我国鼠疫菌pYC质粒PCR检测分析

目的分析全国其他类型鼠疫菌是否存在pYC质粒。方法设计yd1和yd2两对引物通过PCR 进行检查。结果共检查全国11块疫源地18个生态型鼠疫菌802份DNA,其中云南6份、广西5份、贵州6 份扩增阳性,云南另外的163份和全国其他菌株扩增结果均为阴性。结论 yd1和yd2基因仅存在于贵州、广西的菌株和云南的部分菌株中,可作为具有pYC质粒鼠疫菌的PCR诊断和标识基因;全国其他类型鼠疫菌无 6×103(pYC)新质粒。     

广东省鼠疫静息期3种耶尔森氏菌鼠疫PCR检测

目的应用PCR试验对广东省3种耶尔森氏菌进行鼠疫的特异性基因检测。方法应用含内部对照PCR技术,以鼠疫菌特异基因fra、pla的2对引物进行PCR实验。结果假结核菌1株、11株小肠结肠炎菌O∶3、5株O∶9、1株中间型,结果全为阴性。结论该试验菌没有鼠疫菌的特异性基因fra、pla,可以进一步说明从1973～1986年雷州半岛用鼠疫IHA、RIHA从鼠类检出的阳性材料是特异的。     

鼠疫耶尔森菌pla抗原基因芯片检测法的验证

目的检验鼠疫耶尔森菌pla抗原基因芯片检测法的准确性。方法针对鼠疫耶尔森菌pPCP1质粒上pla抗原基因中保守性片段,设计合成探针,制备尼龙膜基因芯片,用于检测在镇赉国家级鼠疫监测点采集到的达乌尔黄鼠肺、肝、肾样本154份,然后用鼠疫caf1基因PCR扩增法复检基因芯片阳性样品。结果基因芯片共检测出18份样本呈阳性反应,而caf1基因PCR法却发现这些样品均为阴性。结论在鼠疫耶尔森菌pPCP1质粒上的pla抗原基因不易用于鼠疫耶尔森菌的特异性检测,该抗原可同其它特异性抗原联合应用,提高检测的准确性。     

双重PCR和RAPD技术在宁夏鼠疫菌鉴定中的应用研究

目的应用多重PCR和RAPD结合鼠疫常规检测方法对可疑鼠疫菌和自毙鼠脏器进行鉴定,应用多种实验室检测方法联合检测和鉴定鼠疫菌,为科学、快速、有效地判定鼠疫疫情提供实验室支持。方法采用双重PCR对2009年宁夏2个鼠间鼠疫监测点分离获得的可疑菌株和部分自毙鼠脏器进行目标基因fra和pla片段扩增,并利用RAPD技术对2个监测点分离获得的鼠疫菌进行随机引物扩增基因表征分析。结果共分离获得16株菌,所有菌株扩增出2条目标条带,分别为249 bp和456 bp。自毙鼠脾脏扩增出目标基因,肝脏扩增的目标基因条带较弱。RAPD显示所有菌株的扩增条带一致,表明此次分离得到的鼠疫菌株未发生变异。结论双重PCR可作为实验室快速诊断和迅速判定鼠疫疫情的有效方法,用RAPD法筛选的鼠疫菌扩增的随机引物可为确定宁夏分离鼠疫菌株的标识图谱提供参考。     

应用PCR方法检测鼠疫现场标本的研究

目的用PCR方法检测疑似鼠疫现场标本,以建立准确、简便和快速的诊断技术。方法对采自疫源地的自毙鼠标本用两种方法提取DNA,进行caf1、pla基因检测和染色体标识基因检测。结果 2份样本均能检测到caf1、pla基因(与Yersinia pestis caf1、pla基因序列比对同源性达到99%以上)和4个染色体标识基因ypo 2087、ypo 2090、ypo2094、ypo 2102,试剂盒提取方式敏感性高于煮沸法。结论优化模板提取方式、提高扩增效率、质粒和染色体多基因检测,可以提高鼠疫PCR诊断技术的检出率。     

