益气除痰方对缺氧人脐静脉内皮细胞迁移和侵袭能力的影响

目的探讨益气除痰方(YQCTF)对缺氧人脐静脉内皮细胞(HUVEC)迁移和侵袭能力的影响及其机制。方法采用氯化钴(Co Cl2)化学诱导建立细胞缺氧模型,加入不同浓度YQCTF干预,设HUVEC常氧(Norm)组,缺氧造模(Hyp)组,缺氧+YQCTF低、中、高剂量(L、M、H)组。采用噻唑蓝(MTT)比色法检测HUVE活力;流式细胞术检测细胞周期;划痕实验测定细胞修复迁移能力;Transwell小室实验测定细胞侵袭能力;Western Blot法检测缺氧诱导因子1α(HIF-1α)、葡萄糖调节蛋白78(GRP78)、细胞外调节蛋白激酶(ERK)、粘着斑激酶(FAK)、p-ERK、p-FAK的蛋白水平;qPCR法检测HIF-1α、GRP78、ERK1、ERK2、FAK的mRNA表达水平。结果 Norm组与Hyp组比较,Hyp组HUVEC无明显细胞增殖(P0.05),但细胞迁移和侵袭能力增强(P0.05),上调HIF-1α、GRP78、ERK、FAK蛋白表达(P0.05,P0.01)及基因mRNA表达(P0.01),ERK、FAK磷酸化水平增强(P0.01);与Hyp组比较,YQCTF可明显抑制缺氧HUVEC增殖(P0.01,P0.05),抑制细胞周期有丝分裂(P0.05,P0.01),降低细胞迁移和侵袭能力(P0.01),并可下调HIF-1α、GRP78、ERK、FAK蛋白和基因mRNA表达水平(P0.05,P0.01),降低ERK、FAK磷酸化水平(P0.05,P0.01),并呈剂量依赖性。结论 YQCTF可抑制缺氧诱导的HUVEC迁移和侵袭,可能与其调控HIF-1α、GRP78、ERK、FAK的蛋白和基因mRNA表达水平有关。     

基于VEGF相关信号通路研究益气除痰方对缺氧血管新生的影响

目的:研究益气除痰方(YQCTF)对缺氧人脐静脉内皮细胞(HUVEC)血管新生的影响及机制探讨。方法:设立HUVEC常氧(Norm)组、缺氧造模(Hyp)组、缺氧+YQCTF低浓度(L)组、缺氧+YQCTF中浓度(M)组、缺氧+YQCTF高浓度(H)组,采用CCK8法和流式细胞术(Annexin V/PI染色)检测细胞增殖和凋亡;管腔形成实验和transwell小室测定细胞血管生成和细胞迁移能力;Western blot检测HIF-1α、VEGFA、VEGFR2、PI3K、AKT、p-AKT蛋白表达。结果:与常氧组比较,缺氧造模组HUVEC无明显增殖抑制和凋亡,但迁移和管腔形成能力增强,且HIF-1α、VEGFA、VEGFR2、PI3K、AKT、P-AKT蛋白表达上调;与缺氧造模组比较,YQCTF可明显抑制缺氧下HUVEC增殖,促进凋亡,降低迁移及管腔形成能力,呈现剂量依赖性,并可下调HIF-1α、VEGFA、VEGFR2、PI3K、AKT、p-AKT蛋白表达。结论:益气除痰方可抑制缺氧诱导的血管新生,可能与其调控VEGF相关信号通路有关。     

