CK2β促进PINK1S自我磷酸化

本研究旨在探究PTEN诱导激酶1短亚型(PINK1S)在细胞质中激酶活性调节机制。首先,通过免疫共沉淀筛选的方法证明PINK1S能够和酪蛋白激酶2(CK2)蛋白复合体中的β亚基(CK2β)相互结合,但不与其他两个催化亚基α1(CK2α1)和α2(CK2α2)结合。其次,同时过表达CK2β和PINK1S,利用免疫共沉淀的方法纯化PINK1S,将得到的PINK1S用生物素标记的磷酸化蛋白检测标签(Phos-tagTM Biotin)检测其磷酸化水平,发现CK2β能够促进PINK1S的自我磷酸化。最后,利用RNA干扰技术,建立干扰CK2β的细胞株;在对照组和干扰CK2β的实验组细胞内表达PINK1S,发现缺少CK2β表达导致PINK1S的磷酸化水平降低。本文研究表明:CK2β作为胞质PINK1S自我磷酸化的辅助亚基,对其活性起到正调节作用。     

NLS-RARα通过与importin α1/β1(KPNA2/KPNB1)结合入核并抑制U937细胞分化

目的探究核定位信号-维甲酸受体α(NLS-RARα)异常的核定位对细胞分化的抑制作用以及其核转运机制。方法过表达带有血凝素(HA)标签的NLS-RARα慢病毒和空载体慢病毒转染HEK293T细胞和U937细胞,设为NLS-RARα过表达组(NR组)和阴性对照组(NC组)。提取HEK293T细胞与U937细胞NC组和NR组细胞核和细胞质蛋白,Western blot法检测NLS-RARα的定位。同时采用免疫荧光细胞化学染色检测NLS-RARα的定位情况。1α,25-二羟维生素D3(1,25D3)诱导U937细胞分化,实时定量PCR,Western blot法检测细胞CD11b、 CCAAT/增强子结合蛋白β(CEBPβ)在mRNA和蛋白水平,采用质谱和免疫共沉淀技术(CoIP)筛选与NLS-RARα相作用的转运蛋白,并且通过小干扰RNA(siRNA)转染验证其对NLS-RARα的核定位作用。结果 NLS-RARα主要位于细胞核中。与对照组相比,过表达NLS-RARα组CD11b和CEBPβ的增加减少,说明NLS-RARα对1,25D3诱导的细胞分化有抑制作用。质谱和CoIP结果发现核转运蛋白α2/输入蛋白α1(KPNA2/importinα1)和核转运蛋白β1/输入蛋白β1(KPNB1/importinβ1)与NLS-RARα有相互作用,敲低KPNA2/KPNB1则抑制NLS-RARα入核。结论 NLS-RARα通过结合KPNA2/KPNB1入核,抑制U937细胞分化。     

PINK1与糖代谢相关的研究进展

同源性磷酸酶张力蛋白诱导的激酶1[phosphatase and tensin homologue (PTEN)-induced putative kinase 1,PINK1]是与帕金森相关的一种蛋白激酶,同线粒体功能密切相关。有研究表明,PINK1可能与肥胖、2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)有关,在调节胰岛β细胞功能中有一定作用,某些治疗T2DM药物也参与PINK1途径调节。本文就近年关于PINK1与糖代谢相关研究进行综述。     