应用PCR技术检测鼠疫菌及动物脏器的试验观察

为了探讨PCR技术在鼠疫监测中实际应用的可能性，本实验应用PCR技术和细菌培养同时检测了动物脏器、鼠疫强毒菌及对照菌，共149份，。两种方法结果基本一致，其中有4份培养阴性的实验感染免疫豚鼠脏器，PCR扩增出现鼠疫菌特异性DNA区带。结果表明，PCR技术用于鼠疫监测已成为可能。     

云南鼠疫菌pYC质粒来源的探索

目的检测鼠疫近缘菌中是否存在着与鼠疫菌pYC质粒相同的核苷酸序列。方法设计4对引物,其产物长度覆盖整个的pYC质粒序列,将产物设计为探针,对近40余种鼠疫近缘菌全部的DNA进行斑点杂交。结果除用来作为对照的、分离至云南的4株鼠疫菌斑点杂交呈阳性外,其他杂交结果均为阴性。结论目前发现该质粒只存在于某些鼠疫菌中,进一步证实了我们先前的猜测,说明该质粒不是从这些近缘菌进化而来,可能是从外界获得的。     

多重PCR快速鉴定鼠疫耶尔森氏菌

目的　建立鼠疫耶尔森氏菌多重PCR鉴定系统 ,用于鼠疫耶尔森氏菌的快速鉴定。方法　针对分别存在于pFra、pRst质粒上毒力基因caf1和pla ,以及一段 2 76bp染色体序列 3a分别设计引物。采用多重PCR技术 ,同时检测caf1、pla、3a三个靶序列。结果　应用该多重PCR反应体系 ,对我国鼠疫耶尔森氏菌 17个生态型及新发现的青海田鼠鼠疫疫源地菌株的多重PCR扩增结果表明 ,实验菌株中除 2株分别缺失pFra、pPst质粒而扩增出 2条产物带外 ,其余 5 2株均扩增出预期的 3条产物带 ,相关菌株均阴性 ,其检测灵敏度为 1× 10 -4ngDNA。 结论　该方法用于鼠疫耶尔森氏菌的鉴定简便、快捷 ,具有很高的特异性和敏感性 ,为鼠疫耶尔森氏菌的快速鉴定提供了有力手段     

荧光定量PCR快速检测鼠疫耶尔森氏菌的实验研究

目的　利用LightCycler建立一种简便、特异的荧光定量PCR检测方法 ,用于鼠疫耶尔森氏菌的快速检测。 方法　采用SYBRGreenI随机掺入法 ,以Roche试剂盒为标准 ,比较两公司的DNA聚合酶 ,用鼠疫菌 310 0 4建立荧光PCR反应体系 ;针对鼠疫耶尔森氏菌特异的染色体标识序列和质粒上F1抗原基因设计引物 ,检测其灵敏度和特异性 ,以盲测试验进行验证 ;在此基础上鉴定 2 75株鼠疫耶尔森氏菌 ,并测试该法检测脏器污染模拟标本的灵敏度。结果　建立以一个公司试剂为主较低成本的PCR反应体系 ;EV76的检测灵敏度可达每反应体系 1.6个菌 ;检测我国 18个生态型共计 2 75株鼠疫耶尔森氏菌及 2 8株非鼠疫菌株的PCR扩增结果表明 ,鼠疫菌株均出现特异的扩增结果 ,2 8株对照菌株均为阴性 ;肝、脾、肺模拟标本检测灵敏度可达每反应体系 4 0 0 0个菌。结论　该方法对于检测鼠疫耶尔森氏菌具有简便、快捷、高敏感性和特异性的特点 ,适用于鼠疫紧急疫情时的快速诊断和疫源地监测     

酶标鼠疫F1McAb在酶免疫染色法快速鉴定鼠疫菌中的应用

目的观察酶标鼠疫F1McAb在酶免疫染色法快速鉴定鼠疫菌中的应用效果.方法实验感染鼠疫强毒菌的病死小鼠和处死健康小鼠尸体,20℃以上室温放置,用鼠疫F1McAb酶免疫染色法检测,同时用细菌学检验方法分离鼠疫菌和反向血凝试验(RIHA)检测鼠疫F1抗原.结果直接培养仅从5d内的鼠尸分离检出鼠疫菌,阳性率为53.3%;动物实验检出鼠疫菌的最长时间为8d,阳性率为71.6%.存放13d内,酶免疫染色阳性率为99.1%,RIHA阳性率98.2%,用酶免疫染色法和RIHA检测健康动物腐败脏器全部阴性.以上方法检查鼠疫疫区自毙动物标本12份,酶免疫染色法阳性7份,RIHA阳性6份,动物实验阳性5份,直接培养未获得阳性结果.结论酶免疫染色法检查动物腐败脏器中的鼠疫菌具有较高的敏感性和特异性.     

