特定沉默胶质瘤U251细胞株的PDGF-B基因对细胞凋亡和增殖的影响研究

目的利用RNA干扰基因治疗技术,特定沉默胶质瘤U251细胞株的血小板衍生生长因子B(PDGF-B)基因,观察其对U251细胞株细胞凋亡和增殖的影响。方法用血清培养液(含10%胎牛血清DMEM培养基)体外培养人U251脑胶质瘤细胞系。随机分为3组,第1组为实验组:转染siRNA的细胞,第2组为阴性对照组:转染空白质粒的细胞;第3组为空白对照组:细胞常规培养不予以干预。利用脂质体将siRNA转染进入U251细胞,在细胞内形成双链siRNA,识别并降解PDGF-B mRNA。通过RT-PCR检测U251细胞中PDGF-B基因mRNA的表达水平,Western blot检测PDGF-B的蛋白表达,MTT法检测U251细胞的增殖情况,流式细胞学对比检测3组细胞的凋亡情况。结果利用脂质体将靶向PDGF-B基因siRNA转染进入U251细胞,48 h后利用RT-PCR检测PDGF-B基因mRNA的表达,结果显示与阴性对照组和空白对照组对比,转染组PDGF-B基因mRNA表达水平明显下降;转染72 h后,Western blot检测显示siRNA转染组PDGF-B蛋白表达明显抑制(抑制率60%);MTT结果显示siRNA转染组U25细胞增殖较对照组明显降低;流式细胞学检测显示,与阴性对照组和空对照组相比,转染siRNA的细胞的实验组中,G1期细胞明显增多,S期细胞明显减少,提示降低PDGF-B在胶质瘤细胞的表达,能够使细胞周期阻滞在G1期,从而抑制胶质瘤细胞的增殖,并促进细胞的凋亡。结论构建靶向胶质瘤细胞PDGF-B的RNA干扰质粒并转染人胶质瘤U251细胞株后,通过体外试验观察可明显抑制U251细胞株PDGF的表达,其所产生的RNA干扰效应对人胶质瘤U251细胞株有明显的生长的抑制和促进凋亡作用。     

siRNA对骨肉瘤U2OS细胞株MDM2-mRNA表达的抑制作用

目的 研究载体介导的siRNA（small interfere RNA）技术对骨肉瘤细胞株U20S中MDM2-mRNA表达的抑制作用.方法 依据设计siRNA的原则,以MDM2为靶基因设计并合成有小发夹结构的两条DNA序列,经退火成互补双链,再克隆到载体PGCsilencerTM中构建重组体（PGCsilencerTM-MDM2 siRNA）.实验分转染重组质粒组,转染阴性对照质粒组和只加脂质体的空白组;RT-PCR法观察U20S细胞中MDM2-mRNA表达改变.结果 成功构建发卡样MDM2 siRNA真核表达载体（PGCsilencer TM-MDM2 siRNA）;PGCsilencer TM-MDM2 siRNA转染到U20S细胞后,MDM2-mRNA表达较空白组显著下降（P＜0.05）,转染阴性对照质粒组与空白组无显著差异（P＞0.05）.结论 成功构建PGCsilencer TM-MDM2 siRNA重组体,并能有效抑制U20S细胞中MDM2-mRNA表达.     

siRNA特异性抑制HEL细胞evi1基因的实验研究

本研究探讨小干扰RNA（small interfering RNA,siRNA）沉默人红白细胞白血病细胞（HEL）的evi1基因后对细胞evi1基因表达的抑制作用及细胞生物学特征变化及其作用机制。体外合成3条evi1基因特异性的siRNA（siRNA-1、siRNA-2、siRNA-3）并转染HEL细胞,并设对照。用四甲基偶氮唑蓝法评价细胞增殖抑制情况,半定量逆转录聚合酶链反应（semiquantitative RT-PCR）检测evi1基因mRNA的表达,台盼蓝染色试验测定细胞活性的变化,流式细胞术检测细胞周期变化和凋亡率。结果显示,细胞转染24、48、72小时后,以siRNA-1作用最强,转染后48小时抑制作用最明显。siRNA浓度为120nmol/L时,抑制率达到最大。转染48小时后siRNA-1对HEL细胞的增殖抑制率为（72.22±2.80）%,evi1-mRNA相对表达率为（27.31±1.11）%,HEL细胞活率为（26.05±2.49）%,与其他各组相比有显著性差异（p〈0.001）。siRNA可使细胞周期阻滞在G0/G1期,S期细胞明显减少,凋亡率明显增高（p〈0.01）。结论：evi1基因特异性siRNA可抑制HEL细胞增殖,使evi1-mRNA表达水平降低,细胞活性下降,HEL细胞周期阻滞在G0/G1期,抑制细胞的有丝分裂,促进细胞凋亡。     

