穿龙薯蓣ISSR-PCR反应体系的优化及引物筛选

目的建立穿龙薯蓣ISSR-PCR扩增的稳定体系。方法利用单因素及正交试验设计的方法对影响穿龙薯蓣ISSR-PCR扩增效果的d NTPs浓度、引物浓度、模板DNA用量Taq DNA聚合酶用量、Mg~(2+)浓度进行优化。结果穿龙薯蓣的ISSR-PCR的20μl最佳反应体系为:2.0μl 10×Taq Buffer,2.0 mmol/L Mg~(2+),0.225mmol/L d NTPs,1.5 UTaq DNA聚合酶,1.0μmol/L引物,2.0 ng/μl DNA模板,dd H2O补齐。应用该反应体系筛选出来适用于穿龙薯蓣ISSR扩增的12条引物,并确定了各引物的最佳退火温度。结论确立了一个适用于穿龙薯蓣ISSR-PCR扩增的体系。     

水母雪莲ISSR-PCR反应体系优化及引物筛选

目的优化并建立适合于水母雪莲的ISSR-PCR反应体系并筛选出稳定的ISSR引物。方法采用L16(45)正交设计方法,以Taq DNA聚合酶浓度、d NTP浓度、模板DNA浓度、引物浓度、Mg~(2+)浓度5种因素4个水平对水母雪莲ISSRPCR反应体系进行优化;并对反应体系进行验证。采用优化后的反应体系筛选出条带清晰且稳定的ISSR引物,通过退火温度梯度试验确定最佳退火温度。结果最终确立了水母雪莲20μl ISSR-PCR最佳反应体系,即包含Taq DNA聚合酶0.7U、d NTP 0.125mmol/L、引物0.3μmol/L、模板DNA 40ng、Mg~(2+)1.5mmol/L。在此基础上,从84条ISSR引物中筛选出条带清晰且稳定的8条引物,并通过梯度PCR反应确定最佳退火温度。结论经过11份水母雪莲种质验证,证明所建立的体系稳定可靠,可用于后续水母雪莲遗传多样性分析和种质资源鉴定。     

桔梗ISSR反应体系的建立和优化

目的建立并优化桔梗ISSR-PCR反应体系和扩增程序。方法采用正交试验和单因子试验,对ISSR反应体系主要因子(dNTPs、Taq酶、引物、Mg2+、模板)进行筛选。之后通过单因子试验,进行引物退火温度、循环次数的筛选。结果桔梗ISSR-PCR的最佳反应体系(20μl)为:dNTPs 0.25mmol/L、Taq酶1.0U、引物0.30μmol/L、Mg2+1.50mmol/L、模板DNA10ng。利用此反应体系从54条引物中筛选出12条扩增稳定、多态性丰富的ISSR引物,确定了引物UBC853[序列为(TC)8RC]的最佳退火温度为55℃和循环次数为45次。结论建立的桔梗ISSR-PCR反应体系,经过白、紫花桔梗共20份样品检验,证明该体系具有稳定性和可靠性,可用于桔梗遗传多样性研究。     

正交设计优化翼梗五味子ISSR-PCR反应体系

目的对影响翼梗五味子ISSR-PCR扩增反应的各因素进行优化,建立稳定的反应体系。方法基于正交极差分析方法,以Taq酶、Mg2+、模板DNA、dNTP和引物5因素4水平的正交试验对翼梗五味子ISSR-PCR反应体系进行优化。结果翼梗五味子ISSR-PCR的最佳反应体系(20μL)为:Taq酶1.00 U、Mg2+1.50 mmol/L、模板DNA 40.00 ng、dNTP 0.25mmol/L、引物0.50μmol/L。筛选出12条扩增稳定、多态性丰富的ISSR引物,并确定了每个引物的最佳退火温度。结论所建立的翼梗五味子ISSR反应体系具有标记位点清晰、反应系统稳定、重复性好等优点,为翼梗五味子的分子水平研究提供实验依据。     

