内切葡聚糖酶高产菌株的诱变选育

【目的】建立里氏木霉(Trichoderma reesei)高产突变菌株的快速筛选方法,选育出高产内切葡聚糖酶的突变株。【方法】对里氏木霉T306菌株的初筛培养基进行优化,建立快速筛选方法;通过紫外诱变手段选育内切葡聚糖酶高产突变菌株,并对突变菌株的产酶培养基进行优化。【结果】在初筛培养基中添加浓度为0.1%(W/V)的乳糖、蛋白胨及脱氧胆酸钠有利于菌株的筛选。诱变后筛选出菌落形态发生明显变化的内切葡聚糖酶高产突变株0516,其羧甲基纤维素酶活力(CMC酶)较出发菌株提高了38.9%。其产酶培养基经优化后,得到最适碳、氮源分别为:乳糖1.50%、硫酸铵0.14%、尿素0.05%、蛋白胨0.10%,优化后CMC酶活力达64.2 U/mL,较优化前提高了2.3倍。【结论】建立了里氏木霉高产突变菌株的快速筛选方法,通过紫外诱变育种获得了产内切葡聚糖酶能力高且遗传稳定的突变株0516。     

核糖体工程技术选育ε-聚赖氨酸高产菌株

【目的】利用核糖体工程技术选育Streptomyces albulus AS3-14的链霉素和利福平双重抗性突变株,以提高其ε-聚赖氨酸合成能力。【方法】通过链霉素抗性筛选,获得链霉素抗性的ε-聚赖氨酸产量提高突变株;在此基础上,继续筛选其利福平抗性突变株,实现链霉素和利福平双重抗性ε-聚赖氨酸高产菌选育。【结果】获得的双重抗性高产突变株Streptomyces albulus WG-608的ε-聚赖氨酸摇瓶产量达到3.7 g/L,5 L发酵罐补料分批发酵ε-聚赖氨酸产量达到53.0 g/L,较出发菌株分别提高了42.3%和32.5%。【结论】链霉素和利福平双重抗性选育能够显著提高ε-聚赖氨酸产生菌Streptomyces albulus的产物合成能力。     

纤维素酶产生菌和糖化酶产生菌液体混合发酵的研究

应用正交试验设计研究了糖化酶高产菌株黑曲霉UV-11(Aspergillus niger UV-11)和纤维素酶高产菌株黑曲霉F_(27)(A.niger F_27)液体混合发酵条件。结果表明,发酵液糖化酶活力为6500U/ml,CMC酶活力为99mg葡萄糖/ml·h。与UV-11单菌发酵相比,糖化酶活力提高16％,CMC酶活力提高266％。     

阿维菌素生产菌的常压室温等离子体诱变育种及培养基优化

【目的】通过诱变筛选技术选育阿维菌素高产突变株,对其发酵培养基进行响应面优化,提高阿维菌素产量。【方法】采用常压室温等离子体(ARTP)诱变技术,结合链霉抗性和卡那霉素抗性筛选法及96深孔板高通量筛选法,筛选阿维菌素高产株。在单因素实验的基础上,应用响应面分析法对其发酵培养基进行优化,最后确定最佳培养基配方。【结果】获得一株遗传性状稳定的阿维菌素高产株K-1A6,其阿维菌素产量达到4.22 g/L,比出发菌株9-39提高了23.4%,在最佳培养基中阿维菌素产量达到5.36 g/L,较优化前提高了27.01%。【结论】通过对阿维链霉菌9-39菌株进行ARTP诱变筛选及发酵培养基优化研究能显著提高阿维菌素的产量。     