马齿苋酰胺E干预肾癌的作用机制研究

目的探讨马齿苋酰胺E对人肾癌786-O细胞增殖、迁移和侵袭的作用及机制。方法体外培养786-O细胞,给予马齿苋酰胺E(10、20、40μmol/L)进行干预,采用CCK-8法检测细胞增殖情况;采用划痕实验检测细胞迁移能力;采用Transwell小室法检测细胞侵袭能力;采用AO/EB试剂盒检测细胞凋亡率。建立裸鼠移植瘤肾癌模型,给予马齿苋酰胺E(3、15mg/kg)进行干预,测定各组裸鼠肿瘤质量及体积,采用苏木素-伊红(HE)染色法观察肿瘤组织病理变化;采用Westernblotting法检测786-O细胞和荷瘤裸鼠瘤组织中细胞增殖标志物如Ki67、增殖细胞核抗原(proliferatingcellnuclear antigen,PCNA)及凋亡标志物如活化半胱氨酸蛋白酶-3(Cleaved Caspase-3)、Cleaved Caspase-9及侵袭相关蛋白如基质金属蛋白酶-2(matrixmetalloproteinase-2,MMP-2)、MMP-9及希佩尔-林道抑癌基因(VonHippel-Lindau,VHL)/缺氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)通路相关蛋白VHL、HIF-1α的表达情况。结果马齿苋酰胺E显著抑制786-O细胞活力(P<0.05、0.01),下调Ki67、PCNA蛋白表达水平(P<0.05、0.01);明显促进786-O细胞凋亡(P<0.05、0.01),上调Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9蛋白表达水平(P<0.05、0.01);有效改善786-O细胞迁移与侵袭能力(P<0.05、0.01),显著降低MMP-2、MMP-9蛋白表达水平(P<0.05、0.01);显著上调VHL蛋白表达水平(P<0.05、0.01)并显著下调HIF-1α蛋白表达水平(P<0.01)。马齿苋酰胺E可有效降低荷瘤裸鼠肿瘤质量与体积(P<0.05、0.01),抑制肿瘤细胞增殖并促进其凋亡,显著下调Ki-67、PCNA、MMP-2、MMP-9、HIF-1α蛋白表达水平(P<0.05、0.01),显著上调Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9、VHL蛋白表达水平(P<0.05、0.01)。结论马齿苋酰胺E体外可有效抑制786-O细胞增殖、迁移与侵袭,促进786-O细胞凋亡,体内可有效降低荷瘤裸鼠肿瘤质量与体积,其作用机制可能与调控VHL/HIF通路及其下游蛋白表达有关。     

大黄对脂多糖致RAW264.7细胞炎症模型mTOR/HIF-1α/VEGF信号通路的影响

目的观察大黄对脂多糖致RAW264.7细胞炎症模型mTOR/HIF-1α/VEGF信号通路的影响,探讨其作用机制。方法实验细胞分为正常组、模型组、雷帕霉素组和大黄低、中、高剂量组,MTT法检测细胞毒性后,ELISA检测白细胞介素(IL)-6、IL-1β和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)含量,实时荧光定量PCR检测缺氧诱导因子-lα(HIF-1α)、p70S6K1和eIF4E mRNA表达,Western blot检测雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、HIF-1α、血管内皮生长因子(VEGF)蛋白表达。结果与正常组比较,模型组细胞TNF-α、IL-6、IL-1β含量明显升高(P<0.05,P<0.01),HIF-1α、eIF4E和p70S6K1 mRNA表达明显升高(P<0.05,P<0.01),HIF-1α和VEGF蛋白表达明显升高(P<0.05);与模型组比较,大黄各剂量组细胞TNF-α、IL-6和IL-1β含量降低,HIF-1α、p70S6K1和eIF4E mRNA表达降低,HIF-1α、VEGF蛋白表达降低。结论大黄可下调炎症因子水平,其机制可能与其下调HIF-1α、VEGF蛋白表达及HIF-1α、eIF4E、p70S6K1 mRNA表达水平有关。     