靶向survivin的siRNA并氟尿嘧啶转染对HepG2增殖影响

目的研究靶向survivin的小分子干扰RNA（siRNA）和氟尿嘧啶（5-FU）联用对肝癌细胞HepG2增殖的抑制作用及对凋亡的影响。方法将HepG2细胞分为空白对照组、阴性对照组、5-FU处理组、siRNA转染组及5-FU＋siRNA转染组。转染采用脂质体法。采用RT-PCR法分别检测HepG2细胞survivin mRNA转录水平;MTT法分别检测靶向survivin的siRNA和5-FU对HepG2细胞增殖的抑制作用;流式细胞术检测HepG2细胞凋亡情况。结果 siRNA转染组、5-FU＋siRNA转染组survivin mRNA表达较空白对照组、阴性对照组、5-FU处理组明显下降（F=326.78,q=5.78～7.12,P〈0.05）。5-FU＋siRNA转染组细胞增殖抑制率为51.58%±1.35%,与其他各组相比明显增高（F=1 293.24,q=15.31～82.26,P〈0.01）。5-FU＋siRNA转染组与其他各组相比细胞凋亡率明显增高（F=13 568.68,q=110.47～327.16,P〈0.01）。结论将靶向survivin的siRNA和5-FU联合应用可以显著抑制肝癌细胞survivin基因表达,并协同抑制HepG2细胞增殖,共同发挥诱导细胞凋亡作用。     

RNAi对细胞因子信号转导抑制因子1在内皮细胞中表达的沉默作用

背景：利用RNAi技术引发细胞因子信号转导抑制因子1沉默可促进神经内分泌肿瘤细胞的凋亡,然而对于内皮细胞是否有类似的作用,目前尚不清楚。目的：实验拟验证内皮细胞中是否有细胞因子信号转导抑制因子1表达,并在所设计的siRNA中,筛选出1对对细胞因子信号转导抑制因子1沉默效率最高的siRNA。设计、时间及地点：随机对照,体外细胞学实验,于2007—12／2008—06在南昌大学医学院第二附属医院所属的江西省分子医学重点实验室完成。材料：人脐静脉内皮细胞由南京凯基生物公司提供。方法：设计并化学合成4对靶向细胞因子信号转导抑制因子1的siRNA：siRNA-1、siRNA-2、siRNA-3、siRNA-4。培养人脐静脉内皮细胞,利用RT-PCR检测人脐静脉内皮细胞是否有细胞信号转导抑制因子1表达。将带有荧光标记的阴性对照siRNA配制成25,50,75,100nmol／L的4组,利用脂质体转染细胞,并在荧光倒置显微镜下观察转染效率,对比得出有最佳转染效率的浓度。然后,实验根据不同的处理因素分成8组：siRNA-1、siRNA-2、siRNA-3、siRNA-4和阳性对照组、阴性对照组、转染试剂组、空白对照组4个对照组。将均为有最佳转染效率浓度的各组siRNA转染细胞,48h后提取RNA。主要观察指标：利用RT-PCR测定细胞因子信号转导抑制因子1mRNA的相对表达水平。结果：人脐静脉内皮细胞高表达细胞因子信号转导抑制因子1。siRNA在50nmol/L时有较高的转染效率。4对siRNA干扰后,细胞因子信号转导抑制因子1mRNA的表达水平与阴性对照、转染试剂组和空白对照组相比明显下调（P〈0．05）,与阳性对照组相比显著下调（P〈0．01）,其中siRNA-3的沉默效率最高（P〈0．05）,阴性对照、转染试剂组和空白对照组与阳性对照组相比明显下调（P（0．05）,阴性对照、转染试剂组和空白对照组之间差异无显著性意义（P〉0．05）。结论：内皮细胞中存在细胞因子信号转导抑制因子1表达。RNAi抑制细胞因子信号转导抑制因子1在内皮细胞中的表达,实验筛选出1对沉默效率最高的siRNA。     