2001-2009年全国鼠疫病原学及血清学检测结果分析

目的 分析2001-2009年全国鼠疫病原学和血清学检测结果及人间和动物间鼠疫疫情分布.方法 查阅2002-2010年全国鼠疫监测报告文献资料,对2001-2009年全国鼠疫病原学和血清学检测结果及疫情情况进行分析.结果 2001-2009年在贵州、广西、云南、青海、西藏、甘肃、内蒙古7个省(区)共分离出鼠疫菌2966株.其中,用鼠疫细菌学方法检测各种动物1 138 000只,分离出鼠疫菌1998株;检测媒介动物379 227组,分离出鼠疫菌927株;人体分离出鼠疫菌41株.用间接血凝试验(IHA)检测各种动物血清1 169 702份,判定动物IHA阳性血清3177份,人IHA阳性血清168份;用反向间接血凝试验(RIHA)检测各种动物材料53 323份,判定RIHA阳性材料500份.在12个类型的疫源地中,有9个类型的鼠疫自然疫源地发生和流行动物鼠疫,共分离出鼠疫菌2925株.判定2种动物、6种跳蚤为新的染疫动物和传播媒介;有6个省(区)的23个县(市、区)被判定为新的鼠疫疫源县.结论 2001-2009年我国动物鼠疫疫情仍然比较严重,有9个类型疫源地处在活跃状态.

Abstract：

Objective To describe the pathogenic and serological test results of the plague in China from 2001 to 2009, and human and animal plague distribution. Methods Through access to information of the plague surveillance report in China from 2002 to 2010, national plague pathogenic and serological test results and the epidemic situation were analyzed from 2001 to 2009. Results From 2001 to 2009, 2966 strains of Yersinia pestis were isolated in the seven provinces which were Guizhou, Guangxi, Yunnan, Qinghai, Tibet, Gansu and Inner Mongolia. Of these, 1 138 000 animals were detected by bacteriological method, 1998 strains of Yersinia pestis were isolated;379 227 groups of intermediary animals were detected, 927 strains of Yersinia pestis were isolated;41 strains of Yersinia pestis were isolated from human body. Animal serums of 1 169 702 were detected by indirect hemagglutination assay(IHA), of these 3177 animal serums were positive, 168 human serums were positive;53 323 animal samples were detected by reverse indirect hemagglutination assay(RIHA), of these 500 were positive. There were outbreak or epidemic of plague in 9 types of plague foci, 2925 strains of Yersinia pestis were isolated. Two animals and 6 fleas were judged as new reservoir and new vector. There were 23 counties of 6 provinces were judged as plague new natural foci counties. Conclusions The plague epidemic in China is still serious between 2001 and 2009. There are nine types of foci in the active state.     

胶体金免疫层析试纸条对云南鼠疫现场材料的检测

目的评价检测鼠疫抗原及抗体胶体金免疫层析试纸条(G ICA及RG ICA)对现场材料的检测效果。方法采用G ICA分别对采自云南省的607份血清标本(查鼠疫抗体)及572份鼠脏器标本(查鼠疫抗原)进行检测,同时以血凝试验(IHA及R IHA)与酶联试验(ELISA及F1-ELISA)作为对照。结果(1)在对607份血清标本的检测中,G ICA、IHA及ELISA三种方法的符合率中度,而G ICA的敏感性比IHA与ELISA分别高111%和90%;(2)在对572份鼠脏器标本的检测中,RG ICA、R IHA及F1-ELISA三种方法的符合率中度,而RG ICA的敏感性比R IHA与F1-ELISA分别高100%和14.3%。结论检测鼠疫的G ICA及RG ICA特异性强、灵敏度高、简便快速,有较大的推广应用价值。     

Molecular identification by "suicide PCR" of Yersinia pestis as the agent of medieval black death