常压室温等离子体诱变选育L-精氨酸生产菌及发酵条件优化

【目的】通过常压室温等离子体诱变技术选育L-精氨酸高产菌株,利用响应面设计探索突变菌株生产L-精氨酸的最佳发酵条件。【方法】采用常压室温等离子体生物诱变系统对实验室保藏的Corynebacterium glutamicum GUI089进行系列诱变,选育L-高精氨酸和8-氮鸟嘌呤抗性菌株。在单因子实验的基础上,应用Plackett-Burman设计从7个因素中筛选出对L-精氨酸合成具有显著效应的(NH4)2SO4、葡萄糖和尿素3个因素。基于上述结果,进一步采用响应面设计优化出主要影响因素的最佳参数水平。【结果】经过一系列的诱变和筛选,选育出一株L-高精氨酸(15 g/L)和8-氮鸟嘌呤(0.7 g/L)抗性菌株,并将此菌株命名为C.glutamicum ARG 3-16。此菌株的L-精氨酸产量比出发菌株提高了49.79%,且发酵液中杂酸的浓度明显降低,特别是L-脯氨酸、L-谷氨酸和L-缬氨酸。在经响应面优化后的最佳发酵条件下,L-精氨酸的产量达到39.72±0.75 g/L,比优化前提高了10.49%。【结论】通过常压室温等离子体诱变技术成功选育出一株L-精氨酸高产菌株,利用响应面法有效地优化了发酵条件,实验结果表明突变株ARG 3-16具有潜在的生产应用价值。     

常压室温等离子体-紫外复合诱变选育β-法尼烯高产菌株

【背景】大肠杆菌(Escherichia coli)由于生长性能优良、遗传背景清楚、遗传操作手段成熟,是合成β-法尼烯的合适生产菌,但其合成β-法尼烯的产量目前仍不能满足工业化生产的需求。【目的】通过诱变筛选技术选育β-法尼烯高产突变株。【方法】采用常压室温等离子体(atmosphericand room temperature plasma,ARTP)诱变技术和紫外线照射对出发菌株大肠杆菌EC-16进行复合诱变,并以异戊烯焦磷酸耐受性为选择压力进行平板初筛,之后进行摇瓶复筛,最后进行发酵罐验证。通过连续多代培养筛选到的高产突变菌株,观察其遗传稳定性。【结果】经复合诱变选育筛选出一株β-法尼烯高产突变株E.coliHVK-9,其产量高达22.1g/L,相比出发菌株提高了168.74%。【结论】采用ARTP-紫外复合诱变,再结合异戊烯焦磷酸抗性筛选的集成方法,使得诱变菌株的正突变率大大提高,可以有效地提高诱变菌株的β-法尼烯产量。突变株HVK-9作为工业化发酵生产菌种具有较好的遗传稳定性,为β-法尼烯的工业化生产和应用奠定了良好的基础。     

黑曲霉a-鼠李糖苷酶高产菌株的选育

本文首次报道利用Davis方法制备的透明圈法筛选α-鼠李糖苷酶高产菌株。用甲基磺酸乙酯对出芽8 h的黑曲霉孢子进行诱变处理, 用透明圈法初筛出的菌株中, 产量提高40%以上的突变菌株占11%; 用摇瓶培养对初筛出的菌株进行两轮复筛α-鼠李糖苷酶高产突变株T-226, 摇瓶培养α-鼠李糖苷酶活达373.4 U/mL, 比出发菌株提高了22.7%。对该高产突变株进行5 L罐发酵实验, 发酵84 h测得α-鼠李糖苷酶活为631.9 U/mL。用新建立的方法选育高产α-鼠李糖苷酶的高产菌株, 不仅具有较高的筛选效率, 还具有良好的准确性。     

黑曲霉α-鼠李糖苷酶高产菌株的选育

本文首次报道利用Davis方法制备的透明圈法筛选α-鼠李糖苷酶高产菌株.用甲基磺酸乙酯对出芽8 h的黑曲霉孢子进行诱变处理,用透明圈法初筛出的菌株中,产量提高40%以上的突变菌株占11%;用摇瓶培养对初筛出的菌株进行两轮复筛α-鼠李糖苷酶高产突变株T-226,摇瓶培养α-鼠李糖苷酶活达373.4 U/mL,比出发菌株提高了22.7%.对该高产突变株进行5 L罐发酵实验,发酵84 h测得α-鼠李糖苷酶活为631.9 U/mL.用新建立的方法选育高产α-鼠李糖苷酶的高产菌株,不仅具有较高的筛选效率,还具有良好的准确性.     