IKKα、β、ε及TBK1在CD154诱导转录因子NF-κB活化中的作用

目的 研究IκB上游激酶IKK在CD40配体CD154诱导NF-κB活化中的作用机制以及与构架蛋白TRAF的相关性。方法 应用重组CD154刺激EBV／LMP1阴性Ramos B细胞，研究IKK质粒转染表达对NF-κB Iuciferase活化的影响，并通过IKK免疫复合物激酶试验测定IKK对GST-IκB-α磷酸化活性以及免疫共沉淀试验判断IKK与TRAF的相互关系。结果 IKKα/β、IKKε和TBK1活性在CD154刺激5～15min内达到高峰；抗IKKα磁珠可以免疫共沉淀IKKβ，反之亦然。而抗IKKε或TBK1磁珠不能共沉淀其他3种IKK；CD154刺激诱导TRAF2与IKKε和TBK1，TRAF5与TBK1共沉淀增加，而TANK与TBK1共沉淀减少。IKKα或IKK43并不与TANK或任何TRAF共沉淀。结论 CD154刺激诱导IKKα、β、ε及TBK1活化，并诱导TRAF2与IKKε和TBK1结合，TRAF5与TBK1结合，而TANK与TBK1逐渐解离。IKKα/β激酶复合物位于IKKE和TBK1的下游。     

鸡Ⅰ类抗原递呈分子亚单位与恒定链的细胞定位及相互关系研究

目的:研究鸡Ⅰ类抗原递呈分子亚单位和鸡恒定链的细胞定位及相互关系。方法:RT-PCR获得鸡MHCⅠ类分子α、β2m亚单位,并进一步构建了能表达红色和绿色荧光蛋白的α、β2m亚单位的真核表达载体,利用脂质体介导法与能表达增强型绿色荧光的Ii真核表达载体共转染COS-7细胞,荧光显微镜检测Ii与MHCⅠ亚单位的细胞定位,并通过免疫共沉淀进一步研究它们之间的相互关系。结果:GFP-Ii与MHCⅠα-RFP、MHCⅠβ2m-RFP在细胞中共表达后出现共定位现象,且共定位于细胞的内膜系统;免疫共沉淀结果显示,只有当GFP-Ii链与MHCⅠα-GFP、MHCⅠβ2m-GFP三者共转染后,才可以检测到MHCⅠα-GFP、MHCⅠβ2m-GFP的表达。结论:鸡Ii与单个的MHCⅠα、MHCⅠβ2m亚单位不能有效结合,Ii只有与完整的Ⅰ类抗原递呈分子才能够形成复合体,且共定位于细胞的内膜系统。     

右美托咪啶通过PINK1/Parkin信号通路调控线粒体自噬改善老年大鼠术后认知功能障碍

目的 探究右美托咪啶通过PINK1/Parkin信号通路调控线粒体自噬改善老年大鼠术后认知功能障碍的分子机制。方法 SPF级SD大鼠随机分为假手术组、模型组、右美托咪啶(40μg/kg)组、自噬抑制剂三甲基腺嘌呤(3-MA,100 mmol/L)组、右美托咪啶+3-MA组,每组8只。旷场和水迷宫实验检测大鼠认知能力;TUNEL染色检测大鼠海马神经元凋亡情况;透射电镜观察大鼠海马神经元自噬情况;Western blot检测各组大鼠脑组织PTEN诱导激酶1(PINK1)/帕金森病蛋白(Parkin)、自噬效应蛋白Beclin 1、微管轻链蛋白3B(LC3Ⅱ/Ⅰ)、线粒体自噬受体p62(p62)蛋白表达。结果 右美托咪啶显著改善老年大鼠术后认知功能,抑制神经元凋亡,改善线粒体结构,减少自噬小体数量,升高大鼠脑组织PINK1、Parkin、Beclin 1、LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表达水平,降低p62蛋白表达水平。而右美托咪定的上述改善作用均被3-MA减轻或抑制。结论 右美托咪啶通过激活PINK1/Parkin信号通路增强线粒体自噬改善老年大鼠术后认知功能障碍。     