夏枯草ISSR分子标记技术的建立与体系优化

目的 建立并优化夏枯草ISSR-PCR反应体系和扩增程序.为探讨夏枯草种质问遗传多样性奠定基础.方法 采用单因子试验和正交设计方法,研究.Mg2+、dNTP、引物、Taq DNA聚合酶、模板DNA、退火温度及循环次数对PCR扩增的影响.结果 夏枯草ISSR-PCR的最佳反应体系为:在20 μL的反应体系中含模板DNA 30ng,Mg2+ 2.2 mmol/L、dNTP 175 μmol/L、引物0.75μmol/L、Taq DNA聚合酶1.0 U.在此基础上,从92条引物中筛选出18条扩增稳定、多态性丰富的ISSR引物.并通过梯度PCR试验.确定引物最佳退火温度.结论 采用单因子试验和正交设计方法可以快速建立ISSR-PCR反应体系,经过24份夏枯草种质检验,证明该体系稳定可靠,可用于夏枯草遗传分析.     

天门冬ISSR分子标记技术的建立与体系优化

目的建立并优化天门冬ISSR-PCR反应体系和扩增程序,为探讨天门冬种质间遗传多样性提供依据。方法采用单因子试验和正交设计法,研究Mg2+、dNTP、引物、Taq DNA聚合酶、模板DNA、延伸时间及循环次数对PCR扩增的影响。结果天门冬ISSR-PCR的最佳反应体系为25μL的反应体系中含模板DNA 40 ng、Mg2+1.25 mmol/L、dNTP 320μmol/L、引物1.2μmol/L、Taq DNA聚合酶1.5 U。在此基础上,从50条引物中筛选出13条扩增稳定、多态性丰富的ISSR引物,并通过梯度PCR试验,确定引物最佳退火温度。结论建立的天门冬ISSR-PCR反应体系,经过17份天门冬种质检验,证明该体系稳定可靠,可用于天门冬遗传分析。     

麻花秦艽ISSR-PCR反应体系的建立与优化

目的:建立麻花秦艽的简单重复序列区间-聚合酶链反应(ISSR-PCR)最佳反应体系,为该药材的种质鉴定及遗传多样性等研究提供参考。方法:运用单因素试验和正交试验优选麻花秦艽的ISSR-PCR反应体系中DNA模板用量,Mg2+浓度,dNTPs浓度,TaqDNA聚合酶用量和引物浓度等参数,确定麻花秦艽每条引物的最佳退火温度。结果:ISSR-PCR最佳反应体系(20μL)为模板DNA1μL(36mg·L-1),10×PCR缓冲液(含Mg2+)1.75μL(20mmol·L-1),dNTPs0.8μL(10mmol·L-1),Taq酶0.1μL(0.5%)及引物0.6μL(10mmol·L-1);筛选出12条多态性高、扩增稳定的ISSR引物,UBC-809引物的最佳退火温度55.5℃。扩增出的7条带中多态性带为6条,多态性位点比率85.71%。结论:建立的麻花秦艽ISSR-PCR反应体系稳定可靠,位于500bp处的条带为非多态性条带,可作为该种属的特征性条带。     

三桠苦ISSR反应体系的优化与引物筛选

目的构建三桠苦ISSR反应体系,为三桠苦种质资源遗传多样性分析及分子鉴定奠定基础。方法通过设定影响三桠苦ISSR-PCR反应诸因子的不同梯度,检测不同反应体系的扩增效果,对条件进行优化,并筛选引物及退火温度,建立三桠苦ISSR-PCR最适反应体系,并用23个不同三桠苦样品验证体系稳定性。结果首次建立了三桠苦ISSR最佳反应体系(25μl):Master Mix 12.5μl(Mg2+浓度4 mmol/L,d NTP浓度0.4mmol/L)、引物0.6μmol/L、模板DNA 20ng。利用该体系从60条ISSR引物中筛选出了扩增条带清晰、多态性好的12条引物。结论所建立的三桠苦ISSR反应体系稳定可靠、标记位点清晰、检测多态性能力强,这一体系的建立及引物筛选可应用于三桠苦种质资源评估及遗传多样性分析的研究。     