黑曲霉菌株柠檬酸合成酶基因的敲除及功能分析

【背景】柠檬酸合成酶是碳代谢途径的中心酶,其在三羧酸循环(tricarboxylic acid cycle,TCA)、氨基酸合成和乙醛酸循环中发挥着重要作用,是柠檬酸合成的关键酶。本论文所选用的是一株高产柠檬酸的黑曲霉菌株CGMCC10142。【目的】克隆柠檬酸合成酶关键基因,构建柠檬酸合成酶的敲除菌株并鉴定其在黑曲霉菌株高产柠檬酸过程中的功能及影响。【方法】采用根癌农杆菌转化方法并利用同源重组原理,采用抗性筛选和致死型反向筛选的双重筛选方法获得正确敲除株。对转化子在不同碳源下的生长情况进行观察并对柠檬酸发酵过程中菌丝球变化和产酸量进行分析,最后通过荧光定量PCR分析柠檬酸合成酶基因对黑曲霉积累柠檬酸的影响,及其对主要代谢途径中重要酶相关基因和其他的表达量的影响。【结果】以柠檬酸高产菌株黑曲霉CGMCC10142为出发菌,构建一株遗传稳定的柠檬酸合成酶敲除的菌株T1-2。结果发现该菌株在以葡萄糖为碳源的培养基上生长缓慢并且产生孢子量减少。通过摇瓶发酵产酸实验,结果表明敲除菌在84 h产酸量为64.3 g/L,相对于出发菌的98.7g/L降低了34.85%。通过荧光定量PCR发现柠檬酸合成酶的表达量是下降的,同时重要酶的表达量都下降。【结论】该菌株的柠檬酸合成酶基因对柠檬酸积累具有重要作用,但存在其他同工酶基因,该基因敲除仅使产酸合成降低34.85%,同时发现该柠檬酸合成酶的顺畅表达有助于主代谢途径中各关键酶的高效表达,本研究可为研究黑曲霉高产柠檬酸机理奠定基础。     

黑曲霉原生质体诱变选育β-葡萄糖苷酶高产菌株

本研究报道了以原生质体诱变技术选育高产β-葡萄糖苷酶的黑曲霉菌株,并研究了其发酵特性。以黑曲霉CGMCC3.316为出发菌株,通过紫外诱变得到突变株3-3M。然后以3-3M为供试菌株,研究了其原生质体制备与再生的条件。最后通过原生质体诱变,选育得到一株β-葡萄糖苷酶活力较高的突变株60B-3D。该菌株具有良好的遗传稳定性,酶活力平均达到23IU/mL,与出发菌株CGMCC3.316相比提高39%。此外,该菌株的木聚糖酶活力也有所增加。同时考察了黑曲霉60B-3D的发酵特性,并与3-3M和出发菌株进行比较,结果表明该菌株有较高的蛋白分泌能力。本研究为发酵生产β-葡萄糖苷酶提供了一株良好的供试菌株。     

发酵产泡性能降低的解脂耶氏酵母菌株的获得及其评价

微生物发酵过程中泡沫的产生是发酵领域遇到的共性问题。在不影响发酵性能的前提下抑制菌株的产泡,对简化操作以及降低发酵成本具有较为重要的意义。解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica,之前称为Candida lipolytica)是一种常用的合成生物学底盘,也是合成赤藓糖醇等功能糖醇的生产菌株。但在发酵合成赤藓糖醇的过程中会产生大量的泡沫,需要添加消泡剂以消除泡沫。【目的】本研究旨在开发一种产泡能力显著降低的解脂耶氏酵母新菌株,以减少赤藓糖醇发酵过程中消泡剂的添加。【方法】本研究利用解脂耶氏酵母中非同源靶向重组占支配地位的原理,采用一段外源DNA随机插入基因组的手段,随机突变基因组,改变菌株的发酵产泡性能,使突变株在发酵过程中不产泡或者降低其产泡的能力。【结果】通过筛选,获得一株在发酵过程中产泡性能显著降低的工程菌株,该菌株在保留高效合成赤藓糖醇性能的同时,显著降低了泡沫的产生。【结论】所获得的菌株对工业发酵合成赤藓糖醇具有较为重要的意义,也为控制其他微生物发酵过程中泡沫的生成提供了思路。     