RNA干扰MBP-1基因对胃癌细胞SGC-7901增殖影响

目的：探讨 MBP-1（c-myc promter binding protein 1,MBP-1）基因表达沉默对胃癌细胞株 SGC-7901细胞增殖影响。方法实验分3组：空白对照组（未转染胃癌细胞）、阴性对照组（转染错义序列）和干扰组（转染 MBP-1 shRNA）。设计2条针对MBP-1基因的小干扰 RNA 片段及1条阴性对照 siRNA,并构建入 pSIREN-retroQ 质粒。将构建的重组 pSIREN-retroQ 质粒通过 Lipofectamine 2000脂质体转染胃癌 SGC-7901细胞,嘌呤霉素筛选稳转株细胞。Real time PCR 和 Western blot 分别检测MBP-1表达。MTT 法对 MBP-1干扰后 SGC-7901细胞增殖进行检测。结果通过 PCR 扩增阳性克隆及测序,说明已成功构建MBP-1干扰及对照重组 pSIREN-retroQ 质粒。通过 Lipofectamine 2000脂质体将重组质粒转染胃癌 SGC-7901细胞,并通过嘌呤霉素筛选2周,说明已成功构建 MBP-1干扰及对照 SGC-7901稳转株细胞。Real time PCR 检测,干扰组 MBP-1 mRNA 相对表达量与空白对照组相比显著下调（P ＜0.05）。Western blot 检测 MBP-1蛋白表达,干扰组 MBP-1表达量与空白对照组相比也都显著下调。MTT 法检测结果表明,MBP-1干扰组细胞在48、72、96和120 h 增殖能力比空白对照组都有显著的升高（P ＜0.05）。结论下调 MBP-1基因表达能明显促进胃癌细胞 SGC-7901的增殖,从而为胃癌基因治疗提供了新靶点。     

RNA干扰沉默STAT3基因表达对膀胱癌细胞生长影响的实验研究

目的探讨应用RNA干扰技术沉默信号转导和转录激活因子3（STAT3）基因对膀胱癌T24及5637细胞的影响。方法针对STAT3 mRNA序列设计合成3对编码小干扰RNA（siRNA）的DNA模板，构建pGenesil-1-shRNASTAT3重组质粒，转染人膀胱癌T24及5637细胞。通过半定量RT-PCR、Western印迹检测STAT3基因不同水平的表达情况，采用四甲基偶氮唑盐（MTT）实验、流式细胞仪检测转染后细胞增殖及细胞周期的变化。结果成功构建pGenesil-1-shRNA—STAT3重组质粒，并成功转染T24及5637膀胱癌细胞；半定量RT-PCR、Western印迹检测结果显示，重组质粒实验组细胞的STAT3基因表达在RNA及蛋白水平上显著低于对照组（P〈0．05）；MTT实验、流式细胞仪检测结果显示，重组质粒实验组细胞的增殖明显受到抑制并出现凋亡现象。结论pGenesil-1-shRNA—STAT3转染T24及5637膀胱癌细胞后，可有效抑制STAT3的表达，并抑制膀胱癌细胞的生长及增殖。     