化瘀消癥颗粒对人绒毛膜滋养层细胞HTR-8/SVneo侵袭迁移的影响

目的研究化瘀消癥颗粒对人绒毛膜滋养层细胞HTR-8/SVneo侵袭迁移的影响。方法 CCK8检测不同浓度化瘀消癥颗粒处理HTR-8/SVneo细胞不同时间对细胞增殖的影响;细胞划痕、Transwell分别检测化瘀消癥颗粒对HTR-8/SVneo细胞增殖、迁移、侵袭的影响;qRT-PCR检测integrinβ3、E-cadherin mRNA表达;Western blot检测integrinβ3、FAK、p-FAK、Scr、p-Src、E-cadherin蛋白表达。结果化瘀消癥颗粒对HTR-8/SVneo细胞活性的抑制作用呈时间和浓度依赖性。与对照组比较,化瘀消癥颗粒(0.4、0.5 g/L)组穿膜细胞数显著减少(P0.05),0.5 g/L组细胞划痕面积减小;化瘀消癥颗粒(0.4,0.5 g/L)组E-cadherin mRNA和蛋白表达上调(P0.05,P0.01),integrinβ3 mRNA和蛋白表达下调(P0.05,P0.01),p-FAKp-Src蛋白表达下调(P0.05, P0.01)。结论化瘀消癥颗粒可能通过调节integrinβ3/FAK通路抑制HTR-8/SVneo细胞侵袭和迁移。     

大鼠脑缺血预处理后GRP78表达的变化及清热化瘀方的干预研究

目的:观察缺血预处理对大鼠脑缺血再灌注后GRP78mRNA及其蛋白表达和神经元凋亡的影响及清热化瘀方的干预作用。方法:SD大鼠160只,随机分为假手术组(SO)、脑缺血再灌注组(MCAO)、脑缺血预处理组(BIP)、清热化瘀方干预组(QRHY)4组,每组按照再缺血后12h、1天、2天、3天四个时间点分为4个亚组。采用二次线栓法制备大鼠局灶性脑缺血预处理模型,用原位杂交法和Western blot法观察再缺血后各个时间点GRP78mRNA及其蛋白的表达变化,用流式细胞术检测神经细胞凋亡率。结果:①MCAO组12h GRP78mRNA及其蛋白表达均达高峰,随再灌注时间延长其表达逐渐下降(P<0.05,P<0.01);BIP组较MCAO组GRP78mRNA及其蛋白表达均明显升高(P<0.05,P<0.01);QRHY组较BIP组进一步升高其表达(P<0.05)。②MCAO组12h细胞凋亡发生率显著增加,1天时达到高峰(P<0.01),以后时间点逐渐下降(P<0.01);BIP组各个时间点神经元凋亡发生率较MCAO组显著降低(P<0.05,P<0.01);QRHY组较BIP组神经细胞凋亡率进一步降低(P<0.05,P<0.01)。结论:脑缺血预处理可能通过诱导GRP78表达发挥其神经保护作用,清热化瘀方可促进其作用。     

缺氧诱导星形胶质细胞HIF-1α、SDF-1α的表达及其相关性研究

目的:观察氯化钴诱导缺氧离体星形胶质细胞HIF-1α、SDF-1α的表达情况及相关性。方法:用不同终浓度氯化钴培养离体星型胶质细胞4小时,以未加入氯化钴培养组作为对照组;50μmoml/L氯化钴培养星形胶质细胞不同的时间,以未加入氯化钴培养组作为对照组;RT-PCR检测各组缺氧模型HIF-1αmRNA和SDF-1αmRNA的表达。结果:对照组HIF-1α表达很弱甚至不表达,而SDF-1α有一定的表达;50μmoml/L氯化钴培养的星型胶质细胞不同时间组:不同时间点HIF-1α、SDF-1α的表达较对照组差异有统计学意义(P<0.05)。HIF-1α和SDF-1α表达时相一致,具有正相关性;不同浓度氯化钴培养星型胶质细胞4小时组:不同浓度HIF-1α、SDF-1α的表达较对照组差异有统计学意义(P<0.05)。HIF-1α和SDF-1α表达时相一致,具有正相关性。结论:缺氧可诱导星形胶质细胞HIF-1α、SDF-1α的表达增高,两者间存在明显正相关。     