核桃黑斑病生防链霉菌YNF36的鉴定及其抑菌活性测定

【背景】由野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris)和成团泛菌(Pantoea agglomerans)侵染引起的核桃黑斑病是一种严重的细菌性病害,给核桃产业带来了极大损失。【目的】从根际土壤中筛选出对核桃黑斑病病原菌野油菜黄单胞菌和成团泛菌均具有拮抗效果的放线菌菌株,可作为创制生防菌剂的出发菌株。【方法】采用稀释涂布法、平板对峙法和改良牛津杯法筛选拮抗菌株,通过形态学特征、生理生化特性和16S rRNA基因序列分析进行鉴定,测定无菌发酵液抗菌谱,离体叶片试验验证其对核桃黑斑病的防治效果。【结果】筛选到一株对2种病原菌均有较强拮抗作用的放线菌菌株YNF36。经形态学特征观察、生理生化特性试验及16S rRNA基因序列分析,将菌株YNF36鉴定为沙场链霉菌(Streptomyces arenae)。该菌株在SYP培养基上产量最高,抑菌活性最强,其无菌发酵液对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、黑曲霉、白色念珠菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、蜡样芽孢杆菌这7种指示菌,以及链格孢菌、黑腐皮壳菌、胶孢炭疽菌、灰葡萄孢菌、黄褐孢霉菌、辣椒刺盘孢菌、腐皮镰孢菌这7种植物病原菌均有抑制作用,抗菌谱广。发酵液原液对离体叶片上的由野油菜黄单胞菌和成团泛菌造成的核桃黑斑病防效分别为75.69%和62.39%。【结论】沙场链霉菌YNF36补充了一种防治核桃黑斑病的生防材料,具有良好的开发价值和应用前景。     

基于DNA高通量测序分析生料酿醋过程中的真菌多样性

【目的】了解生料酿醋不同阶段的真菌群落结构及其变化规律,为生料酿醋工艺优化提供理论指导。【方法】从山西一家生料酿醋企业采集原料、麸曲、发酵缸醋醅、熏醋样、淋醋样等涉及生料酿醋各阶段的样品共51份,扩增真菌ITS1区序列并利用高通量测序技术分析真菌多样性。【结果】除5份样品未扩增成功外,在剩余46份样品中共检测到489个真菌OTU,以子囊菌为主(占88.3%)。原料、麸曲、发酵缸醋醅、熏醋样、淋醋样等不同组别间在真菌群落结构方面存在显著差异。原料和麸曲中的真菌物种丰富度最低,发酵缸醋醅的真菌物种丰富度最高,熏醋样和淋醋样中的真菌物种丰富度又有所降低。原料和麸曲中的优势真菌分别为酿酒酵母和黑曲霉,是发酵阶段真菌的重要来源,但发酵缸醋醅中也检测到大量可能来源于发酵室环境的真菌。发酵缸醋醅在不同发酵时期间也存在明显的真菌群落结构差异,并可据此划分成发酵前期(包括发酵第2–13天的样品)和发酵后期(包括发酵第17–46天的样品)。酿酒酵母和亮白曲霉的丰度在发酵前期显著高于发酵后期,而黑曲霉、一种小戴卫霉科真菌等的丰度在发酵后期显著高于发酵前期。【结论】生料酿醋的不同阶段和发酵缸醋醅发酵的不同时期,其真菌群落结构都存在明显差异。酿酒酵母和黑曲霉是发酵阶段的优势真菌。本研究为生料酿醋工艺优化提供了理论依据。     