川芎嗪和siRNA沉默转化生长因子β1干预大鼠肝星状细胞结缔组织生长因子的表达

背景：作者前期研究发现川芎嗪可以通过抑制肝星状细胞的增殖、阻抑p38MARK信号通路、下调结缔组织生长因子的表达等多途径发挥抗肝纤维化的作用。一般认为转化生长因子β1是促进纤维化发生最重要的细胞因子,结缔组织生长因子是转化生长因子β1的下游效应介质,siRNA靶向抑制转化生长因子β1可能成为治疗肝纤维化的新方法。目的：观察川芎嗪及化学合成的siRNA转化生长因子β1对大鼠肝星状细胞结缔组织生长因子表达的影响。方法：体外培养大鼠肝星状细胞,从3条siRNA转化生长因子β1中筛选一条有效的基因沉默片段,然后利用脂质体转染试剂共同转染培养24h的细胞作为转染组,并设计空白对照组、转染试剂组、川芎嗪组及联合治疗组。结果与结论：与空白对照组相比,转染组、川芎嗪组、联合治疗组Ⅰ、Ⅲ型胶原及结缔组织生长因子mRNA表达均下调（P〈0.05）。在转染组、川芎嗪组及联合治疗组,结缔组织生长因子蛋白表达均下调（P〈0.05）;培养上清液中Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原含量均降低（P〈0.05）。结果表明,siRNA沉默转化生长因子β1基因能下调结缔组织生长因子的表达,减少Ⅰ、Ⅲ型胶原的表达。川芎嗪也能下调结缔组织生长因子的表达,但对Ⅰ、Ⅲ型胶原表达的抑制作用更加显著,提示川芎嗪抗肝纤维化可能是多种作用靶点。     

siRNA抑制人膀胱癌T24细胞株VEGF 的表达及细胞增殖

目的探讨siRNA（small interfering RNA）对T24人膀胱癌细胞株VEGF基因表达的抑制及癌细胞增殖抑制和诱导凋亡作用。方法体外构建两个针对VEGF基因的siVEGF的重组质粒，转染124细胞；应用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）测定VEGF基因的表达，并用MTT法和流式细胞仪检测siVEGF对细胞的增殖抑制率和凋亡的影响。结果构建的两个siVEGF重组质粒分别使VEGF基因表达下调到空白组的21．02％和30．13％；control siRNA组的VEGF基因表达与空白组无明显差异。转染siVEGF后T24细胞生长受到抑制，并发生细胞凋亡，凋亡率分别为45．5％和35．9％。结论siVEGF可以有效抑制124细胞株中VEGF的表达，从而抑制细胞增殖，并诱导细胞凋亡。     

靶向转化生长因子β1的siRNA真核表达载体的构建及鉴定

[目的]构建靶向转化生长因子β1（TGFβ1）小干扰RNA（siRNA）的真核表达载体.[方法]设计二个siRNA作用靶点,体外合成的相应双链DNA被插入pSilencer-2.1质粒中,对该重组表达载体进行酶切鉴定及DNA测序.采用脂质体转入HSC-T6细胞中,利用RT-PCR法和western-blot分别检测TGFβ1 mRNA和蛋白的表达.[结果]靶向TGFβ1 的siRNA-a和siRNA-b二个表达质粒是成功构建; 与无关对照组相比,siRNA-b组对TGFβ1mRNA和蛋白表达均明显下调（ P 〈0.01）,siRNA-a组无明显下调（ P 〉0.05）.[结论]成功构建了靶向TGFβ1 基因的siRNA表达质粒,为进一步研究其阻断肝纤维化打下基础.     

FMNL2 shRNA表达质粒的构建及其对SW620增殖活性的影响

目的 构建针对FMNL2基因的shRNA表达载体,以用于后续的功能学实验,并观察其对SW620细胞增殖的影响.方法 依据设计shRNA的原则,针对人FMNL2的mRNA序列,设计并合成编码的shRNA的两条寡核苷酸序列,构建重组质粒PGenesil-FMNL21和PGenesil-FMNL22,并设阴性对照PGenesil-HK.转染重组质粒至SW620中,转染48h后荧光显微镜下观察转染率,应用荧光定量PCR法检测PGenesil-FMNL21和PGenesil-FMNL22的瞬时干扰效果;应用MTT法检测转染48h和72h后对SW620增殖活性的影响.结果 酶切及测序证实重组质粒构建成功;转染48h荧光显微镜观察转染率:PGenesil-FMNL21为(60.8±2.8)%,PGenesil-FMNL22为(58.7±2.9)%,PGenesil-HK为(62.6±1.7)%,三者之间差异无统计学意义(P＞0.05);PGenesil-FMNL21对FMNL2基因的抑制效率最高为77.1%;转染12、24、48、72、96h后PGenesil-FMNL21对FMNL2的抑制率分别为13.5%、57.3%、80.3%、62.4%、33.2%;MTT检测在转染48 h和72 h后,实验组细胞的增殖活性小于对照组细胞的增殖活性(P＜0.05).结论 PGenesil-FMNL21和PGenesil-FMNL22均有沉默FMNL2基因的作用,其中PGenesil-FMNL21的沉默作用最大;FMNL2可能对促进细胞的增殖有一定的作用.     