正交设计优化地枫皮ISSR-PCR反应体系

目的 建立稳定性高、重现性好,适合地枫皮遗传差异分析的ISSR-PCR反应体系.方法 利用正交试验设计,对地枫皮ISSR-PCR反应的5个因素(Mg2+、dNTPs、引物、Taq酶和模板DNA浓度)进行优化,PCR结果用SPSS统计软件分析,在此基础上对PCR反应过程中的退火温度和循环次数进行梯度检测.结果 大部分因素的不同水平对PCR反应有显著影响,其中Taq酶影响最大;地枫皮ISSR-PCR最佳反应体系(20 μL)为:Mg2+ 1.60 mmol/L、dNTP 0.22 mmol/L、引物0.90 μmol/L、Taq酶0.50 U、模板DNA 70.00 ng;最佳退火温度和循环次数分别为51.8℃和40次;从62条引物中筛选出13条扩增稳定、多态性丰富的ISSR引物.结论 建立的地枫皮ISSR-PCR反应体系,经过16份地枫皮样品检验,证明该体系稳定可靠,可用于地枫皮遗传差异分析.     

蒲公英ISSR-PCR反应体系及扩增程序的建立与优化

目的:优化蒲公英ISSR-PCR反应体系及扩增程序;筛选适合的引物,并确定最佳退火温度.方法:采用CTAB法提取蒲公英叶片的DNA,利用正交试验设计,从Taq酶MIX、模板DNA、引物3种因素2个水平,对蒲公英ISSR-PCR反应体系进行考察;采用单因素实验对其扩增程序进行优化.结果:确立了适合于蒲公英的最佳ISSR-PCR反应方法,即在25 μL反应体系中,内含Taq酶MIX 15 μL(1.25 UTaq DNA聚合酶,1.8 mmol·L-1 Mg2+,dNTPs各0.24 mmol·L-1),0.3 μmol·L-1引物,5 ng模板.在此基础上,从50条引物中筛选出16条扩增稳定、多态性丰富的ISSR引物,并通过梯度PCR试验,确定引物最佳退火温度.结论:采用单因子试验和正交设计方法可以快速建立ISSR-PCR反应体系,经过验证,证明该体系稳定可靠,可用于蒲公英遗传分析.     

柴胡ISSR—PCR反应体系的建立与优化

目的建立适于柴胡ISSR分析的PCR反应体系；筛选适宜引物，并确定最佳退火温度。方法CTAB法提取叶片DNA，通过单因子实验分别找出合适的ISSR-PCR反应条件，利用梯度PCR确定引物最佳退火温度。结果适于柴胡ISSR分析的PCR反应体系为25μl总体积中含有1×Taq酶缓冲液，2．0mmol／L MgCl2，各0．15mmol／L的dNTPs，0．3μmol／L引物，1．5U Taq酶（上海生工），20ng模板DNA，2％去离子甲酰胺。在100条引物中筛选出30条扩增条带清晰且条带数目较多的引物，最佳退火温度为49．9～63．6℃（因引物不同而异）。结论建立了柴胡ISSR—PCR反应体系，筛选出30条引物并确定了最佳退火温度，为应用ISSR技术鉴定柴胡种质资源、分子标记辅助选择育种及其遗传多样性研究奠定了基础。     

金槐ISSR-PCR反应体系的优化和引物筛选

目的优化和建立稳定的金槐ISSR-PCR反应体系并筛选出稳定的ISSR-PCR引物。方法采用L16(45)正交设计方法,以dNTP、Tap酶、ISSR引物、Mg~(2+)浓度和模版DNA 5个影响因素进行4水平优化试验,并对反应体系进行验证;采用优化所得的最佳反应体系进行引物筛选。结果确立了金槐的最佳ISSR-PCR反应体系:即在25μl总体积反应体系中包含10×Buffer2.5μl,MgCl22.5mmol·L~(-1),ISSR引物0.6μmol·L~(-1),dNTPs0.25mmol·L~(-1),Taq酶1.0U,模板DNA约50ng。通过最佳体系进行引物筛选,获得11条适宜金槐扩增的ISSR引物。结论经过12份金槐样品的验证,证明所建立的体系稳定可靠,可用于金槐遗传多样性、指纹图谱和标记辅助育种等方面的研究。     