一株链霉菌21-1的分离鉴定及其对禾谷镰刀菌的抑菌活性

【背景】由禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)引起的小麦赤霉病严重威胁我国的小麦生产。【目的】筛选对禾谷镰刀菌具有拮抗能力的链霉菌菌株,为生防菌剂开发提供理论基础。【方法】利用平板对峙法筛选对禾谷镰刀菌具有拮抗能力的链霉菌;通过形态特征、生理生化特征和16S rRNA基因序列分析对其进行鉴定;通过病原菌菌丝生长、孢子产生及萌发抑制试验分析其发酵液的抑菌活性;利用人工接种试验测定该菌株发酵液的防病效果。【结果】筛选到一株对禾谷镰刀菌具有较强拮抗活性的链霉菌21-1,抑菌率为59.5%。依据形态特征、生理生化特性和16S rRNA基因序列分析,将该菌株鉴定为黄三素链霉菌(Streptomycesflavotricini)。菌株21-1发酵液能够抑制禾谷镰刀菌的菌丝生长、孢子产生及萌发过程,而且可以降低禾谷镰刀菌菌丝中可溶性蛋白质的含量,并增加丙二醛的含量。菌株21-1可以产生蛋白酶及纤维素酶。菌株21-1菌液10倍稀释液对小麦赤霉病的防效最佳,为70.1%。此外,菌株21-1发酵液对其他8种植物病原菌均有较好的抑制作用。【结论】菌株21-1对禾谷镰刀菌有较好的抑菌活性,具...     

Nisin高产菌株的高通量筛选

【目的】乳酸链球菌素(nisin)是一种天然生物活性抗菌肽,对包括食品腐败菌和致病菌在内的许多革兰氏阳性菌具有强烈的抑制作用,而用作食品的防腐剂。本研究通过建立高通量筛选方法,实现高效快速省力的高产菌株筛选,为工业上筛选高产菌株提供研究方案。【方法】通过对Lactococcus lactis ATCC11454菌株进行紫外诱变,获得2511株突变株。利用Biomek FXP自动工作站建立96微孔板的高通量筛选方法,突变株经高通量挑选、菌种培养及菌液稀释后,加入到生长至对数中期的藤黄微球菌中,采用改进后的比浊法快速检测nisin生物活性。用此方法对突变株进行初筛、复筛后可得到nisin高产菌株,并通过摇瓶发酵评估高通量筛选方法。【结果】确定比浊法检测的条件为:nisin活性稀释在10–25 IU/m L范围内,与藤黄微球菌反应2 h后检测藤黄微球菌的菌体量(OD600)。2511株突变株经过2轮高通量筛选,最终获得约50株产量提升的菌株,对其中8株进行摇瓶精确测量,显示产量均有提高,并且其中一株产量提升了30%,成功建立了高通量筛选nisin高产菌株的方法。【结论】利用比浊检测法,在其基础上成功建立高通量筛选高产nisin菌的方法,经过初筛复筛,整个周期由1人耗时5 d即可完成2511株突变株的筛选工作。相较于传统的选育方法,高通量筛选具有快速、稳定、高效的特点,提高了筛选效率,缩短了选育周期,是工业上筛选高产nisin菌的有效手段。     

辣椒溶杆菌X2-3 LC_Clp转录因子功能分析

辣椒溶杆菌(Lysobacter capsici) X2-3是从小麦根际分离的一株对多种病原真菌和卵菌有抑菌活性的菌株,目前对该菌株产生的抗菌物质及其产生调控机制尚不明确。【目的】明确转录因子LC_Clp对该菌株抗菌物质产生的调节作用,为深入了解L. capsici X2-3的生防机制提供依据。【方法】从转座子EZ-Tn5随机插入突变体库中筛选获得X2-3的LC_clp基因突变体M356,通过恢复性克隆获得功能互补菌株,分析LC_clp基因在拮抗活性、胞外酶分泌以及调控基因表达方面的差异。【结果】与X2-3相比,M356对测试病原真菌、卵菌的抑菌活性和产生体外抗菌物质的能力完全丧失,蛋白酶和纤维素酶产生量明显减少,几乎不产几丁质酶;所检测的转录调节因子、次生代谢及胞外酶等相关基因的表达量均显著低于野生株X2-3,而互补菌株MCS28和X2-3水平相当。【结论】LC_Clp不仅与菌株的抗菌物质合成及抑菌活性有关,还影响胞外酶的产生,并调控多种基因的表达,具有广泛的调节作用。     

