按蚊中肠前酚氧化酶原与约氏疟原虫卵囊黑化的关系

目的　分析约氏疟原虫卵囊黑化期间按蚊中肠内前酚氧化酶原 (Prophenoloxidase ,PPO)的变化 ,探讨中肠PPO与疟原虫卵囊黑化的关系。　方法　解剖分离约氏疟原虫感染前和感染后 3、5、7、11和 15d斯氏与大劣按蚊中肠 ,匀浆后经SDS PAGE和转膜 ,以抗烟草天蛾PPO的抗体进行免疫印迹分析 ,并于感染后第 5d开始在镜下观察约氏疟原虫卵囊黑化情况 ,直至第 15d止。　结果　斯氏与大劣按蚊中肠在约氏疟原虫感染前和感染后的不同时期经免疫印迹均可检测到 1条分子质量约为 67ku的PPO阳性蛋白带 ,但感染后的PPO蛋白带比感染前明显增强 ,而且同时间点大劣按蚊中肠PPO蛋白带比斯氏按蚊明显 ,尤其在感染的后期大劣按蚊中肠PPO蛋白带明显比斯氏按蚊增强 ;在感染后 7d可见大劣按蚊中肠内发育的约氏疟原虫卵囊部分黑化 ,在 15d时可见疟原虫卵囊完全黑化。　结论　按蚊中肠PPO含量增加 ,尤其是长时间内维持在较高水平与约氏疟原虫卵囊黑化密切相关。     

大劣按蚊丝氨酸蛋白酶与疟原虫感染相关性研究

目的探讨大劣按蚊血淋巴中丝氨酸蛋白酶与约氏疟原虫感染的相关性。方法首先利用二维电泳分离感染约氏疟原虫的和吸食正常血的大劣按蚊血淋巴蛋白;然后进行Western blot,用丝氨酸蛋白酶抗体进行识别,并比较感染组与正常对照组间的区别;选择感染后不同时相点对大劣按蚊蚊胃和唾液腺进腺镜检,以观察蚊体内疟原虫情况。结果Western blot显示,正常对照组无阳性蛋白点,感染组有2个阳性蛋白点,分子质量单位分别为44ku和27ku,等电点分别为8.0和5.0;镜检显示,感染7d时可见卵囊颗粒样病变,11d时卵囊发育不同步且黑化明显,之后检出的卵囊数逐渐减少。蚊唾液腺内未见子孢子。结论大劣按蚊血淋巴中的丝氨酸蛋白酶与约氏疟原虫感染相关,可能参与蚊抗疟原虫感染的黑化包被反应。     

斯氏按蚊PPO1基因克隆及其与约氏疟原虫卵囊黑化关系的研究

目的克隆和分析斯氏按蚊前酚氧化酶基因与约氏疟原虫卵囊黑化关系. 方法 根据其他昆虫前酚氧化酶基因的保守氨基酸序列设计简并引物,以斯氏按蚊全蚊RNA为模板,进行RT-PCR扩增,PCR产物纯化,克隆入pUCm-T载体,测定插入片段序列,对序列进行BLAST检索和鉴定.根据序列设计相应基因的特异引物,然后分别从血淋巴细胞或中肠扩增目的基因,并进行不同食源条件下前酚氧化酶基因的半定量、原位核酸分子杂交定位及与约氏疟原虫卵囊黑化关系的分析. 结果 获得了1种斯氏按蚊血淋巴前酚氧化酶基因cDNA部分序列,即AsPPO1（600 bp）,分别与冈比亚按蚊PPO1和大劣按蚊PPO2基因很相似,其编码的氨基酸序列均包含PO保守的铜结合位点CuA（HHWHWHLVYP）序列.在中肠和血淋巴内也获得相同的目的基因片段,半定量分析显示约氏疟原虫感染或诱导卵囊黑化呈现之前的表达明显增强,原位核酸分子杂交技术也进一步证实血淋巴有AsPPO1 mRNA表达. 结论 AsPPO1很可能与疟原虫感染或约氏疟原虫卵囊黑化相关.     