Klotho基因转染促进脂肪间充质干细胞增殖的实验研究

目的探讨klotho基因转染对脂肪间充质干细胞(ADSCs)增殖的影响。方法将含有klotho全长基因的真核质粒转染至从脂肪组织分离的ADSCs中,采用CCK-8法测定转染后细胞增殖率,western blot法检测转染后细胞周期蛋白D1的表达变化,流式细胞术检测转染前后ADSCs的细胞周期变化。结果转染klotho基因96h后AD-SCs的细胞增殖率为170.50%;流式细胞术检测结果显示,ADSCs转染klotho基因S期和G2期细胞明显增多;west-ern blot分析显示ADSCs转染klotho基因组细胞周期蛋白D1增高。结论转染klotho基因有促进ADSCs增殖的作用。     

RNA干扰对急性髓系白血病AML1-ETO融合基因表达的抑制作用

目的 应用RNA干扰技术抑制Kasumi-1细胞AML1-ETO融合基因的表达,研究随后出现的细胞增殖和细胞周期变化.方法 体外化学合成针对AML1-ETO融合基因的小干扰RNA(siRNA),并用电穿孔方法将AML1-ETO siRNA转染Kasumi-1细胞,以非特异性的siRNA转染细胞作阴性对照;电转带有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的载体,流式细胞术检测其绿色荧光以确定电转效率;荧光染料实时定量PCR及Western blot检测AML1-ETO siRNA的抑制效应;并应用CCK-8实验法检测细胞增殖率;采用碘化丙锭(PI)法测定细胞周期DNA含量.结果 电转增强EGFP的转染效率可达44.5%;电转AML1-ETO siRNA可以有效抑制AML1-ETO融合基因在mRNA和蛋白水平的表达;电转AML1-ETO siRNA 72 h后细胞增殖率[(47.90±0.02)%]低于对照组[(66.90±0.08)%](P<0.05);PI染色显示AML1-ETO siRNA转染细胞72 h后,G1期细胞比例为38.3%,对照组为31.6%,而处于G2/M期细胞分别为1.8%和2.4%.结论 化学合成的特异性siRNA能抑制AML1-ETO融合基因的表达,siRNA介导的AML1-ETo融合蛋白表达减少阻滞Kasnmi-1细胞在G1期,进而抑制细胞增殖.     

siRNA沉默表皮生长因子受体蛋白表达对肾癌细胞生物学行为的影响

目的观察在siRNA沉默EGFR基因处理后肾癌细胞的生物学行为情况。方法将肾癌细胞株ACHN分为3组,对照组不进行任何干预,阴性对照转染组使用加入非特异性转染试剂及siRNA干预,观察组使用加入特性性转染试剂及siRNA干预,分别检测3组细胞的EGFR表达量、增殖活性、生长曲线、迁移及侵袭活性。结果经siRNA处理72 h后,观察组细胞EGFR表达水平明显低于阴性对照转染组和对照组;观察组细胞生长活跃能力显著低于对照组和阴性对照转染组,且在处理48 h后RNAi组细胞数显著低于对照组和阴性对照转染组(P0.05);较空白组和阴性对照转染组,观察组细胞生长受到显著抑制(P0.05);12 h时及24 h时观察组细胞划痕距离显著高于对照组和阴性对照转染组(P0.05);12 h时对照组、阴性对照转染组穿膜细胞数差异无统计学意义(P0.05),观察组穿膜细胞数显著低于对照组和阴性对照转染组(P0.05)。结论采用siRNA沉默EGFR蛋白后,可有效改善肾癌细胞的增殖、生长、迁移及侵袭等生物学活性。     