龙蛭汤对衣霉素诱导人脐静脉内皮细胞内GRP78和CHOP的影响

目的探讨龙蛭汤对衣霉素(TM)诱导的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)内质网应激及其标志蛋白葡萄糖调节蛋白78(GRP78)和特异性蛋白C增强子结合蛋白同源蛋白(CHOP)表达的影响。方法制备龙蛭汤含药血清,体外培养HUVEC细胞株,分为对照组(10%空白血清),TM组(10%空白血清+3μg/mL TM),TM+龙蛭汤组(10%含药血清+3μg/mL TM),龙蛭汤组(10%含药血清),继续培养6 h。使用CCK-8法比较各组细胞活力,细胞免疫荧光法和Western Blot比较各组GRP78和CHOP蛋白表达,RT-PCR法比较各组GRP78和CHOP mRNA表达。结果与对照组比较,TM组HUVEC细胞活力下降,GRP78、CHOP蛋白及mRNA表达增加(均P0.05);与TM组比较,TM+龙蛭汤组、龙蛭汤组HUVEC细胞活力升高,GRP78、CHOP蛋白及mRNA表达降低(均P0.05)。结论龙蛭汤可通过下调GRP78、CHOP表达,减轻细胞过度的内质网应激反应,提高HUVEC细胞活力。     

补肾调经方激活ERK信号通路抑制内质网应激促进血管生成的研究

目的:研究补肾调经方对子宫内膜微血管内皮细胞内质网应激(ERS)状态的影响,探讨其促进子宫内膜血管生成改善子宫内膜容受性的作用。方法:将人子宫内膜微血管内皮细胞(HEMECs)分为对照组、雌激素(E_2)组、补肾组和E_2+补肾组,Western blot和实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-PCR)检测细胞中葡萄糖调节蛋白78(GRP78)的蛋白和mRNA表达变化;Western blot方法检测细胞外信号调节蛋白激酶(ERK)以及磷酸化细胞外信号调节激酶(p-ERK)的表达变化。结果:在给予补肾调经方预孵育后,GRP78的蛋白和mRNA水平均降低(P0.05),p-ERK的蛋白水平升高(P0.05);在给予ERK信号通路抑制剂后,GRP78的蛋白和mRNA水平升高(P0.05)。结论:补肾调经方通过激活ERK通路抑制ERS以促进子宫内膜血管生成。     

β-咔啉类生物碱抑制SGC-7901细胞迁移和侵袭的机制研究

该研究主要探索β-咔啉类生物碱抑制SGC-7901细胞迁移和侵袭的机制与黏着斑激酶(focal adhesion kinase,FAK)基因表达的相关性。采用CCK-8法测定不同浓度条件下β-咔啉类生物碱对胃癌SGC-7901细胞的增殖抑制率;并通过Transwell小室测定β-咔啉类生物碱对SGC-7901细胞迁移与侵袭能力的影响;qRT-PCR及Western blot技术检测FAK基因mRNA及蛋白的表达差异。然后将si-FAK-1051重组质粒转染到SGC-7901细胞中,再次采用qRT-PCR及Western blot技术鉴定FAK基因沉默效果,最后采用同样的方法检测FAK基因沉默对胃癌SGC-7901细胞增殖和迁移的影响。随着β-咔啉类生物碱浓度增加,人胃癌SGC-7901细胞增殖抑制率逐渐升高,IC50=13.364 mg·L-1;阳性对照组(5-FU,5 mg·L-1)和β-咔啉类生物碱组中Transwell小室内SGC-7901细胞均可见显著减少(P0.01),且β-咔啉类生物碱组SGC-7901细胞数目较阳性对照组明显降低(P0.01);阳性对照组、β-咔啉类生物碱实验组FAK基因mRNA及蛋白表达水平较空白对照组显著降低(P0.05)。si-FAK-1051转染入胃癌SGC-7901细胞后,FAK基因的mRNA及蛋白表达被明显下调(P0.05),细胞增殖和细胞迁移能力也显著降低(P0.05)。β-咔啉类生物碱较5-FU具有更有效的抑制胃癌SGC-7901细胞迁移与侵袭能力,而该机制可能与β-咔啉类生物碱抑制FAK基因mRNA及蛋白表达水平有关。     