斯氏按蚊PPO1基因克隆及其与约氏疟原虫卵囊黑化关系的研究

目的克隆和分析斯氏按蚊前酚氧化酶基因与约氏疟原虫卵囊黑化关系。方法根据其他昆虫前酚氧化酶基因的保守氨基酸序列设计简并引物,以斯氏按蚊全蚊RNA为模板,进行RT-PCR扩增,PCR产物纯化,克隆入pUCm-T载体,测定插入片段序列,对序列进行BLAST检索和鉴定。根据序列设计相应基因的特异引物,然后分别从血淋巴细胞或中肠扩增目的基因,并进行不同食源条件下前酚氧化酶基因的半定量、原位核酸分子杂交定位及与约氏疟原虫卵囊黑化关系的分析。结果获得了1种斯氏按蚊血淋巴前酚氧化酶基因cDNA部分序列,即AsPPO1(600bp),分别与冈比亚按蚊PPO1和大劣按蚊PPO2基因很相似,其编码的氨基酸序列均包含PO保守的铜结合位点CuA(HHWHWHLVYP)序列。在中肠和血淋巴内也获得相同的目的基因片段,半定量分析显示约氏疟原虫感染或诱导卵囊黑化呈现之前的表达明显增强,原位核酸分子杂交技术也进一步证实血淋巴有AsPPO1mRNA表达。结论As-PPO1很可能与疟原虫感染或约氏疟原虫卵囊黑化相关。     

按蚊血淋巴丝氨酸蛋白酶与疟原虫卵囊黑化关系研究

目的 探讨丝氨酸蛋白酶与疟原虫卵囊黑化的相互关系。方法 将斯氏按蚊分为吸糖水组、吸正常小白鼠血组、吸约氏疟原虫感染血组和吸硝喹糖水组，挤压法收集雌斯氏按蚊血淋巴，Bradford法检测血淋巴蛋白浓度，继而对血淋巴进行SDS-PAGE，电转移后检测丝氨酸蛋白酶的表达差异。结果 4组斯氏按蚊丝氨酸蛋白酶Western印迹均呈现两条带，分子质量分别约160和150ku，与吸糖水组比较，吸正常小白鼠血组丝氨酸蛋白酶表达稍高，而感染约氏疟原虫后斯氏按蚊血淋巴丝氨酸蛋白酶表达明显增强，感染第6d达高峰，之后表达下调，而硝喹诱导黑化后丝氨酸蛋白酶表达水平呈逐日下调趋势。结论 斯氏按蚊血淋巴丝氨酸蛋白酶参与了疟原虫卵囊黑化包被反应。     

斯氏按蚊血淋巴前酚氧化酶差异表达与疟原虫卵囊黑化关系的研究

目的　探讨斯氏按蚊血淋巴前酚氧化酶与疟原虫卵囊黑化的相互关系。方法　斯氏按蚊分吸糖水组、吸正常小白鼠血组、吸约氏疟原虫感染血组和吸硝喹糖水组 ,挤压法收集雌斯氏按蚊血淋巴 ,解剖后取吸硝喹糖水蚊第 1、2和 3天斯氏按蚊中肠 ,超声提取中肠蛋白 ,Bradford法检测血淋巴总蛋白浓度 ,继而对血淋巴和中肠蛋白进行SDS -PAGE ,Western印迹电转移后检测前酚氧化酶。结果　四组血淋巴前酚氧化酶和用药后中肠前酚氧化酶均呈现一条阳性蛋白带 ,分子量分别均约 6 6kDa,与吸糖水组比较 ,吸正常小白鼠血组血淋巴前酚氧化酶表达增强 ,而感染后血淋巴前酚氧化酶表显著增强。硝喹诱导黑化后血淋巴前酚氧化酶表达水平呈逐日下调趋势 ,而硝喹诱导黑化过程中中肠前酚氧化酶量逐渐增加。结论　斯氏按蚊血淋巴前酚氧化酶参与疟原虫卵囊黑化反应。     

