融合蛋白GST-PADI4可溶性表达条件的优化及纯化

目的优化融合蛋白GST-PADI4的可溶性表达条件,并对蛋白进行纯化。方法对融合蛋白GST-PADI4工程菌的诱导温度(16、20、25、30、37℃)、诱导剂IPTG浓度(0.05、0.1、0.2、0.5、1 mmol/L)、诱导时菌液A600值(0.2、0.4、0.6、0.8、1.0)、诱导时间(8、12、16、20、24 h)进行优化,分析融合蛋白GST-PADI4的可溶性表达情况;按优化的表达条件进行大量表达后,采用Sepharose 4B亲和层析柱对融合蛋白进行纯化。结果在16℃,菌液A600值约为0.4时,以0.1 mmol/L IPTG诱导12 h,融合蛋白GST-PADI4有较高的可溶性表达;纯化的融合蛋白纯度为91%。结论优化了融合蛋白GST-PADI4的可溶性表达条件,并获得了高纯度的可溶性融合蛋白,为后续研究PADI4蛋白的功能奠定了基础。     

重组人成纤维细胞生长因子-21的表达及纯化工艺的优化

目的优化重组人成纤维细胞生长因子-21(SUMO-rhFGF-21)融合表达工程菌的表达条件及目的蛋白纯化工艺。方法对工程菌的诱导温度、时间及诱导剂浓度进行优化,并进行罐发酵,对菌体裂解液进行离子交换层析、Ni离子亲和层析及分子筛层析等。纯化产物经SDS-PAGE和HPLC鉴定纯度。结果在诱导温度为37℃,诱导时间为4h,IPTG浓度为0.5mmol/L时,目的蛋白的表达量最高,达20.5%;罐发酵收菌量可达66g/L,目的蛋白的表达量达20.2%;纯化后的rhFGF-21纯度达96%以上。结论优化了rhFGF-21的表达条件及纯化工艺,为rhFGF-21用于新药开发奠定了基础。     

pH值和盐浓度对金属螯合亲和层析分离人胰高血糖素样肽-1融合蛋白的影响

目的探讨pH值和盐浓度对金属螯合亲和层析(Immobilized metal ion affinity chromatography,IMAC)分离含His-Tag标签的人胰高血糖素样肽-1(Glucagon-like peptide-1,GLP-1)融合蛋白的影响,并确定最佳洗脱条件。方法在0.50mol/L盐浓度条件下,分别取pH6.0、7.0、7.8和9.04种缓冲液进行咪唑梯度洗脱;在合适的pH值条件下,分别取氯化钠浓度0.25、0.50和0.75mol/L3种缓冲液进行咪唑梯度洗脱。分析在不同pH值及盐浓度条件下洗脱融合蛋白所需要的咪唑浓度及回收率。结果在所考察的pH值范围内,洗脱融合蛋白所需的咪唑浓度随洗脱液pH值的升高而逐渐降低,当洗脱液pH值为7.8时,融合蛋白的分离效果最佳,大部分杂蛋白被0～40mmol/L咪唑洗脱液去除且不含融合蛋白,而绝大部分融合蛋白在咪唑浓度达80～200mmol/L时被洗出,总回收率达(83.7±1.0)%,且比例较高;在此pH值条件下,氯化钠浓度达0.75mol/L,才会影响融合蛋白的回收率,氯化钠浓度为0.25或0.50mol/L的洗脱液洗出融合蛋白的效果相近;在pH7.8,含0.25mol/L氯化钠的洗脱体系下,用50mmol/L咪唑溶液洗脱杂蛋白,200mmol/L咪唑溶液洗脱融合蛋白,融合蛋白的回收率和比例分别可达(85.2±2.0)%和(80.5±1.0)%。结论在所考察的pH值和盐浓度范围内,提高洗脱液pH值和盐浓度均可降低洗脱融合蛋白需要的咪唑量,但也会降低融合蛋白的回收率。     

