三七根腐病菌尖孢镰刀菌的Real-time PCR检测方法

为了建立一种准确、快速检测三七根腐病病原真菌尖孢镰刀菌的实时荧光定量PCR方法,基于尖孢镰刀菌脂肪酸ω-羟化酶基因设计了实时荧光定量PCR的特异性引物对Fo-QF和Fo-QR,制备了该基因的重组质粒标准品,建立了尖孢镰刀菌的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法。从三七种植区采集到14个具有根腐病、黑斑病典型症状的三七病株及三七种植土壤样品,并提取了这些样品的总DNA,运用本研究建立的荧光定量PCR方法进行了检测。结果显示,本研究建立的实时荧光定量PCR检测方法特异性强,脂肪酸ω-羟化酶基因只以尖孢镰刀菌DNA为模板扩增出特异的PCR产物。此外,该方法灵敏度高,检测模板浓度可低至0. 35 pg/μL。构建的荧光定量PCR标准曲线Ct值与模板浓度呈良好的线性关系,熔解曲线的吸收峰单一,扩增效率好。利用该定量检测体系,能从几种不同的三七病株中快速检测出携带尖孢镰刀菌的根腐病病株,从而达到准确诊断的目的。本方法不仅能明确三七种植土壤以及三七病株中尖孢镰刀菌数量的动态变化,并且可以为三七土壤处理、根腐病的早期诊断和动态监测以及带病三七种子、种苗的快速分子检测提供技术支持。     

水稻MOC1 mRNA TaqMan实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立

TA克隆构建含MOC1基因cDNA片段的重组质粒,作为TaqMan定量检测水稻分蘖基因MOC1 mRNA的标准品,建立了检测方法。采用RT—PCR。的方法,从水稻分蘖芽总RNA中逆转录扩增总cDNA,PCR扩增MOC1基因中设计的目的片段,将纯化的目的片段与pMD19-T Simple载体连接,转化宿主菌JM-109,提取重组质粒DNA,PCR鉴定并测序分析。纯化质粒并检测260nm吸光值,确定重组质粒原液的拷贝浓度并以此制备荧光定量PCR梯度浓度标准品。对重组质粒进行实时荧光定量PCR实验。建立了MOC1基因mRNA表达实时荧光定量PCR检测方法,特异性好,检测灵敏度达10^2拷贝,线性范围为10^2-10^7拷贝,阈值循环数与PCR体系中起始模板量的对数值之间有着良好的线性关系（r=0．999）,扩增效率高（E=92．8％）。成功建立了MOCI基因实时荧光PCR定量标准品,且TaqMan荧光定量RT—PCR的方法可对水稻分蘖基因MOC1 mRNA的表达进行准确定量。     

转基因水稻标准质粒分子的构建与分析

针对目前转基因(GM)产品检测标准分子的缺乏,构建适用于转基因水稻的标准质粒分子pMDSPS和pMDTheli,其中包含水稻内源基因SPS通用序列,耐盐基因ThST3和Ubiquitin启动子序列的构建特异性Theli序列。对其特异性及制备标准曲线的可靠性进行鉴定研究,研究结果显示,在进行普通PCR扩增时,采用质粒标准分子为阳性对照,均能特异扩增目的条带。以标准质粒分子构建的标准曲线,SPS基因的定量标准曲线的相关系数平均为0.9993,PCR扩增效率在1.0004~1.034之间;ThST3基因的定量标准曲线的相关系数平均为0.9937,PCR扩增效率在0.9358~0.9486之间。因此,构建的标准分子pMDSPS和pMDTheli既能作为普通PCR的阳性对照,也能用于定量标准曲线的构建,为转基因水稻的定量检测提供简便、价格低廉的标准分子打下基础。     