微囊介导VE-Cad胞吞参与了LPS作用后血管通透性增高的形成

目的:观察脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)作用后微囊介导的血管内皮钙黏蛋白(vascular endothelial cadherin,VE-Cad)胞吞,及其在血管通透性增高中的作用。方法:采用人血管内皮细胞株CRL-2922,以及免疫组化、免疫印迹、免疫共沉淀等技术方法,观察LPS处理后不同时点细胞质膜微囊重要结构蛋白小窝蛋白1(caveolin-1,Cav1)的蛋白表达和磷酸化,Cav1与VE-Cad的共沉淀和共定位,以及微囊抑制剂对LPS处理后Cav1与VE-Cad的共沉淀、VE-Cad质膜表达和单层细胞通透性的影响。结果:(1)LPS处理后Cav1蛋白表达无显著变化,但其Tyr14位点的磷酸化水平逐渐增高(P0.05),Cav1与VE-Cad的免疫共沉淀逐渐增多(P0.05),免疫组化激光共聚焦显微镜观察在4 h时可见明显的共定位;(2)细胞质膜微囊抑制剂非律平(5 mg/L)可以显著减少LPS处理4 h Cav1与VE-Cad的免疫共沉淀(P0.05),增强VE-Cad的质膜表达(P0.05),改善单层细胞通透性(P0.05)。结论:细胞质膜微囊介导VE-Cad胞吞参与了LPS作用后血管通透性增高的形成。     

PINK1/Parkin介导的线粒体自噬在缺血性脑卒中的作用研究进展

PTEN诱导推定激酶1(PINK1)/人帕金森蛋白2(Parkin)介导的线粒体自噬过程作为线粒体质量控制的关键机制之一，与缺血性脑卒中的凋亡、氧化应激及炎症反应等病理机制密切相关，极大地影响着该病的发生发展过程。本文将对PINK1、Parkin蛋白的结构与功能、该通路介导的线粒体自噬在缺血性脑卒中的作用展开综述，并分析其作为治疗缺血性脑卒中新靶点的优势。     

脑损伤模型大鼠Pink1/Parkin介导的线粒体自噬作用

背景:哺乳动物中除了FUNDC1、Bnip3与Nix为与低氧环境联系紧密的线粒体自噬路径,介导脑损伤线粒体主要自噬路径为Pink1/Parkin,PINK1在Parkin的上游,Pink1/Parkin路径介导受损线粒体表层功能蛋白或者结构多聚泛素化,同时当做自噬体选择包括标志,在细胞自噬依赖去极化线粒体降解中有重要影响。目的:分析Pink1/Parkin介导的线粒体自噬在高血压脑出血后脑损伤中的作用。方法:实验方案经川北医学院动物实验伦理委员会批准。选取SPF级Wistar雄性大鼠45只,随机数字表法分为正常组、模型组和自噬抑制剂组。模型组和自噬抑制剂组制备高血压脑出血模型,造模前自噬抑制剂组大鼠将2μL溶有三甲基腺嘌呤(3MA,100 mmol/L)的PBS由腹腔注射,模型组和正常组大鼠2μL PBS腹腔注射。检测各组大鼠脑组织含水量、线粒体自噬、线粒体膜电位、脑梗死灶、线粒体LC3、Parkin蛋白和脑组织细胞内PINK1蛋白表达。结果与结论:①和正常组相比,模型组大鼠自噬染色、线粒体染色表达升高,共定位阳性细胞数量升高;和模型组相比,自噬抑制剂组大鼠自噬染色、线粒体染色表达降低,共定位阳性细胞数量降低(均P<0.05);②和正常组相比,模型组大鼠脑组织梗死比例升高;和模型组相比,自噬抑制剂组大鼠脑组织梗死比例升高(均P<0.05);③和正常组相比,模型组大鼠线粒体染色强度降低,自噬染色强度增加;和模型组相比,自噬抑制剂组大鼠线粒体染色强度降低,自噬染色强度增加(均P<0.05);④和正常组相比,模型组大鼠PINK1、LC3、Parkin蛋白表达量升高;和模型组相比,自噬抑制剂组大鼠PINK1、LC3、Parkin蛋白表达量降低(均P<0.05);⑤结果提示,线粒体自噬可缓解高血压脑出血后脑损伤程度,Pink1/Parkin通路在线粒体自噬中有重要作用。     