水蛭ISSR-PCR反应体系的建立及优化

目的 建立并优化水蛭ISSR-PCR反应体系及扩增程序,为水蛭进行遗传多样性研究提供依据.方法 使用引物ISSR825,采用正交优化方法对影响PCR反应的Mg2+、dNTP、引物、TaqDNA聚合酶、模板DNA进行了体系优化,同时对引物的最佳退火温度进行了选择.结果 在25 μL总体积中,其中包括10×PCR缓冲液2.5 μL、Mg2+ 2.0 mmol/L、dNTP0.25 mmol/L、引物0.8 μmol/L、Taq DNA聚合酶2.5 U、模板DNA 2.0 ng/μL,最佳退火温度为49.7℃.结论 所建立的最佳ISSR-PCR反应体系稳定可靠,可用于水蛭遗传多样性评价、不同种源鉴定及亲缘关系分析.     

辽细辛和北马兜铃ISSR-PCR的引物筛选及反应体系的建立与正交优化

目的探寻适合细辛和马兜铃品种鉴定的ISSR引物。方法利用一个品种对全部100条ISSR引物设置退火温度进行梯度实验,筛选出重复性好、条带清晰的引物5条,从理论上讲,这些筛选的引物可以实现对现有辽细辛和北马兜铃品种的鉴定。马兜铃属ISSR-PCR的引物筛选,利用正交试验设计的方法,从Taq DNA聚合酶浓度、Mg~(2+)浓度、dNTP浓度、引物浓度,这4种因素3个水平,对马兜铃属ISSR-PCR反应体系进行优化分析,并在此基础上对模板DNA浓度、PCR反应过程中的退火温度进行梯度检测。结果从样品中筛选出优选引物,细辛UBC815、UBC826、UBC862、UBC868、UBC888;马兜铃UBC825、UBC827、UBC836、UBC846、UBC848。反应体系的稳定性进行检测结果均稳定可靠。结论得到马兜铃的最佳组合,即20μL ISSR-PCR反应体系中含0.25 Lmol/L引物、1.5 mmol/L Mg~(2+)、1×PCR buffer、150 Lmol/L dNTP和0.5 UTaqDNA聚合酶。PCR反应条件为94℃预变性5 min,以30个循环94℃变性30 s,50℃退火1 min,72℃延伸1 min,最后以72℃延伸10 min。得到细辛的最佳组合,20μL ISSR-PCR反应体系中含0.50 Lmol/L引物、1.5 mmol/L Mg~(2+)、2×PCR buffer、250 Lmol/L dNTP和2.0 UTaqDNA聚合酶;同时得到最佳模板DNA浓度为10 ng,最佳退火温度为50℃。     

羌活和宽叶羌活简单重复序列区间扩增反应体系的正交优化

目的通过探讨羌活和宽叶羌活ISSR实验中各种因素的影响,以建立羌活和宽叶羌活的简单重复序列区间扩增(ISSR-PCR)最佳反应体系。方法利用正交实验设计L9(34)对羌活和宽叶羌活ISSR-PCR反应体系的4因素(Mg2 ,dNTP,引物,Taq酶)在3个水平上进行优化实验,PCR结果用SPSS13.0统计软件分析,并设置梯度PCR进行引物退火温度筛选。结果在20μl ISSR-PCR反应体系中,各组分的最适浓度为:2.0 mmol/L Mg2 ,250μmol/L dNTPs,0.50μmol/L引物,1UTaq酶,40 ng DNA模板;模板DNA40~90 ng,不同引物有不同的最佳退火温度,范围在48~52℃。结论该优化体系的建立为进一步进行羌活和宽叶羌活种群间遗传多样性研究提供了参考。     

开口箭ISSR-PCR实验反应体系条件的优化

目的:建立与优化药用植物开口箭ISSR-PCR实验反应体系.方法:以开口箭DNA为材料,分析了Mg2+,dNTP,引物及Taq DNA聚合酶浓度对ISSR-PCR扩增结果的影响.结果:确立了稳定的、可重复的开口箭ISSR最佳反应体系,即在10 μL的PCR反应体系中,含1 × buffer,2 U Taq DNA聚合酶,2 mmol·L-1 MgCl2,0.2 mmol·L-1 dNTP,0.75 μL引物.结论:从80条简单序列重复区间(ISSR)通用引物中筛选出了16条条带清晰稳定的引物,设置了不同的引物退火温度,为进一步进行开口箭的遗传多样性分析的研究奠定了基础.     