大劣按蚊血细胞对约氏疟原虫卵囊黑化作用的观察

大劣按蚊感染约氏疟原虫后第５ｄ和第１５ｄ，电镜下分别观察退变的卵囊周围血细胞的反应。结果表明：感染后第５ｄ卵囊发育较小，卵囊周围即可见血细胞附着；第１５ｄ卵囊有些已明显空泡化，其外周可见较多血细胞，血细胞内、血细胞和卵囊之间、甚至卵囊内有许多微管结构之颗粒及其它颗粒，有些卵囊已黑化，其外周仍可见到血细胞的残骸及黑色素样颗粒。提示对约氏疟原虫不易感的大劣按蚊引起囊退变后可引致血细胞趋附，后者可释放颗粒物质或许还有其它物质，这对包被形成和卵囊黑化起着重要的作用。     

按蚊血淋巴丝氨酸蛋白酶与疟原虫卵囊黑化关系研究

目的　探讨丝氨酸蛋白酶与疟原虫卵囊黑化的相互关系。　方法　将斯氏按蚊分为吸糖水组、吸正常小白鼠血组、吸约氏疟原虫感染血组和吸硝喹糖水组 ,挤压法收集雌斯氏按蚊血淋巴 ,Bradford法检测血淋巴蛋白浓度 ,继而对血淋巴进行SDS PAGE ,电转移后检测丝氨酸蛋白酶的表达差异。　结果　 4组斯氏按蚊丝氨酸蛋白酶Western印迹均呈现两条带 ,分子质量分别约 160和 15 0ku ,与吸糖水组比较 ,吸正常小白鼠血组丝氨酸蛋白酶表达稍高 ,而感染约氏疟原虫后斯氏按蚊血淋巴丝氨酸蛋白酶表达明显增强 ,感染第 6d达高峰 ,之后表达下调 ,而硝喹诱导黑化后丝氨酸蛋白酶表达水平呈逐日下调趋势。　结论　斯氏按蚊血淋巴丝氨酸蛋白酶参与了疟原虫卵囊黑化包被反应。     

斯氏按蚊转录因子Relish基因克隆、定位及不同食源条件下表达

目的 对斯氏按蚊转录因子Relish基因进行克隆、定位和差异分析，初步探讨转录因子Relish在前酚氧化酶（PPO）级联与疟原虫卵囊黑化中的信号调控作用。 方法 设计简并引物，对全蚊cDNA模板进行RT-PCR扩增，产物纯化、克隆、测序和鉴定，利用特异引物分别从血细胞或中肠扩增目的基因，于不同食源条件下进行半定量分析和原位核酸分子杂交定位。 结果 获得了1种斯氏按蚊Relish cDNA部分序列，与冈比亚按蚊Relish基因很相似，并存在于中肠和血细胞，半定量分析显示，感染约氏疟原虫6、12、24和48 h或吸硝喹糖水12和24 h，于诱导约氏疟原虫卵囊黑化之前表达明显增强，原位核酸分子杂交证实血细胞和中肠有表达。 结论 斯氏按蚊转录因子Relish可能在疟原虫感染或/和约氏疟原虫卵囊黑化调控中发挥重要作用。     

斯氏按蚊血细胞对约氏疟原虫卵囊黑化的影响

目的　探讨斯氏按蚊血细胞及血细胞PPO对疟原虫卵囊黑化的影响。方法　利用电镜观察蚊血细胞在卵囊黑化中的作用、RT -PCR检测蚊血细胞、蚊胃中PPOmRNA的表达、原位杂交检测血细胞中PPOmRNA的表达。结果　通过RT -PCR和原位杂交 ,发现斯氏按蚊PPOmRNA在血细胞中有表达 ,颗粒细胞可能是其主要的表达细胞 ;硝喹可使约氏疟原虫卵囊发生退行性变 ,卵囊黑化比率明显增加。结论　说明血细胞能够合成PPO ,进一步证实了蚊血细胞 ,特别是硝喹对卵囊的发育有抑制和阻断作用时 ,颗粒细胞在疟原虫卵囊黑化中起重要作用。     