解淀粉芽孢杆菌诱变育种及其突变株在降低酱油中氨基甲酸乙酯的应用

【目的】通过诱变育种提高解淀粉芽孢杆菌JY06利用精氨酸的能力,并将其用于降低酱油中的氨基甲酸乙酯及前体,从而提高酿造酱油的安全性。【方法】采用等离子诱变和紫外诱变两种诱变育种方法对解淀粉芽孢杆菌JY06进行突变,应用高通量筛选手段获得具有高精氨酸利用能力的突变株,验证突变株降低酱油中氨基甲酸乙酯的能力。【结果】获得了12株精氨酸利用能力提高的突变株,与出发菌株JY06相比,突变株C12和E6可使酱油中瓜氨酸含量分别降低了15.6%和14.7%,EC的含量分别降低了19.3%和13.1%。【结论】通过等离子诱变和紫外诱变进一步提高了解淀粉芽孢杆菌JY06降低酱油中EC及其前体瓜氨酸的能力,具有控制或减少酱油中生物危害物的应用潜力。     

应用竞争力指数分析III型效应子SKWP对青枯菌在寄主植物体内增殖能力的影响

[目的]研究Ⅲ型效应子SKWP对青枯菌OE1-1在寄主植物体内增殖能力的影响。[方法]构建青枯菌RK7197（野生型突变体,带Gm抗性）和SKWP单基因缺失突变体（带PB抗性）,通过竞争力指数分析SKWP各效应子对青枯菌OE1-1在叶片组织内增殖能力的影响。[结果]竞争力指数适合在寄主植物茄子上分析各效应子功能,6个SKWP效应子对OE1-1细菌增殖能力影响不同,SKWP4影响最明显。[结论]竞争力指数可提供一个新视野来分析SKWP各效应子对青枯菌OE1-1在寄主茄子上增殖能力的影响。     

双功能尿苷酰转移/去除酶GlnD在谷氨酸棒杆菌JNR中的功能

【目的】通过改造谷氨酸棒杆菌JNR中双功能尿苷酰转移/去除酶GlnD,减弱尿苷酰去除酶的活性,增强NH_4~+的转运和利用,提高L-精氨酸的合成。【方法】本文对来源于谷氨酸棒杆菌的突变菌株JNR中的双功能尿苷酰转移/去除酶GlnD进行整合突变,采用同源重组的方法将H_(414)和D_(415)位点突变为两个丙氨酸AA,在此菌株的基础上过量表达PII蛋白GlnK,并对其进行尿苷酰化研究,离子色谱检测摇瓶发酵过程中NH4+的浓度,并对最终的改造菌株进行连续流加发酵分析。【结果】该双功能尿苷酰转移/去除酶在谷氨酸棒杆菌中成功进行整合突变,有效减弱了尿苷酰去除酶的活性;同时过表达PII蛋白GlnK,其酰基化程度明显增强。摇瓶发酵结果表明菌株L4消耗NH_4~+增加,L-精氨酸产量为36.2±1.2 g/L,比对照菌株L3高出22.7%。5-L发酵罐实验结果显示改造菌株L4的L-精氨酸的产量为52.2 g/L,较野生型菌株L0提高了25.3%。【结论】谷氨酸棒杆菌合成L-精氨酸的过程中氮源是必不可少的。减弱GlnD尿苷酰去除酶的活性后,胞内尿苷酰化的GlnK-UMP增加,GlnK-UMP与氮转录调控因子AmtR结合,转运至胞内的NH_4~+浓度提高,促使L-精氨酸产量显著提高。     

枯草芽胞杆菌异戊二烯酶ComQ的生物信息学分析及对生物膜形态的影响

[目的]枯草芽胞杆菌ComQ是一种类异戊二烯生物合成酶.利用生物信息学预测分析了ComQ的生物学特性,对comQ基因进行过表达和敲除,构建突变菌,孔板发酵培养验证生物膜形态变化.[方法]运用NCBI (National Center for Biotechnology Information)网站里的Protein数据...