三叶青相关序列扩增多态性-聚合酶链式反应体系的建立与优化

目的建立浙江和江西产的三叶青(Tetrastigma hemsleyanum)SRAP-PCR的反应体系和扩增程序。方法应用L9(34)正交设计方法,以三叶青基因组DNA为模板,研究了Mg2+、dNTP、引物和模板DNA 4种PCR反应组分浓度变化对扩增结果的影响,根据梯度PCR仪引物的条带数量及清晰度选择退火温度。结果优化后的25μL反应体系包含:10×PCR buffer2.5μL,2.5mmol/L MgCl2,0.15mmol/Ld NTP,0.15μmol/L引物,1.0U Taq DNA聚合酶,50ng DNA模板。扩增程序的最佳退火温度为51℃。并筛选出8对扩增产物丰富,多态性好的引物。结论正交设计优化的三叶青SRAP反应体系,经过10份样品检验,证明该体系稳定可靠,多态性好,可用于三叶青遗传多样性分析。     

拳卷地钱基因组DNA提取及ISSR-PCR扩增体系优化

目的建立一种拳卷地钱基因组DNA的提取方法;对影响拳卷地钱ISSR-PCR反应的各因素进行优化,建立稳定的反应体系。方法采用改进的CTAB法提取拳卷地钱基因组DNA;以Taq酶、Mg2+、dNTP和引物4因素3水平的正交设计对拳卷地钱ISSR-PCR反应体系进行优化。结果采用改进的CTAB法提取的拳卷地钱基因组DNA质量高,且适用于ISSR-PCR扩增;获得拳卷地钱最佳反应体系(20μl)为:Taq酶0.5 U,Mg2+2.0 mmol/L,dNTP 250μmol/L,模板DNA 50ng,引物0.6μmol/L。结论建立并优化了拳卷地钱总DNA提取方法及ISSR-PCR反应体系。     

濒危药用植物三叶青ISSR分子标记的建立

目的对三叶青的简单重复序列-聚合酶链式反应(ISSR-PCR)体系和扩增程序进行优化,并将其应用于野生三叶青种质资源的遗传分子标记。方法采用单因素试验,对三叶青ISSR-PCR反应条件中的Mg2+、d NTP、引物、模板DNA、Taq DNA聚合酶浓度和退火温度等因素进行筛选,之后结合正交试验来选择多态性高、重复性好的ISSR引物。结果建立了ISSR-PCR最佳反应体系,为25μL反应体系中含有2.5 mmol/L Mg2+、0.2μmol/L引物、0.25mmol/L d NTP、50 ng DNA模板、0.5U Taq DNA聚合酶,并利用U810等16条引物,初步构建了15份三叶青种质资源的ISSR指纹图谱,平均多态条带百分率达57.0%。结论该反应体系的稳定性和多态性良好,可满足对三叶青野生资源的遗传变异水平和结构分析的研究考察。     

阳春砂ISSR-PCR反应体系的建立和优化

目的 建立起适合阳春砂的ISSR-PCR反应体系.方法 综合运用单因素实验和L9(34)正交实验两种方法,对DNA模板、引物、dNTPs、Taq DNA聚合酶等因素进行优化,以及采用温度梯度筛选引物的退火温度.结果 最终获得的阳春砂的最优ISSR-PCR体系为:总体积为20 μl,其中包括10×Ex Taq Buffer(含15 mmol·L-1 Mg2+)2 μl,25 ng DNA模板,0.50 μmol·L-1引物,0.75 mmol·L-1 dNTPs和1.0 U Ex Taq酶.通过温度梯度筛选出引物UBC808的最佳退火温度为52.0 ℃.结论 这一优化体系为阳春砂的ISSR分析奠定了基础.