斯氏按蚊丝氨酸蛋白酶基因克隆及其与约氏疟原虫卵囊黑化关系的研究

目的克隆斯氏按蚊丝氨酸蛋白酶基因,分析该分子与约氏疟原虫卵囊黑化关系。方法根据其它昆虫丝氨酸蛋白酶的保守氨基酸序列设计简并引物,以斯氏按蚊全蚊cDNA为模板,进行RT-PCR扩增,PCR产物纯化,克隆入pUCm(T载体,测定插入片段序列,对序列进行BLAST检索和鉴定,根据序列设计相应基因的特异引物,然后分别从血淋巴细胞或中肠扩增目的基因,并进行不同食源条件下丝氨酸蛋白酶基因的半定量、原位核酸分子杂交定位与约氏疟原虫卵囊黑化关系的分析。结果获得了2种斯氏按蚊血细胞丝氨酸蛋白酶cDNA部分序列,即AsSP1(448bp)和AsSP2(472bp),分别与冈比亚按蚊SP2A和大劣按蚊SP2基因很相似,其编码的氨基酸序列均包含保守的丝氨酸蛋白酶催化功能域。在中肠和血淋巴内也获得相同的目的基因片段,半定量分析显示约氏疟原虫感染或诱导卵囊黑化呈现之前的表达明显增强,原位核酸分子杂交技术也进一步证实血细胞有AsSP1和AsSP2 mRNA表达。结论AsSP1和AsSP2很可能与疟原虫感染或约氏疟原虫卵囊黑化相关,推测可能是斯氏按蚊的前酚氧化酶的活化酶。     

核糖体蛋白S7在大劣按蚊抗疟原虫感染免疫研究中的内标作用

目的　探讨核糖体蛋白S7(ribosomalprotein,rpS7)在大劣按蚊抗约氏疟原虫感染免疫中的作用。　方法　根据rpS7的保守mRNA序列设计简并引物,以大劣按蚊血细胞mRNA为模板,进行RTPCR扩增,克隆、并测定序列;RTPCR结合凝胶图像扫描比较、分析血餐后d1、d2、d3、d4、d7和d11,未吸鼠血组(N)、吸正常鼠血组(B)和吸感染约氏疟原虫鼠血组(I)大劣按蚊血细胞中rpS7的转录差异。　结果　成功克隆大劣按蚊rpS7部分cDNA序列(465bp),吸血和约氏疟原虫感染均未明显地影响大劣按蚊血细胞中rpS7的转录(P>0.05)。　结论　大劣按蚊血细胞rpS7可作为研究大劣按蚊抗约氏疟原虫感染免疫相关因子的内参照。     

抗斯氏按蚊中肠蛋白组分的抗体对约氏疟原虫卵囊的作用

目的 观察抗斯氏按蚊中肠蛋白组分的抗体对约氏疟原虫卵囊的抑制作用。 方法 解剖实验室饲养斯氏按蚊雌蚊，取中肠（胃）制备中肠蛋白抗原并免疫BALB/c小鼠（8只， 100 μg/只)， 共免疫4次， 每次间隔7～10 d，末次免疫后10 d，腋窝动脉取血，分离血清。用蛋白质印迹（Western blotting）分析中肠蛋白的免疫活性抗原。用葡聚糖凝胶过滤法获得相对分子质量（Mr）为38 000~50 000的蛋白。用该中肠蛋白免疫小鼠（12只， 100 μg/只)， 共免疫4次，每次间隔7~10 d。同时设PBS对照组。末次免疫后7 d，ELISA检测小鼠血清中的抗体，抗体效价≥1 : 2 560时，该免疫组小鼠和对照组小鼠经腹腔接种感染约氏疟原虫（约含2×10⁷个感染疟原虫的红细胞），感染后3 d取小鼠尾血镜检，雌配子体数＞2/10个视野的小鼠作为供血鼠，斯氏按蚊成蚊吸血后9 d解剖，计数中肠的卵囊数量。 结果 Western blotting显示斯氏按蚊中肠蛋白抗原的显色区带有8条，其中Mr 38 000~50 000的区带显色较清晰；实验组和对照组中肠卵囊感染率分别为28.70%（62/216）和51.09%（47/92）（P＜0.05），中肠卵囊指数分别为14.14（1 541/109）和26.02（1 223/47），两者差异有统计学意义（P＜0.01）。 结论 斯氏按蚊Mr 38 000~50 000中肠蛋白有免疫活性；针对该中肠蛋白的抗体对约氏疟原虫卵囊的发育有明显的抑制作用。     