Medieval Black Death is believed to have killed up to one-third of the Western European population during the 14th century. It was identified as plague at this time, but recently the causative organism was debated because no definitive evidence has been obtained to confirm the role of Yersinia pestis as the agent of plague. We obtained the teeth of a child and two adults from a 14th century grave in France, disrupted them to obtain the pulp, and applied the new "suicide PCR" protocol in which the primers are used only once. There were no positive controls: Neither Yersinia nor Yersinia DNA were introduced in the laboratory. A negative result is followed by a new test using other primers; a positive result is followed by sequencing. The second and third primer pair used, coding for a part of the pla gene, generated amplicons whose sequence confirmed that it was Y. pestis in 1 tooth from the child and 19/19 teeth from the adults. Negative controls were negative. Attempts to detect the putative alternative etiologic agents Bacillus anthracis and Rickettsia prowazekii failed. Suicide PCR avoids any risk of contamination as it uses a single-shot primer-its specificity is absolute. We believe that we can end the controversy: Medieval Black Death was plague.     

从动物和土壤中直接检测鼠疫耶尔森氏菌

目的　探讨用防污染的 PCR- EL ISA(U DPE)技术检测人为污染的土壤和感染的动物标本的可行性。方法　根据鼠疫耶尔森氏菌 Cafl和 Pla基因分别设计了 3条引物 ,组合成 3对引物 ,建立 U DPE检测技术。结果　利用该实验体系可以检出每克土壤中 10 0 0个鼠疫耶尔森氏菌的污染。比检测纯细菌的敏感性低 2 0 0倍 ,说明土壤中有抑制 PCR反应的因子。对 2 0只实验组动物 40份标本 (肝脏和脾脏 )的培养、U DPE和 PCR-电泳检测表明 ,3种方法的检出吻合率为 10 0 % ,均能从 40份标本中检出靶细菌 ,而用 3种方法检测对照组动物的 2 0份肝脏和脾脏均为阴性。结论　利用 UDPE技术可以被用于动物脏器中鼠疫耶尔森氏菌的检测     

陕西省鼠疫耶尔森菌差异区段分型及其流行病学特征分析

目的分析陕西省鼠疫耶尔森菌差异区段分型及流行病学特征。方法对分离自陕西省鼠疫疫区获得的48株鼠疫菌应用23个DFR(差异区段)和PMT1(质粒验证)PCR扩增,进行鼠疫菌DFR基因组分型及流行病学特征分析。结果相同年份,不同染疫动物、媒介蚤分离的鼠疫菌基因组型基本一致。陕西鼠疫耶尔森菌DFR基因组型有Genomovar11、17、20共3种。1987-1988年份、2000-2001年份DFR基因组型以Genomovar17为主,2006年份以Genomovar20为主。结论不同年份疫情主导的基因组型不同,随着时间的变化,鼠疫菌DFR基因组型从Genomovar17基因缺失微进化到Genomovar20。     

多重PCR检测方法在鼠疫监测中的应用

目的验证在鼠疫疫源地调查中应用多重PCR方法快速检测鼠疫菌的实用性。方法在14个省的17个鼠疫监测点采集标本2524份。选用针对鼠疫菌特异序列的引物,并加入内部对照模板,直接从鼠肝、脾等脏器标本中进行鼠疫核酸检测,与细菌分离培养结果相比较并进行统计学分析。结果两种检测方法的符合率为92.67%。PCR方法阳性检出率为10.38%,较细菌培养阳性检出率(4.48%)高(x~2=682.25,P<0.01)。结论多重PCR方法可应用于鼠疫监测中,比传统方法迅速、灵敏,但还有待于优化。     