RNA干扰对慢性粒细胞白血病bcr/abl融合基因表达的抑制作用

目的研究RNA干扰(RNAi)效应对慢性粒细胞白血病(CML)bcr／abl融合基因表达的抑制作用。方法体外化学合成针对bcr／abl融合基因的小干扰RNA(siRNA)，并用电穿孔方法将siRNA转染K562细胞株，以未转染的细胞及非特异性的siRNA转染细胞作对照；同时转染带有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的载体作为阳性对照，流式细胞术检测其绿色荧光以确定转染效率；实时定量RT—PCR及Western blot法检测siRNA的抑制效应。MTT法检测细胞增殖抑制率。膜联蛋白V(Annexin V)及碘化丙锭双染法测细胞凋亡率。结果电穿孔的转染效率可达70％；化学合成的siRNA可以抑制bcr／abl融合基因在mRNA和蛋白水平的表达；特异性siRNA可以抑制细胞增殖，转染24h细胞增殖抑制率达47％，48h达56％；特异性siRNA转染细胞24h组凋亡率为15．05％．48h组为19．47％，与对照组(1．00％)比较明显提高。结论在细胞水平上，化学合成的siRNA可以抑制bcr／abl融合基因的表达，为利用RNA干扰作为基因治疗的研究奠定基础。     

慢病毒介导的CAV1过表达对HL-60细胞增殖与凋亡的影响

本研究旨在探讨慢病毒介导的CAV1过表达对HL-60细胞增殖与凋亡的影响。构建慢病毒重组表达载体pcDNA-EF1-CAV1,并与pPACK包装质粒混合物共转染至293TN细胞后,收集病毒液感染HL-60细胞,使CAV1基因在细胞中稳定转染并高表达。采用Western blot方法评价转染后HL-60 CAV1蛋白表达情况。采用CCK-8法、流式细胞术分别检测转染前后HL-60细胞的增殖活性和凋亡情况。结果表明:PCR阳性克隆筛选及核苷酸测序结果证实CAV1基因正确插入表达载体pcDNA-EF1-GFP中。重组慢病毒颗粒Lv-CAV1成功转染HL-60细胞,转染率达90%。Western blot检测结果显示,转染后48 h HL-60细胞中CAV1蛋白表达明显增高。CCK-8检测结果显示转染后48 h HL-60细胞增殖活性降低(P<0.05),流式细胞仪检测结果显示转染后HL-60细胞凋亡率明显增加(P<0.01)。结论:CAV1过表达对HL-60细胞具有抑制细胞的增殖活性、促进细胞凋亡的作用。     

Fluid shear stress differentially modulates expression of genes encoding basic fibroblast growth factor and platelet-derived growth factor B chain in vascular endothelium.

Fluid shear stress has been shown to be an important regulator of vascular structure and function through its effect on the endothelial cell. We have explored the effect of shear stress on the expression of the heparin-binding growth factors platelet-derived growth factor B chain (PDGF-B) and basic fibroblast growth factor (bFGF) in bovine aortic endothelial cells using a purpose-built cone-plate viscometer. Using morphometric analysis, we have mimicked the endothelial cell shape changes encountered in vivo in response to shear stress and correlated these with changes in gene expression. Steady laminar shear stress of 15 and 36 dyn/cm2 both resulted in endothelial cell shape change, but the higher shear stress induced greater and more uniform alignment in the direction of flow and nuclear protrusion after 24 h. Steady laminar shear stress of both 15 and 36 dyn/cm2 induced a significant 3.9- and 4.2-fold decrease, respectively, in PDGF-B mRNA at 9 h. In contrast, steady laminar shear of 15 dyn/cm2 induced a mild and transient 1.5-fold increase in bFGF mRNA while shear of 36 dyn/cm2 induced a significant 4.8-fold increase at 6 h of shear which remained at 2.9-fold at 9 h. Pulsatile and turbulent shear stress showed the same effect as steady laminar shear stress (all at 15 dyn/cm2 time-average magnitude) on PDGF-B and bFGF mRNA content. Cyclic stretch (20% strain, 20/min) of cells grown on silicone substrate did not significantly affect either PDGF-B or bFGF mRNA levels. These results suggest that expression of each peptide growth factor gene is differentially regulated by fluid shear stress in the vascular endothelial cell. These results may have implications on vascular structure and function in response to hemodynamic forces and present a model for the study of transduction of mechanical stimuli into altered gene expression.     