大劣按蚊血细胞对约氏疟原虫卵囊黑化作用的观察

大劣按蚊感染约氏疟原虫后第５ｄ和１５ｄ，电镜下分别观察退变的卵囊周围血细胞的反应。结果表明；感染扣第５ｄ卵囊发育较小，卵囊周围即可血细胞附着；第１５ｄ卵囊有些已熔泡化，其外周可见较多血细胞、血细胞内、血细胞和卵囊之间、甚至卵囊内有许多微管结构之颗粒及其它颗粒，有些卵囊已黑化，其外周仍可见到血细胞的残骸及黑色素样颗粒。     

大劣按蚊感染约氏疟原虫血淋巴相关蛋白的筛选和鉴定

目的 筛选并鉴定大劣按蚊感染约氏疟原虫后血淋巴的相关蛋白．为进一步的功能研究和蚊先天性免疫研究奠定基础。方法 以大劣按蚊一约氏疟原虫为实验模型，利用二维电泳技术分离和比较饱吸约氏疟原虫感染的鼠血和正常鼠血后24h的大劣按蚊血淋巴蛋白，获得差异蛋白．并对差异蛋白进行N端氨基酸测序和生物信息学分析,从而推测差异蛋白的功能。结果 获得清晰二维电泳图，并筛选获得37个差异蛋白点。对其中比较明显的差异蛋白1进行氨基酸测序后发现，该蛋白可能为一翻译延伸因子。结论 成功分离和筛选获得了大劣按蚊感染约氏疟原虫血淋巴相关蛋白。并进行了初步鉴定。     

两种按蚊对食蟹猴疟原虫B株敏感性的比较

用食蟹猴疟原虫B株接种恒河猴后,在最佳感染时机血餐,第7d胃感染率,大劣按蚊平均为94.9％(74/78),斯氏按蚊平均为94.6％(70/74)。第12d涎腺感染率,大劣按蚊平均为93.9％(62/66),斯氏按蚊平均为92.2％(59/64),两者的胃和涎腺感染率无显著性差异。卵囊均数,大劣按蚊为124.2个,斯氏按蚊为47.6个,前者为后者的2.6倍。在欠佳感染时机血餐,大劣按蚊的胃和涎腺感染率均高于斯氏按蚊,大劣按蚊的卵囊均数为斯氏按蚊的3倍余。     

大劣按蚊含硫脂蛋白基因在约氏疟原虫感染中的作用

目的分析大劣按蚊含硫脂蛋白(TEP1)基因在约氏疟原虫感染过程中的作用。方法根据GenBank中大劣按蚊TEP1基因序列设计带有T7启动子的引物,以大劣按蚊cDNA为模板,进行PCR扩增,纯化产物,体外转录试剂盒合成AdTEP1双链RNA。羽化1～2日的雌性大劣按蚊分3组(200只/组):TEP1干扰组、绿色荧光蛋白(EGFP)干扰组和对照组。TEP1、EGFP干扰组按蚊分别进行胸部微量注射AdTEP1双链RNA、EGFP双链RNA各147 ng,对照组未处理。干扰后3d,每组取15只按蚊,去头,以大劣按蚊核糖蛋白S7(AdS7)为内参进行半定量PCR,检测干扰效果。干扰后4d,用约氏疟原虫BY256荧光株感染3组大劣按蚊。感染后9d,每组各解剖25只蚊胃,记录感染率和感染度。结果对照组和EGFP干扰组AdTEP1的表达条带亮度基本一致,而TEP1干扰组AdTEP1的表达条带亮度非常微弱。感染后9 d,蚊胃卵囊数统计学分析表明,对照组、EGFP干扰组和TEP1干扰组感染率分别为(24±2.83)%、(24±0.71)%和(80±3.54)%;感染度分别为0.32±0.7、0.44±0.85和5.52±4.84...     