辣椒疫霉菌(Phytophthora capsici)实时荧光定量检测方法的研究

为建立快速准确的检测土壤中辣椒疫霉菌(Phytophthora capsici Leonian)的实时荧光定量体系的方法,根据辣椒疫霉菌保守的ITS序列设计的特异性荧光实时定量PCR的引物,通过对保守序列构建克隆文库,筛选阳性克隆子,制备用于实时荧光定量体系的标准品,从而构建优良的标准曲线。利用构建的标准曲线和优化的实时荧光定量体系对人工接种含梯度浓度的辣椒疫霉菌的土壤样品进行实时荧光定量PCR检测。辣椒疫霉菌荧光实时定量PCR检测体系的标准曲线的相关系数为R2=0.980,斜率为-3.295,扩增效率为101.1%,线性方程为Y=-3.295X+44.484,标准品的检测下限为1.000×102拷贝,带菌土壤的检测下限为1.236×103拷贝,约为4.887pg基因组DNA。经过土壤样品试验,得出标准曲线相关系数为0.9845,表明所建立的辣椒疫霉菌实时荧光定量PCR检测方法合理有效。     

蝴蝶兰(Phalaenopsis amabilis)miRNA荧光定量体系的优化

实时荧光定量PCR是目前验证基因表达量的首选方法之一,现也广泛应用于miRNA的表达量研究中,但在蝴蝶兰中尚未见报道。在实时荧光定量PCR检测miRNA体系中,cDNA模板浓度以及miRNA扩增引物长短和二级结构造成的退火温度的差异会直接影响PCR扩增效率,从而降低实验结果的可信度。针对该问题,本研究首次以蝴蝶兰miR858在花萼色斑与非色斑的差异表达为实例,通过对cDNA模板浓度以及退火温度的筛选,成功地优化了蝴蝶兰miRNA荧光定量体系。结果表明:蝴蝶兰miRNA858在退火温度65℃,与2μg RNA对应的模板cDNA进行10倍稀释后扩增结果最优。本研究为蝴蝶兰miRNA荧光定量PCR标准体系的构建提供了实验依据。     

禽脑脊髓炎病毒VP1基因植物表达载体的构建

以提取的禽脑脊髓炎病毒总RNA为模板,以P1和P2为引物,反转录为cDNA,再以cDNA为模板进行PCR扩增.将扩增产物克隆pMD18-T载体中,获得重组质粒pMD18-T-VP1,PstⅠ/BamHⅠ双酶切及PCR确认正确后,利用pMD18-T-VP1重组质粒为模板,以P3和P4为引物,经PCR扩增获得了大小约810 bp的产物.VP1基因和 pBI121植物表达载体用SmaⅠ和SacⅠ双酶切,经纯化后连接,再转化到EHA105农杆菌中,酶切和测序鉴定结果表明,成功地构建了重组质粒pBI121-VP1,为进一步利用转基因植物生产VP1蛋白奠定了基础.     

河北地区猪圆环病毒二型ORF2基因片段的克隆与原核表达

以PCV2 PK-15细胞毒提取的DNA为模板,用PCR扩增PCV20RF2基因的后部约600 bp片段;对PCR产物回收纯化后与载体pMD19-T进行连接、转化,经酶切和序列分析后亚克隆到原核表达载体pET-32a中,构建重组表达质粒pET-32a-ORF2,转入大肠埃希氏菌B121(DE3)中,以IPTG诱导表达,进行SDS-PAGE电泳和Western-Blotting分析.结果表明.重组表达质粒在大肠中所表达的融合蛋白相对分子量为40 kDa,Western-blotting分析表明该蛋白具有PCV2抗原性.     

猪LFA-1和CTLA-4实时荧光定量PCR检测方法的建立

摘要：【研究目的】建立猪LFA-1和CTLA-4实时荧光定量PCR检测方法。【方法】根据GenBank中核苷酸序列设计猪淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)和细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(CTLA-4)的特异性引物,经RT-PCR扩增、目的片段与载体连接转化以及重组质粒的鉴定,并对重组质粒标准品和样品cDNA进行检测,构建LFA-1和CTLA-4荧光定量RT-PCR标准曲线。【结果】以1×109~1×102拷贝/μL不同稀释水平的标准品进行荧光定量PCR扩增后,统计学分析显示标准品浓度的对数与Ct值之间存在良好的线性关系（LFA-1：RSq =0.992;CTLA-4：RSq =0.994）;样品检测显示LFA-1与CTLA-4引物的扩增曲线图和熔解曲线图的特异性。【结论】所构建的质粒标准品具有线性关系好、重复性好、敏感性高等特点,以及其引物在样品检测中的可应用性,为分析猪免疫细胞在感染病毒前后LFA-1和CTLA-4表达的变化以及评估猪体免疫功能,提供必要的技术平台。     