胶体金免疫层析法检测鼠疫F1抗体技术的应用及效果评价

目的研究鼠疫胶体金免疫层析法(GICA)快速检测鼠疫F1抗体技术在鼠疫血清学诊断、监测及流行病学调查中的应用及效果评价。方法应用GICA、双抗原夹心酶联免疫吸附试验(DAgS-ELISA)和间接血球凝集试验(IHA)对比检测190份啮齿动物血清和11份鼠疫免疫血清中鼠疫F1抗体。结果190份动物血清IHA检测结果均为阴性:GICA检测出1份阳性血清,滴度1:10;DAgS-ELISA检测出3份阳性血清,滴度1:4( ) 2份和1:16( )1份。3种方法检测11份鼠疫免疫血清均为9份阳性,但GICA敏感性低于IHA和DAgS-ELISA (GICA与IHA:t=3．257,P<0．05;GICA与ELISA:t=3．625,P<0．01;IHA与ELISA:t=1.437,P>0．05)。201份血清检测结果,GICA与IHA总符合率99．50％,与DAgS-ELISA总符合率99．00％,3种方法检测结果差异无统计学意义(x2=0．5,P>0．05)。结论GICA检测鼠疫F1抗体敏感特异、简便快速,与DAgS-ELISA同样为鼠疫血清学快速诊断和鼠疫监测中有应用价值的检测技术。     

鼠疫耶尔森菌特异基因扩增引物应用于鼠疫菌的鉴定研究

目的研究一种快速鉴定鼠疫菌的PCR方法。方法选用针对鼠疫菌特异序列的6对引物进行PCR扩增,以其它近缘的肠道致病菌做对照,并测序比较鉴定。结果鼠疫菌均能扩出预期产物,而其他近缘的肠道致病菌菌株均不能扩出预期产物。结论这些引物具有较高的特异性,可迅速、有效地鉴定鼠疫菌,并与其它近缘的肠道致病菌相鉴别。     

检测鼠疫抗体胶体金免疫层析试纸条的研制

目的建立快速、简易的检测鼠疫F1抗体的胶体金免疫层析法(G ICA)。方法(1)采用胶体金颗粒标记纯化F1抗原,并将标记物喷于玻璃纤维;同时将纯化F1抗原喷线固定于硝酸纤维素膜上,用于F1抗体的捕捉;按常规组装成检测鼠疫抗体免疫层析试纸条。(2)采用该试纸条与血凝法对同一份兔抗F1抗体进行检测,以评价该试纸条的敏感性。(3)采用该试纸条对44株非鼠疫菌的免疫鼠血清进行检测,以评价该试纸条的特异性。(4)采用该试纸条、血凝法及ELISA对607份血清标本进行检测,以评价该试纸条对现场材料的检测效果。结果(1)该试纸条可在15 m in之内完成检测;(2)在敏感性上,该试纸条对同一份免疫兔血清的检测较血凝法高一个滴度;(3)对被试的44株所选菌株的免疫鼠血清的检测均为阴性;(4)在对607份血清标本的检测中,免疫层析试纸条、血凝及ELISA三种方法的符合率中度,而免疫层析试纸条的敏感性分别比血凝与ELISA高111%和90%。结论以纯化的鼠疫F1抗原为基础建立的G ICA检测鼠疫F1抗体的方法特异性强、灵敏度高、简便快速,无需特殊仪器设备,有较大的推广应用价值。     

鹤庆新发野鼠鼠疫疫源地中鼠疫噬菌体的分离及其裂解谱测定

目的 查明鹤庆新发野鼠鼠疫疫源地内是否存在鼠疫噬菌体,并对所离分鼠疫噬菌体进行形态鉴定及噬菌谱分析。方法 以鹤庆县马厂村为核心,选择5 km范围内的自然村为采样点,采用鼠铗法进行捕鼠,实验室中取鼠盲肠置入改良PBS中,采用双层平皿对样本进行筛选、纯化得到噬菌体,观察噬菌斑形态,电镜检查噬菌体形态,并在22 ℃、24 ℃、28 ℃及37 ℃对21株鼠疫菌与115株非鼠疫菌进行裂解特性分析。结果 采集的354份标本,分离到2株鼠疫噬菌体;2株噬菌体在高于24 ℃温度下可裂解鼠疫菌,低于24 ℃不能裂解鼠疫菌,而非鼠疫菌在4个温度下均不裂解;电镜形态检测2株噬菌体均属于肌尾噬菌体。结论 鹤庆新发野鼠疫疫源地内存在着鼠疫噬菌体,且所分鼠疫噬菌体只有在高于24 ℃时才裂解鼠疫菌,此特性与鼠疫菌在鹤庆县的长期存在相关,且两株噬菌体存在裂解谱较窄,特异性良好,可用于备用诊断噬菌体的筛选株。