复合模式介质Capto core 700纯化轮状病毒

目的采用复合模式介质Capto core 700纯化轮状病毒(rotavirus,RV),去除培养液中的残余细胞宿主蛋白和DNA,提高病毒收率。方法将RV LH9毒种接种Vero细胞,制备RV原液,澄清、超滤后,用Capto core 700纯化:样品LH9、LH9+150 mmol/L Na Cl[以缓冲液A(20 mmol/L PB+150 mmol/L Na Cl,p H 7.0)作为缓冲液]上样纯化分别标记为A、B组合,样品LH9+300 mmol/L Na Cl[以缓冲液B(20mmol/L PB+300 mmol/L Na Cl,p H 7.0)作为缓冲液]上样纯化标记为C组合,样品LH9+450 mmol/L Na Cl[以缓冲液C(20 mmol/L PB+450 mmol/L Na Cl,p H 7.0)作为缓冲液]上样纯化标记为D组合,洗脱,收集流穿峰,检测纯化后病毒的滴度和收率、RV RNA、RV抗原性、残余宿主细胞蛋白(HCP)和DNA;并用初步筛选出的纯化组合纯化3批RV超滤浓缩液,检测各项指标,进行进一步验证。结果用20 mmol/L PB+150 mmol/L Na CL缓冲体系和样品中加入150 mmol/L Na Cl的组合纯化RV,病毒收率在80%以上,病毒核酸完整,其抗原性未发生改变,可去除94%以上的HCP,残余DNA符合《中国药典》三部(2010版)标准。结论 Capto core 700纯化RV收率和残余蛋白去除效率均较高,组合B操作相对简便,工艺时间短,病毒收率高,更适于RV的纯化。     

结核分枝杆菌ESAT6-CFP10融合蛋白的原核表达及其表达条件的优化

目的原核表达结核分枝杆菌(Mycobacterium tuber-culosis,MTB)ESAT6-CFP10融合蛋白(recombinant ESAT6-CFP10,rEC),并优化表达条件。方法以(GGGGS)3为linker将ESAT6和CFP10两个基因连接,合成rEC全基因,插入至载体pET-28a,构建重组质粒pET-28a-rEC,转化至感受态E. coli BL21(DE3),筛选优势菌株进行诱导表达,并对诱导温度(25、30、37℃)、诱导剂种类及浓度(0. 05、0. 1、0. 2、0. 5、1. 0 mmol/L IPTG及0. 5、1、5、10、15、20 g/L乳糖)、诱导时间(2、3、4、5、6 h)、诱导起始A600(0. 4、0. 6、0. 8、1. 0)进行优化。菌种经5 L发酵罐发酵培养后,采用亲和层析及离子交换层析纯化rEC融合蛋白,于-20℃分别储存0、2、4、6个月,12. 5%SDS-PAGE分析rEC融合蛋白,并对保存0、6月的样品进行HPLC-SEC分析。结果重组质粒pET-28a-rEC经双酶切及测序鉴定,构建正确。rEC融合蛋白最适诱导条件为:于30℃,以0. 1 mmol/L IPTG诱导4 h。纯化后rEC融合蛋白纯度达95%以上,且可与鼠抗ESAT6单克隆抗体发生特异性结合,于-20℃保存6个月未见蛋白降解及聚体产生。结论原核表达了rEC融合蛋白,并优化了其表达条件,获得的rEC融合蛋白具有较高纯度及稳定性。     

重组免疫毒素IL-6_(T23)-PE38KDEL在大肠杆菌中自诱导表达条件的优化

目的优化重组免疫毒素IL-6(T23)-PE38KDEL在大肠杆菌中的自诱导表达条件,以提高菌体浓度及可溶性目的蛋白的表达量。方法采用摇瓶培养,利用单因素和正交试验对工程菌自诱导的培养条件(接种量、诱导时间、诱导温度、装瓶量)和培养基组分(有机氮源、无机氮源、碳源、有机酸)进行优化,检测菌体浓度、可溶性目的蛋白的表达量及质粒稳定性。结果确定最适自诱导培养条件为装瓶量20 ml/250 ml、接种量2%,28℃诱导25 h;最适自诱导培养基组分为:蛋白胨2%、酵母浸粉0.5%、Na2HPO425 mmol/L、KH2PO425 mmol/L、硫酸铵25 mmol/L、葡萄糖0.05%、甘露醇1%、乳糖0.6%、苹果酸钠20 mmol/L、MgSO40.5 mmol/L。此时可溶性目的蛋白的表达量和菌体浓度分别为LB培养基(IPTG诱导)的1.76和2.12倍,质粒稳定性由87%提高至98%。结论优化了重组免疫毒素IL-6(T23)-PE38KDEL在大肠杆菌中的自诱导表达条件,为其工业化生产奠定了基础,也为自诱导在其他重组蛋白药物生产中的应用提供了参考。     

人溶菌酶-抗菌肽tachyplesins融合蛋白的原核表达及其抗菌活性

目的原核表达人溶菌酶(Human lysozyme,hLYZ)和抗菌肽tachyplesins融合蛋白,并检测其抗菌活性。方法人工合成抗菌肽tachyplesins基因和linker,与pMD18-T-hLYZ上切下的hLYZ基因融合,将融合基因克隆至带有GST标签的原核表达载体pGEX-4T-1上,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,并对表达条件进行优化。表达的融合蛋白经亲和层析纯化后,进行抗菌活性检测。结果重组表达质粒pGEX-4T-1-hLYZ-tachyplesins经PCR、双酶切及测序鉴定,证明构建正确;表达产物经SDS-PAGE分析,在相对分子质量约44000处可见目的蛋白条带,诱导温度在25℃,IPTG终浓度为0.8mmol/L,诱导时间为6h,融合蛋白表达效果较好,主要以可溶性形式存在;纯化的融合蛋白纯度可达90%以上,对金黄葡萄球菌和大肠杆菌具有一定的抑制作用。结论已成功在原核细胞中表达了人溶菌酶-抗菌肽tachyplesins融合蛋白,纯化的融合蛋白具有一定的抗菌活性。     

