频超声联合微泡组细胞存活率分别为100％、（96．50±12．49）％、（93．20±5.31）％、（81．30±9．32）％;凋亡率分别为（1．10±0．26）％、（1．78±0．63）％、（5．85±0．45）％、（9．36±0．90）％;VEGF蛋白表达量分别为0．81±0．05、0．79±0．06、0．58±0．04、0．38±0．05。单纯微泡组、单纯低频超声组细胞存活率与对照组比较差异均无统计学意义,低频超声联合微泡组细胞存活率较对照组降低,且差异有统计学意义（q=5．88,P〈0．05）。单纯微泡组细胞凋亡率、VEGF蛋白表达量与对照组比较差异均无统计学意义;单纯低频超声组、低频超声联合微泡组细胞凋亡率均高于对照组,VEGF蛋白表达量均低于对照组,且差异均有统计学意义（q=14．09、24．51、8．06、14．89,P均〈0．05）。低频超声联合微泡组细胞凋亡率高于而VEGF蛋白表达量低于单纯低频超声组,且差异亦均有统计学意义（q=10．42、6．83,P均〈0．05）。结论微泡能增强低频超声抑制前列腺癌DUl45细胞增殖及促进凋亡,其机制可能与其下调前列腺癌DUl45细胞VEGF表达有关。     

超声辐照脂质膜微泡对血管平滑肌细胞骨架组装的影响

目的 探讨超声辐照脂质膜微泡对血管平滑肌细胞骨架组装的影响.方法 体外培养大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞(VSMCs),采用免疫荧光和荧光细胞化学技术.观察血小板衍生生长因子-BB(PDGF-BB)对VSMCs骨架(微丝、微管和中间丝)组装的影响,以及频率1 MHz、声强0.3 W/cm2的连续波超声联合脂质膜微泡辐照VSMCs 120 s后上述结构的变化.结果 与对照组相比,PDGF-BB组细胞内F-肌动蛋白表达增多,形成应力纤维,呈束状平行排列,贯穿VSMCs长轴,微管蛋白和中间丝蛋白的表达和分布无明显变化;超声辐照微泡作用VSMCs后,细胞内F-肌动蛋白、β-微管蛋白和中间丝蛋白表达均较PDGF-BB组减少,并重新分布.结论 超声辐照脂质膜微泡可明显改变体外培养的VSMCs骨架结构.