加味通幽汤对食管癌Eca-109细胞mTOR/HIF-1α通路及肿瘤缺氧相关因子的影响

目的研究加味通幽汤对食管癌Eca-109细胞雷帕霉素靶蛋白(mTOR)/缺氧诱导因子1α(HIF-1α)通路及肿瘤缺氧相关因子的影响及干预机制。方法采用加味通幽汤、生理盐水分别灌胃大鼠14 d制备含药和对照血清。实验分为常氧组、缺氧组、常氧含药血清组和缺氧含药血清组,常氧组加入10%对照大鼠血清培养;缺氧组加入10%对照大鼠血清、10%CoCl 2缺氧诱导液培养;常氧含药血清组加入10%含药大鼠血清培养;缺氧含药血清组加入10%含药大鼠血清、10%CoCl 2缺氧诱导液培养。Western blot法检测各组中mTOR、HIF-1α及血管内皮生长因子(VEGF)、骨桥蛋白(OPN)、血管内皮细胞钙黏连蛋白(VE-cadherin)表达情况;实时荧光定量RT-PCR法检测各组中mTOR、HIF-1α、VEGF、OPN、VE-cadherin mRNA表达情况;免疫荧光法分析各组中VE-cadherin与HIF-1α共表达情况。结果Western blot分析显示,缺氧组细胞中mTOR、HIF-1α、VEGF、OPN、VE-cadherin蛋白表达水平均显著高于常氧组(P均<0.05),缺氧含药血清组mTOR、HIF-1α、VEGF、OPN、VE-cadherin蛋白表达水平均显著低于缺氧组(P均<0.05)。实时荧光定量RT-PCR检测显示,缺氧组细胞中mTOR、HIF-1α、VEGF、OPN、VE-cadherin mRNA相对表达水平显著高于常氧组(P均<0.05),缺氧含药血清组mTOR、HIF-1α、VEGF、OPN、VE-cadherin mRNA相对表达水平显著低于缺氧组(P均<0.05)。免疫荧光结果显示,缺氧组HIF-1α与VE-cadherin荧光强度较常氧组明显增强,缺氧含药血清组HIF-1α与VE-cadherin荧光强度较缺氧组均显著降低。结论加味通幽汤可显著抑制缺氧微环境下食管癌Eca109细胞mTOR/HIF-1α通路及肿瘤缺氧相关因子VEGF、OPN和VE-cadherin蛋白和mRNA表达。     

黄芪汤对高糖诱导足细胞损伤的保护作用及机制研究

目的观察黄芪汤对高糖诱导足细胞损伤的影响及作用机制。方法实验分为5组:对照组足细胞采用5.5 mmol/L葡萄糖培养液培养,模型组足细胞采用30 mmol/L葡萄糖培养液培养,黄芪汤30μg/mL组、黄芪汤100μg/mL组、黄芪汤300μg/mL组分别采用30 mmol/L葡萄糖培养液和相应浓度黄芪汤进行培养。细胞培养48 h后,采用CCK-8法检测各组细胞存活率,采用流式细胞术检测各组细胞凋亡情况,采用免疫荧光法检测各组细胞标记蛋白podocin表达情况,采用Western blot检测各组细胞内质网应激通路蛋白[葡萄糖调节蛋白78(GRP78)、磷酸化蛋白激酶R样内质网激酶(p-PERK)、蛋白激酶R样内质网激酶(PERK)、磷酸化真核起始因子2α(p-eIF2α)、真核起始因子2α(eIF2α)]及其介导的凋亡相关蛋白[增强子结合蛋白同源蛋白(CHOP)、B细胞淋巴瘤因子2(Bcl-2)]表达情况。结果模型组细胞存活率明显低于对照组(P<0.05),细胞凋亡率明显高于对照组(P均<0.05);黄芪汤各组细胞存活率均明显高于模型组(P均<0.05),细胞凋亡率均明显低于模型组(P均<0.05),且呈浓度依赖性。模型组podocin表达荧光强度明显弱于对照组,黄芪汤各组随着药物浓度升高podocin表达荧光强度明显增强。模型组GRP78、p-PERK、p-eIF2α、CHOP表达水平均明显高于对照组(P均<0.05);黄芪汤各组GRP78、p-PERK、p-eIF2α、CHOP表达水平均明显低于模型组(P均<0.05),且黄芪汤各组随药物浓度的升高GRP78、p-PERK、p-eIF2α表达水平均逐渐降低(P均<0.05)。模型组Bcl-2表达水平明显低于对照组(P<0.05);黄芪汤100μg/mL组、黄芪汤300μg/mL组Bcl-2表达水平均明显高于模型组(P均<0.05);黄芪汤100μg/mL组与黄芪汤300μg/mL组Bcl-2和CHOP表达水平比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。结论黄芪汤可呈浓度依赖性的抑制高糖诱导的足细胞损伤,其作用可能与抑制PERK介导的内质网应激途径有关。     