人胰岛素样生长因子1基因转染脂肪源性干细胞的效应

背景：人胰岛素样生长因子1基因对脂肪源性干细胞的增殖和分化也可能会产生有效作用。目的：验证人胰岛素样生长因子1基因转染对体外培养的脂肪源性干细胞的效应。方法：构建含人胰岛素样生长因子1基因的双顺反子真核表达载体plRES2-EGFP-hlGF-1,利用阳离子脂质体Lipofectamine2000介导转染体外培养的人脂肪源性干细胞。观察基因转染后细胞增殖及形态的变化,倒置荧光显微镜观测标记基因增强绿色荧光蛋白的表达并计算转染效率,酶联免疫吸附试验检测培养上清中人胰岛素样生长因子1的浓度,免疫组织化学染色及RT-PCR检测人胰岛素样生长因子1的表达,流式细胞仪检测转染前后细胞周期的变化。结果与结论：测序及酶切证实真核表达载体plRES2-EGFP-hlGF-1构建正确。体外培养的脂肪源性干细胞为多种形态并存,转染后6h检测到有EGFP的表达,至60h达到高峰,转染效率为（16±3）％。细胞上清中人胰岛素样生长因子1的浓度在60h达到22．65υg／L。免疫组织化学染色及RT-PCR均检测到人胰岛素样生长因子1的表达。转染后的细胞分裂增殖加快,细胞群体倍增时间缩短,S期细胞比例增多。证实人胰岛素样生长因子1基因可有效转染脂肪源性干细胞并表达人胰岛素样生长因子1蛋白质,同时可促进细胞增殖。     

脂质体转染反义脱氧寡核苷酸对K562细胞α珠蛋白基因表达及细胞增殖的影响

本研究查明脂质体转染反义脱氧寡核苷酸(ASON)对K562细胞α珠蛋白基因表达的抑制作用及对细胞增殖的影响,探讨基因调控治疗β地中海贫血的新思路。设计合成靶向α珠蛋白基因的ASON,并与正义寡核苷酸(SON)和空白对照进行比较。采用脂质体转染技术将ASON、SON与K562细胞共同培养,用荧光显微术、流式细胞术检测脂质体转染效率,用实时荧光定量RT-PCR法检测K562细胞中α珠蛋白基因表达情况,并通过Cell Counting Kit-8(CCK-8)法观察脂质体转染ASON技术对细胞增殖的影响。结果表明:脂质体转染效率在ASON作用24h达到最高,脂质体转染ASON组的α珠蛋白基因表达水平显著低于SON和空白对照组(p<0.01),并对细胞的增殖有明显的抑制作用,上述效应呈浓度依赖性。结论:脂质体转染ASON能特异性的抑制K562细胞中α珠蛋白基因表达,可能会成为β地中海贫血基因治疗的一个新靶点。     

靶向survivin基因不同位点的siRNA对PC-3细胞增殖和凋亡的影响

目的观察靶向survivin基因不同位点的小干扰RNA（siRNA）对人雄激素非依赖性前列腺癌PC-3细胞survivin mRNA表达的抑制作用以及对细胞增殖和凋亡的影响。方法根据survivin mRNA的结构特点,选取2个不同的作用位点,设计和构建负载survivin shRNA片段的2种重组质粒载体。以脂质体法转染PC-3细胞株,荧光显微镜下观察转染效率。实验分为survivin 1组、survivin 2组、阴性对照组和空白对照组。转染后24、48和72h,用半定量逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）检测细胞中survivin mRNA的表达,MTT法检测siRNA对PC-3细胞增殖的影响,流式细胞术检测凋亡率。结果与对照组相比,survivin 1组、survivin 2组对survivin mRNA的表达均能产生抑制效应,48h抑制率最高,survivin 1抑制率高,达52％。实验组均能抑制PC-3细胞的增殖,survivin 1抑制细胞增殖的能力强。转染48h后,细胞凋亡最明显,survivin 1组凋亡率高,达13．6％±1．8％。结论在RNAi研究巾,根据特定靶基因mRNA的结构特点来进行siRNA的设计和筛选,在前列腺癌的基因治疗中具有一定的实际应用价值。