猪链球菌2型溶菌酶释放蛋白功能性片段的原核表达及其免疫保护性

目的表达猪链球菌2型(SS2)溶菌酶释放蛋白(MRP)的功能性片段(tmrp),并检测其对小鼠的免疫保护性。方法将构建的重组克隆载体pMD-tmrp经BamHⅠ、EcoRⅠ双酶切,将切下的目的基因tmrp亚克隆至原核表达载体pGEX-3X中,转化E.coliBL21(DE3),鉴定正确后,用IPTG诱导,谷胱甘肽亲和层析纯化GST-tmrp,免疫BALB/c小鼠,测定其免疫保护率。结果阳性工程菌经IPTG诱导,表达了可溶性目的蛋白,相对分子质量约为73000。0.8mmol/LIPTG,37℃,pH7.2诱导4h,表达量最高,为25.36%。经亲和层析纯化,融合蛋白纯度达93.7%。免疫BALB/c小鼠后,免疫保护率可达60%。结论已成功获得了具有免疫活性的GST-tmrp。     

一种铜锌超氧化物歧化酶突变体的原核表达、纯化及酶活性测定

目的原核表达、纯化一种铜锌超氧化物歧化酶(Cu,Zn-SOD)突变体,并检测其酶活性。方法将经热力学优化的Cu,Zn-SOD突变体基因亚克隆至pET-28a载体中,构建重组表达质粒SOD1-pET-28a,转化入大肠埃希菌BL21(DE3)中,IPTG诱导表达;在500 mL摇瓶培养条件下,通过改变加入Cu、Zn离子的量优化诱导表达条件;表达的重组蛋白经初步纯化后,测定酶活性。结果重组表达质粒SOD-pET-28a经双酶切及测序证明构建正确;表达的重组蛋白相对分子质量约为15 000,主要以可溶性形式表达;工程菌株在500 mL摇瓶培养条件下培养至10 h左右,A_(600)至3. 5左右时加入终浓度为0. 1 mmol/L IPTG、0. 2 mmol/L ZnCl_2、0. 5 mmol/L CuSO4,可获得最佳表达量(29. 2%);初步纯化获得的重组蛋白纯度为97. 32%,比活为5. 08×103U/mg。结论成功利用大肠埃希菌表达系统表达了一种经热力学优化的Cu,Zn-SOD突变体,初步纯化的突变体具有较好的酶活性,为进一步摸索大规模生产工艺及实际应用奠定了基础。     

重组戊型肝炎病毒抗原工程菌的发酵及表达产物的纯化

目的建立重组戊型肝炎病毒抗原工程菌的发酵和目的蛋白纯化工艺。方法在三角烧瓶中,探讨不同的诱导剂浓度和培养基对菌体密度和目的蛋白表达量的影响;在10L发酵罐中,探讨诱导时间、补料方式、溶氧量对菌体密度和目的蛋白表达量的影响。根据目的蛋白的理化特性建立纯化工艺。结果重组HEV抗原工程菌在10L发酵罐分批补料培养中,采用0·1mmol/L的IPTG诱导4h,目的蛋白表达量约为25%,目的蛋白产率约为2·88g/L,且以包涵体形式存在。经过对包涵体粗纯、复性、纯化,SDS-PAGE分析,纯度可达95%以上。结论建立了周期短、产率高且稳定可靠的发酵及纯化工艺,为重组HEV抗原的大规模生产奠定了基础。     

乙苯,苯乙烯的生产及合成乙苯,苯乙烯催化剂的研究进展

苯乙烯是重要的石油化工原料。本文介绍了国内外苯乙烯生产的发展概况，合成乙苯，苯乙烯所用的催化剂种类，并就苯乙烯生产及催化剂的发展趋势提出了自己的观点。     

Synthesis and characterization of homopolymers and copolymers of various acrylates and acrylonitrile

Various homopolymers and copolymers of methyl acrylate, ethyl acrylate, butyl acrylate, and acrylonitrile in different feed ratios were synthesized. These were characterized by IR, ¹³C-NMR, DSC, DTA, and TGA. Spectroscopic characterization helped in differentiating copolymers of different mol ratios. Thermal analysis revealed different degradation patterns for homopolymers and copolymers. The temperature and energy changes associated with various phase transitions were dependent on the chemical composition of homo- and copolymers, as expected. © 1993 John Wiley & Sons, Inc.     