小反刍兽疫病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立

为了建立一种快速检测小反刍兽疫病毒的方法。根据Gen Bank中公布的PPRV Nigeria75/1株H基因序列设计2对引物,PCR扩增出1 830 bpH基因,构建标准质粒p MD-18-H。以标准质粒优化反应条件,建立了小反刍兽疫病毒H基因SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法。最优反应体系25μL:2×SYBR qPCR Mix 12. 5μL,模板DNA 1μL,特异引物各0. 2μL(0. 2μmol/L),DEPC H2O 10. 5μL;最佳反应条件:94℃2 min; 94℃5 s,57℃30 s,40个循环,Ct值与标准质粒模板浓度在3. 28×104～3. 28×10-2copies/μL 7个浓度梯度呈良好线性关系y=-2. 913x+36. 904,斜率为-2. 913,扩增效率120. 5%,相关系数R2=0. 994。建立的实时荧光定量PCR检测方法比普通PCR灵敏度高10 000倍,稳定性好,特异性强,对PPRV的准确诊断和定量检测具有重要意义。     

猪Th1/Th2型细胞因子重组质粒实时荧光定量PCR标准曲线的建立

依据GenBank登录的猪Th1型细胞因子(IL-2、IL-2、IFN-γ)、Th2型细胞因子(IL-4、IL-6、IL-10)的核苷酸序列设计特异性引物,经RT-PCR技术从猪外周血单个核细胞中扩增和克隆了上述因子的101 bp核苷酸片段.测序鉴定后,将重组质粒10倍系列稀释后作为标准模板,通过实时荧光定量PCR方法,建立了它们各自的标准曲线及直线回归方程.结果表明,该方法具有线性关系好,特异性、敏感性、重复性高等特点,为猪体内IL-2、IL-12、IFN-γ、IL-4、IL-6和IL-10的mRNA水平的定量检测,提供了必要的技术手段.     

无公害农产品标准化生产关键技术的研究

根据中国第三大岛——崇明生态环境质量及寒优湘晴、花椰菜、绿芦笋等特色农产品二大资源优势,运用HACCP理论,开展无公害标准化生产关键技术研究。一、开发应用专用配方肥技术,化肥用量处理区较对照区分别减少33.04%、38.90%、41.18%;二、开发应用生物源、植物源等无公害防治技术,农药用量处理区较对照区分别减少54.5%、51.8%、47.10%;三、生态（塑料覆盖避雨栽培）控制芦笋茎枯病技术,减少病害发生72.7～77.1%、病指减轻60.1～62.2%。根据制订的无公害标准化操作规程生产的三种农产品,产值分别比常规生产区增加1159.5～1344.0元/hm2、2130.0～2221.5元/hm2、57174.0～63202.5元/hm2,示范区新增经济效益432.32万元;产品经国家法定机构检测,重金属、亚硝酸盐、农药等20种有毒有害物质残留量低于无公害食品和绿色食品卫生标准。     

农村非正式组织的生存逻辑及其规范发展探析

农村非正式组织的存在形式多样,最具代表型的有宗族组织、宗教组织、农民自发维权组织和新型农村合作经济组织。这些非正式组织的生存能够极大满足农民生产、生活以及精神方面的多种需求,对于农村社会的稳定和农村经济的发展有着重要意义。依据不同非正式组织的特点,通过协调非正式组织与正式组织的关系、取缔非正式组织,规范和正视非正式组织的存在等措施来引导农村非正式组织的健康发展。     