大劣按蚊抗约氏疟原虫感染相关cDNA文库的构建

目的构建大劣按蚊抗约氏疟原虫感染相关cDNA文库，为进一步筛选、克隆按蚊免疫差异新基因奠定基础。方法以大劣按蚊～约氏疟原虫为实验模型，分别将饱吸约氏疟原虫感染鼠血和正常鼠血后24h的大劣按蚊作为T组和D组，采用抑制差减杂交方法和T／A克隆技术构建大劣按蚊抗约氏疟原虫感染相关cDNA文库。结果扩增差减cDNA文库获得2500余个白色阳性克隆，随机挑取白色克隆进行PCR扩增。92％的克隆中均有200～600bp的插入片段，测序显示，有与冈比亚按蚊未知功能基因同源的克隆。结论成功构建了大劣按蚊差异基因文库。     

按蚊TEP1基因与硝喹诱导疟原虫卵囊黑化反应的相关性

目的 对斯氏按蚊TEP1基因与抗疟药硝喹诱导约氏疟原虫卵囊黑化反应的相关性进行初步研究。 方法 斯氏按蚊吸血感染约氏疟原虫后,随机分为两组（各300只）,A组喂饲含0.1%硝喹蔗糖水,B组喂饲10％蔗糖水。另设正常对照组（C组）,常规蔗糖水饲养。分别于用药后第1、2、3和4天,取各组雌蚊的血淋巴（各50只）,提取cDNA模板,设计引物,克隆斯氏按蚊TEP1基因,用荧光定量PCR检测TEP1基因在抗疟药硝喹诱导下的变化;同时解剖各组雌蚊（各25只）,光镜观察约氏疟原虫卵囊的黑化情况,分析TEP1基因与抗疟药诱导的黑化反应的关系。结果 成功克隆TEP1基因,推测其氨基酸序列含有TEP分子高度保守的硫酯序列区（GCGEQ）。荧光定量PCR检测结果显示,抗疟药硝喹可诱导斯氏按蚊TEP1基因表达上调,于诱导后第3天,A组的TEP1基因相对表达量为2.423,是B组（1.036）的2.5倍,两者差异有统计学意义（P<0.05）。相同时点,光镜观察显示,A组蚊经硝喹诱导后的约氏疟原虫卵囊出现黑化现象,黑化率约14.0％,而B组则未发现有黑化现象。 结论 抗疟药物硝喹可诱导斯氏按蚊TEP1基因上调,该基因与约氏疟原虫卵囊黑化相关。     

斯氏按蚊血淋巴蛋白浓度的检测及其意义

目的　了解斯氏按蚊成蚊在不同食源条件下血淋巴蛋白浓度的变化。　方法　挤压法分别收集4组(吸蔗糖水组、吸正常血组、吸感染血组和吸硝喹组)斯氏按蚊成蚊血淋巴,采用Bradford法测定血淋巴蛋白浓度,并进行Excel自动分析。　结果　吸血感染约氏疟原虫8d后,吸感染血组血淋巴蛋白浓度高于吸蔗糖水组和吸正常血组,平均分别为4.436、3.080和3.092μg/μl,通常硝喹组浓度(2.264μg/μl)低于吸感染血组。　结论　吸硝喹组蚊体内血淋巴蛋白浓度下降,提示蚊血淋巴蛋白可能参与疟原虫卵囊的黑化包裹反应。