生物质气化及生物质与煤共气化技术的研发与应用

总结了生物质原料的特点及生物质单独气化的缺点;介绍了国内外生物质气化技术及生物质与煤共气化技术的研发与应用现状;分析了在此领域国内外的发展趋势与前景;概括了开展生物质与煤共气化技术研发的意义。     

Comparison of the Adhesion and Cohesion of Triblock and Random Copolymers of Styrene and Butadiene

A substantially greater detachment energy is required to strip a polyethylene tereph-thalate (Mylar) film from a styrene-butadiene-styrene (SBS) triblock copolymer compared to that for peeling from a random styrene-butadiene (SBR) copolymer. This is true even though the intrinsic interaction between the Mylar and each elastomer is expected to be similar because of their virtually identical chemical composition. It is proposed that this difference in peel strength (between the SBS and SBR) is a consequence of the much higher dissipative capacity of the former elastomer. Another manifestation of this is the higher cohesive tear strength of the SBS compared to the SBR. Extents of energy dissipation within each elastomer during detachment of the Mylar adherend are consistent with the hypothesis that the average maximum stress experience before detachment is some similar fraction of each elastomer's tensile strength.     

责任和责任心的涵义与结构

责任是人应主动承担的角色义务和对其因过失所造成后果应承担的责罚.有两层涵义:一是义务;二是后果.责任心是个体自觉做好分内事务和履行道德义务的心理倾向,是个性心理品质成分中自我特征维度上的重要内容.责任心具有两个方面的涵义:一是角色分内职责;二是角色道德义务.责任心是一种通过责任认知、责任个性和责任适应的动态形式表现出来的静态品质,责任心是责任心过程结构与责任心关系结构相互制约、相互影响的统一体.     

二甲基二烯丙基氯化铵和丙烯酰胺的合成及应用

用复合引发体系(过硫酸盐-偶氮类引发剂)和脂肪胺类氧化还原体系引发,在实验室获得了单体转化率≥98%,特性粘数高于13.6 dL/g的阳离子共聚物PDA,探讨了控制聚合物分子量的影响因素.     

Kinetics and Mechanism of Oxidation of Mono- and Polyacetals

Abstract

Kinetics and mechanisms of oxidation of 6 acetals by molecular oxygen and ozone in liquid phase have been studied. Reaction with molecular oxygen (70°C, 15–16 hr) leads to the formation monoethers of the corresponding glycols with 68–90% selectivity. Salts of metals and complexes with crown-ethers have increased the reaction rate significally. Ozone have reacted with acetals with formation similar products. The mechanisms of intermediate stages have been proposed.     

钾盐资源及钾肥供需情况分析及预测

阐述了国内外钾盐资源及钾肥生产现状,对国内外钾盐的供需形势进行了分析及预测,从资源、原材料、国际市场三方面提出了解决我国钾盐短缺的措施。     

Electronic structures and reactivities of monometallic and bimetallic clusters of Au and Cu

The variation of the Au 4f binding energy of Au clusters with the cluster size has been established by measuring the binding energies of clusters whose size distributions were independently determined by HREM and STM. The binding energy increases significantly when the cluster size is less than 2 nm. Au-Cu bimetallic clusters of the composition Cu₃Au have been deposited for the first time on carbon substrates. The shifts in the core level binding energies of the bimetallic clusters show the effect of alloying in the case of large clusters, but show effects of both alloying and cluster size in the case of the small clusters. The interaction of CO with Cu₃Au clusters is stronger than with a bulk Cu metal. The interaction of CO with small Cu clusters also seems to be stronger than with bulk Cu or with large Cu clusters.     

Wetting properties of homopolymers and copolymers of pentafluorostyrene and methylacrylate and homopolymer blends

Polypentafluorostyrene (PPFS), polymethylacrylate (PMA), and poly(pentafluorostyrene-co-methylacrylate), poly(PFS-co-MA) were prepared and the wetting characteristics of polymer blends of PPFS and PMA were compared with that of poly(PFS-co-MA) via contact angle measurements. The critical surface tension of polypentafluorostyrene was found to be 22.6 dyne/cm, which is comparable to the value reported for polytrifluoroethylene (22 dyne/cm). The critical surface tension of poly(PFS-co-MA) is not linearly related to its composition. The polymer blends of PPFS and PMA exhibit significant surface enrichment of the fluoropolymer. The harmonic-mean method¹ was employed to determine surface tensions of these polymers and many known polymers. It is found that the method produces useful surface tension data provided the contact angle values are derived from testing liquids of dissimilar polarity.