色彩学在家蚕彩色茧丝研究中的应用

利用色素添加在家蚕的食物中生产彩色茧丝是一项创新技术。彩色茧丝的色彩与添加色素的种类、时期、浓度的大小有关。利用色彩三要素理论可以大大提高家蚕彩色茧丝的研究效率 ,减少工作量。利用色彩调和理论可以生产出更多色相的彩色茧丝。同时 ,该文又提出了在今后的研究中要建立家蚕彩色茧丝的色彩标准体系。     

农产品农药残留的标准、检测和降解技术的研究进展

概述了农产品中的农药残留标准现状、农药残留分析方法及存在问题和国内外降解农药残留研究的主要成果,介绍了当前国内外在农药残留分析中应用的固相萃取、微波辅助萃取及固相微萃取等样品前处理技术,以及在农药残留的降解脱除中应用的超声波清洗和电离辐射等物理方法、臭氧氧化技术和光降解等化学方法、细菌和真菌等微生物降解方法等,并针对我国的实际情况提出了今后农药残留研究的重点和方向。     

中国大豆品种熟期组划分的研究

根据北美13个熟期组大豆代表品种48份及我国各地地方品种256份在南京春播自然条件结合18小时长光照条件的试验,部分品种在石家庄、哈尔滨的春播试验,获得以下主要结果：(1)将我国大豆品种归属为相应的000～Ⅸ共12个熟期组,未发现熟期组Ⅹ品种;(2)按同一熟期组品种生育前期变异的地理分布,0～Ⅲ熟期组内各划分为秦岭淮河     

紫色叶用莴苣色泽参数及花色苷含量的相关研究

为获得目前紫色叶用莴苣的叶色相关数据,建立分级标准,利用色差仪及高效液相色谱仪对40个品种的叶用莴苣叶片颜色及花色苷含量进行测定,对数据进行相关分析,并建立分级系统。结果表明,根据色泽参数和花色苷的含量可将紫色叶用莴苣的分成绿色、浅紫色、中紫色、深紫色和特紫色5 个等级。据此建立了一个叶色分级标准,根据紫色部分在叶片分布特征可将紫色叶用莴苣分成裙边紫、渐变紫、全叶紫、花斑紫4 类。试验结果提供测量、评价叶片颜色性状的科学方法,有助于培育、筛选出外观品质优良的新品种。     

现代温室甜椒产品质量规格标准的制订与探讨

通过对现代化温室甜椒果实进行调查,探讨了现代温室甜椒产品的品质因子和分级标准,根据甜椒的品质特点和参考国内外等级标准的划分,对甜椒产品划分了2个等级和4个规格。其卫生指标符合国家所规定的绿色农产品指标要求,采用绿色食品卫生指标作为现代温室甜椒质量规格标准的引用标准。     

线上教学课程成绩评定体系在“食品标准与法规” 教学中的实践

为提高网络教学过程中“食品标准与法规”课程线上教学质量,探寻适合的线上教学方法,基于超星学习通平台和腾讯会议线上授课的现状,提出了一套“食品标准与法规”课程成绩评定体系,依据课前、课中和课后的多维度多组合评定平时成绩和过程成绩,并结合期末考试成绩作为课程的最终成绩。结果表明,线上教学成绩评定体系在教学过程中的实施效果显著,该成绩评定体系能有效促进学生在“食品标准与法规”课程中的自主学习行为,可为其他高校课程网络教学提供一定的参考。     

稻品种审定中品种的量化评价标准及其实例检验

阐述了稻(Oryza sativa L.)品种审定中品种的量化评价标准，涉及品种的评价分类和丰产性、适应性、抗逆性、稻米品质的评价方法、权重分配与评分规则。通过实例检验，表明了量化评价标准的可靠性。提出了进一步完善量化评价标准的建议。     

中国绿芦笋栽培研究进展

绿芦笋具有极高的营养和医疗保健价值,在国际市场十分畅销。近年来,中国绿芦笋栽培发展很快,但栽培技术尚有待提高。从品种、育苗技术、田间管理、设施栽培、病虫害防治、无公害标准化栽培等方面综述了中国绿芦笋的栽培现状和最新研究进展。通过无公害标准化栽培,实现高产、优质和高效益,是中国绿芦笋生产的发展方向。