PES1对雌激素受体转录活性的调节作用

目的 探讨PES1与雌激素受体(ER)的相互作用及其对ER转录活性的影响.方法 将体外翻译的PES1与纯化的GST-ERα和GST-ERβ蛋白分别混合,用GST pull-down验证在体外PES1与ERα和ERβ是否存在相互作用.将HA-PES1与FLAG-ERα或FLAGC-ERβ共转染293T细胞后进行免疫共沉淀,以验证PES1与ER是否在体内有相互作用.用含雌激素受体作用元件的荧光素酶报告基因检测PES1对ERα和ERβ转录活性的影响.结果 PES1与ERα、ERβ在体内外均存在相互作用,而且PES1与ERα的结合比与ERβ的强.在体内,在雌激素(E2)存在下,E2可以增强PES1与ERα的结合,而对PES1与ERβ的结合没有明显影响.PES1对ER转录活性的影响是E2依赖性的,PES1能升高ERα的转录活性而降低ERβ的转录活性(P＜0.01).结论 PES1是一种新的ER共调节因子,能反向调节ERα和ERβ的转录活性,需要进一步研究的是其在ER信号通路以及在E2诱发的肿瘤发生发展中的作用.     

PINK1参与调节多巴胺的合成

 [摘要] 目的：探讨PINK1基因对多巴胺合成的调节作用。方法：用高压液相色谱（HPLC）电化学方法检测多巴胺(Dopamine,DA)含量,用蛋白印迹法(Western blots)和Real-Time PCR法检测DA合成限速酶酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase, TH)和多巴脱羧酶(dopa decarboxylase, DDC)的表达量,通过免疫共沉淀(Co-immunopricipitation, Co-IP)和免疫组织染色的方法观察PINK1和TH之间是否存在相互作用。结果：PINK1基因敲减后,细胞内DA水平为5.356±0.536ng/ml显著低于对照组的11.63±1.559ng/ml(p<0.05),TH mRNA和蛋白的表达分别为0.3713±0.1403 和0.1956 ±0.06212,显著低于control组的1.009±0.1528和0.3861±0.04455(p<0.05), DDC mRNA和蛋白的表达分别为0.3963±0.1241和0.1492 ±0.02940,显著低于control组的1.100±0.07042和0.3231±0.03758(p<0.05);免疫荧光化学检测PINK1和TH存在共定位,Co-IP显示PINK1和TH存在相互作用。结论：PINK1可以通过调控DA的合成酶TH和DDC的表达影响DA的合成。     

磷酸酶及张力蛋白同源物诱导的蛋白激酶1/Parkin介导的线粒体自噬的研究进展

磷酸酶及张力蛋白同源物诱导的蛋白激酶(PINK1)/Parkin介导的线粒体自噬在多种疾病的发生发展中起到了重要作用.对PINK1/Parkin介导的线粒体自噬进行研究,包括PINK1和Parkin的生物学特性及PINK1/Parkin介导的线粒体自噬的生物学作用,希望将来人类通过对线粒体自噬的调控来治疗临床疾病有所提示.     