三七皂苷单体Rb1在低氧高二氧化碳肺动脉收缩中的保护作用及机制

目的 探讨三七皂苷单体Rb1在低氧高二氧化碳性肺动脉收缩(hypoxia hypercapnia-induced pulmonary vasoconstriction,HHPV)中的保护作用及机制。方法 原代培养健康雄性SD大鼠肺动脉平滑肌细胞,取第2～5代细胞至低氧高二氧化碳(1%O2,6%CO2)条件下继续培养,并分别用8、40、100 mg/L Rb1孵育24 h后收集细胞,分别采用Western blot测定磷酸化细胞外调节蛋白激酶（ERK）蛋白表达,半定量RT-PCR检测ERK1和ERK2 mRNA表达。结果 常氧组p-ERK蛋白及ERK1、ERK2 mRNA表达均呈弱阳性,低氧高二氧化碳组p-ERK蛋白及ERK1、ERK2 mRNA表达均明显增加(P<0.01);经不同浓度Rb1干预后,p-ERK蛋白及ERK1、ERK2 mRNA表达均明显降低(P<0.05,P<0.01),并呈剂量依赖关系,以100 mg/L效果最好。Rb1各浓度组p-ERK蛋白表达与ERK1和ERK2 mRNA表达均呈显著正相关(r分别为0.500、0.977,P<0.01)。结论 ERK1/2信号通路可能介导大鼠HHPV;三七皂苷单体Rb1可能通过抑制ERK1/2通路减轻HHPV。     

导痰汤对人脐静脉内皮细胞细胞间黏附分子1和p53表达的影响

目的:通过研究导痰汤干预细胞间黏附分子1(ICAM-1)与p53的表达,分析导痰汤治疗动脉粥样硬化的机制。方法:人脐静脉内皮细胞(HUVEC),传代培养1～3代用于实验。含药血清的制备为将导痰汤按照0.9 g.kg-1.d-1剂量给SD大鼠ig 10 d后,经腹主动脉采血,分离血清。实验共分7组:正常HUVEC为空白对照组,不含药血清处理HUVEC为空白血清对照组,肿瘤坏死因子α(TNF-α,200 U.mL-1)预处理HUVEC为TNF-α诱导组,先采用5%(0.015 g.mL-1),10%(0.03 g.mL-1),20%(0.06 g.mL-1)含药血清预处理HUVEC,再与TNF-α共培养为5%,10%,20%导痰汤组,使用p53特异性阻滞剂PFT-α(0.009 g.mL-1)处理HUVEC为PFT-α阻滞组。通过PCR和Western blot等方法,观察导痰汤对TNF-α刺激脐静脉内皮细胞培养内皮细胞ICAM-1 mRNA的表达和p53表达的影响。结果:①TNF-α诱导组ICAM-1 mRNA和p53 mRNA的表达显著高于正常对照组和导痰汤对照组(P<0.01);使用导痰汤含药血清或PFT-α处理后,ICAM-1和p53 mRNA的表达显著下降(P<0.05);②TNF-α诱导组ICAM-与p53蛋白显著高于正常对照组和导痰汤对照组(P<0.01)。使用导痰汤含药血清或PFT-α处理后,ICAM-1与p53表达显著下降(P<0.05);③p53 mRNA与ICAM-1 mRNA表达水平呈显著正相关(r=0.981,P<0.01);p53活性与ICAM-1水平呈显著正相关(r=0.854,P<0.01)。结论:导痰汤可以通过调节p53表达而抑制TNF-α刺激所致的脐静脉内皮细胞ICAM-1 mRNA的表达,故能起到治疗动脉粥样硬化的作用。     