小泛素样修饰蛋白对α-突触核蛋白线粒体亚细胞定位及α-突触核蛋白经泛素系统降解的影响

目的 探讨α-突触核蛋白(α-synuclein)的小泛素样修饰蛋白1(small ubiquitin-like modifier1,SUMO-1)化修饰对α-synuclein蛋白亚细胞线粒体定位及α-synuelein蛋白经泛素系统降解的影响.方法 构建野生型、A53T突变型和缺失SUMO-1互作氨基酸的K96R突变型α-synuclein真核表达质粒.将野生型、A53T突变型和K96R突变型α-synuclein真核表达质粒分别转染HEK293细胞;在转染后48 h通过应用线粒体染色剂和激光共聚焦技术,观察野生型、A53T突变型及缺失SUMO-1修饰的α-synuclein蛋白的亚细胞线粒体定位和蛋白聚集情况.在转染后48 h应用anti-ubiquitin抗体进行Western印迹分析,明确野生型、A53T突变型及缺失SUMO-1修饰的α-synuclein蛋白泛素化程度有无差别.结果 将构建所得EGFP-α-synuclein-WT、EGFP-α-synuclein-A53T、EGFP-α-synuclein-K96R真核表达质粒经双酶切鉴定及DNA测序证实;激光共聚焦结果显示野生型、A53T突变型、K96R突变型α-synuclein蛋白均广泛分布于细胞质和细胞核中,以细胞质为主,野生型、A53T型细胞可见绿色荧光物质在胞质积聚,形成强荧光斑块,K96R型胞质内绿色荧光物质聚集少;野生型、A53T突变型、K96R突变型α-synuclein均与线粒体存在共定位,A53T突变型、K96R突变型α-synuclein在SUMO-1修饰或缺失的情况下对α-synuclein蛋白的线粒体亚细胞定位无明显影响.Western印迹结果显示转染缺失SUMO-1互作氨基酸的K96R突变型α-synuclein真核表达质粒组的细胞泛素蛋白的含量与转染空质粒组相比无明显变化,转染野生型、A53T突变型α-synuclein真核表达质粒组HEK293细胞中泛素蛋白的含量减少.结论 α-synuclein基因过度表达及致病突变A53T对α-synuclein蛋白的线粒体亚细胞定位无明显影响;SUMO-1修饰对α-synuclein蛋白的线粒体亚细胞定位也无明显影响;SUMO-1对a-αsynuclein基因过度表达及A53T突变型α-synuclein细胞内泛素化蛋白数量产生影响.     

人胎盘滋养层细胞雌激素α,β受体免疫细胞化学研究

目的:探讨雌激素-α,β型受体（estrogen recoptor α,β）在人胎盘滋养层细胞的表达和定位。方法:采用细胞培养结合免疫细胞化学ABC法。结果:人胎盘及培养的人胎盘绒毛合体、细胞滋养层细胞均呈雌激素α,β受体免疫反应性,雌激素受体免疫反应阳性物质定位于胞核内,细胞质为阴性。结论:人胎盘滋养层细胞存在雌激素α,β受体,这为研究雌激素对人胎盘滋养层细胞的功能调控提供了形态学依据。     

线粒体膜间隙蛋白的转运机制

线粒体约含有1 000种左右的蛋白质,其中98%以上由核基因编码,在胞质核糖体上以前体形式合成之后再转运至线粒体,并通过各种分选机制定位至线粒体的各部分。线粒体膜间隙(interm embranespace,IMS)蛋白全部在细胞质中合成,这部分蛋白的转运机制与线粒体其他部分蛋白的转运相比有其特殊性。依据转运机制和能量来源不同可以将其分为3类:Ⅰ类蛋白含有一段双组份分选信号;Ⅱ类蛋白需要膜间隙的辅助因子协同折叠;Ⅲ类蛋白含有与膜相互作用的疏水面。     

α1A-肾上腺素受体与骨形成蛋白-1的相互作用研究

目的 :在α1-AR 3种亚型中 ,α1A-AR的效应最强、功能最广泛 ,但原因一直不明 ,有研究者认为“非G蛋白”可能是一种参与因素。方法 :本研究采用酵母双杂交方法 ,以α1A-AR的细胞内游离C末端 (32 2 - 4 6 6aa)作为诱饵 (bait) ,在酵母细胞中对预转化的人脑cDNA文库进行筛选。对筛选出的克隆进行测序 ,采用免疫共沉淀和免疫荧光等方法在HEK2 93细胞中进一步观察“非G蛋白”与α1A-AR相互作用。结果 :(1)在酵母双杂交实验中 (Y187酵母细胞 ) ,筛选出骨形成蛋白 1片段与α1A-AR细胞内游离C末端 (32 2 - 4 6 6aa)结合 ,但不与α1B-AR…     

熊果酸通过影响线粒体功能诱导TC-1肿瘤细胞自噬性死亡

目的探讨线粒体失能和线粒体自噬在熊果酸诱导TC-1癌细胞自噬相关性死亡中的作用。方法同一批TC-1癌细胞分成对照组和熊果酸(UA)处理组,通过透射电镜(TEM)观察以及PI染色标记死细胞;利用流式细胞术检测线粒体膜跨电位(Δψm)及细胞内ATP和ROS水平变化;分光光度法检测线粒体呼吸链复合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ的活性;利用吖啶橙(AO)染色来检测自噬;荧光显微镜下观察线粒体与自噬标志蛋白LC3的位置关系;Western blot法检测线粒体自噬相关蛋白PINK1和Nix表达;以及检测对照组和UA处理组在小鼠胚胎成纤维细胞(MEFs)和自噬缺乏(Atg5-/-)的MEFs中ROS水平变化。结果 UA 30μmol/L作用TC-1细胞6 h后,可见大量细胞的线粒体出现了显著异常;UA不仅降低线粒体膜电位和ATP水平(P0.05),而且抑制线粒体复合酶Ⅰ~Ⅳ的活性(P0.05),且均呈现时间与剂量依赖;UA还降低TC-1肿瘤细胞和小鼠胚胎成纤维细胞(MEFs)内的ROS水平,但是在自噬缺乏(Atg5-/-)的MEFs中ROS水平未受影响(P0.05);吖啶橙(AO)染色发现UA还可增加自噬溶酶体的数量,并呈剂量依赖;经UA处理的细胞,无论是自噬相关蛋白LC3与线粒体共定位,还是参与损伤线粒体清除的线粒体自噬相关蛋白PINK1和Nix均表达增高。结论 UA通过诱导线粒体自噬清除部分ROS并导致线粒体功能损伤;线粒体失能与线粒体自噬至少部分参与UA诱导的TC-1肿瘤细胞自噬性死亡。     

IL-8-CXCR1/2信号通路与卵巢上皮癌关系的研究进展

<正>CXCR1/2是一类G蛋白偶联受体,CXCR1主要与IL-8结合,而CXCR2可以与多种配体(IL-1~3,Gro-α,β,γ,IL-8)结合,在机体内CXCR1与CXCR2具有协同的作用~([1])。CXCR1/2在正常机体内主要表达于中性粒细胞表面,当有外来病原体入侵,在组织局部引起炎症反应,炎症组织释放IL-8等趋化因子,经血液循环与中性粒细胞表面的CXCR1/2结合,从而趋化中性粒细胞迁移至炎症发生部位吞噬和杀灭病原体~([2])。此外,IL-8-CXCR1/2信号通路     

全反式维甲酸通过降解核定位信号-视黄酸受体α促进人白血病细胞分化

目的研究全反式维甲酸(ATRA)对核定位信号-视黄酸受体α(NLS-RARα)过表达细胞分化的作用。方法用慢病毒在NB4细胞和U937细胞过表达NLS-RARα蛋白,用实时定量PCR检测NLS-RARα、 CD11b、 CCAAT增强子结合蛋白β(CEBPβ)的mRNA水平, Westernblot法检测NLS-RARα、 CD11b、 CEBPβ蛋白水平; ATRA处理后,用Western blot法检测细胞CD11b蛋白水平以及ATRA对NLS-RARα蛋白的降解情况;用改良Wright染色法观察细胞分化形态。结果慢病毒感染的NB4细胞和U937细胞过表达NLS-RARα蛋白,过表达NLS-RARα可下调细胞CD11b、 CEBPβ的表达水平; ATRA可以促进NLS-RARα过表达细胞的分化; ATRA可以降解NLS-RARα且呈时间浓度依赖性。结论 ATRA通过降解NLS-RARα促进白血病细胞的分化。