姜黄素对缺氧诱导的人原发性肝癌细胞HepG2上皮细胞间充质转化的影响

目的 探讨姜黄素对缺氧诱导下人原发性肝癌细胞HepG2上皮细胞间充质转化的影响及其可能机制。方法 将HepG2细胞分3组：正常对照组、氯化钴（CoCl2）组和CoCl2加10 μmol/L姜黄素组。采用MTT法检测细胞增殖能力,划痕实验检测细胞迁移能力,Real-time RT-PCR检测缺氧诱导因子－1α（hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α） mRNA表达,Western blot检测HIF-1α蛋白、E-钙黏蛋白（epithelial-cadherin,E-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）表达。结果 HepG2细胞被CoCl2诱导缺氧后,细胞增殖及迁移能力增强,HIF-1α蛋白表达上调,上皮标志蛋白E-cadherin表达下降而间质标志蛋白Vimentin表达上调,与正常对照组比较,差异均有统计学意义（P<0.05）。姜黄素干预缺氧HepG2细胞后,其增殖与迁移能力被明显抑制,同时HIF-1α蛋白表达下降,E-cadherin蛋白表达上调,Vimentin蛋白表达下降,与CoCl2组比较,差异均有统计学意义（P<0.05）。3组HIF-1α mRNA表达比较,差异无统计学意义（P>0.05）。结论 缺氧诱导肝癌细胞HepG2增殖和迁移能力的增强可被姜黄素逆转,可能与姜黄素抑制缺氧诱导的HIF-1α蛋白上调和上皮细胞间充质转化有关。     

罗勒多糖对肝癌细胞缺氧模型组蛋白去甲基化酶LSD1、JMJD2B及JARID1B表达的影响

目的研究罗勒多糖对肝癌细胞MHCC97H和MHCC97L缺氧模型组蛋白去甲基化酶LSD1、JMJD2B及JARID1B表达的影响,探讨罗勒多糖抗肿瘤侵袭转移作用与表观遗传修饰的关系。方法采用二氯化钴诱导肝癌细胞缺氧,建立肝癌细胞MHCC97H和MHCC97L体外缺氧模型,通过不同剂量罗勒多糖干预24h,细胞划痕实验检测缺氧条件下肝癌细胞的迁移能力,实时荧光定量PCR法检测各组肝癌细胞中HIF-1α、LSD1、JMJD2B及JARID1B mRNA表达水平,Westernblot法检测各组肝癌细胞中HIF-1α、LSD1、JMJD2B及JARID1B蛋白表达情况。结果罗勒多糖能抑制缺氧条件下MHCC97H和MHCC97L细胞的迁移能力,下调细胞中HIF-1αmRNA及蛋白的表达水平,与缺氧模型组相比有显著性差异(P0.05);罗勒多糖能够下调MHCC97H细胞缺氧条件下LSD1、JMJD2B、JARID1B mRNA和蛋白的表达,与缺氧模型组相比有显著性差异(P0.05);缺氧条件下MHCC97L细胞中LSD1、JMJD2B、JARID1B mRNA和蛋白的表达与正常对照组无显著性差别(P0.05),罗勒多糖对这三种酶的表达亦无显著作用。结论罗勒多糖能改善不同转移潜能肝癌细胞MHCC97H和MHCC97L的缺氧微环境,抑制肿瘤细胞的侵袭转移。其中罗勒多糖对高转移潜能肝癌细胞MHCC97H的抗侵袭转移作用与其对细胞中组蛋白去甲基化酶LSD1、JMJD2B、JARID1B的调节有关,而对低转移潜能肝癌细胞MHCC97L侵袭转移能力的调节未发现与LSD1、JMJD2B、JARID1B有明显关系。     

蚯蚓活性组分对内质网应激所致肝细胞凋亡的保护作用研究

该研究旨在探讨蚯蚓活性组分(EWAs)对衣霉素(tunicamycin,TM)诱导内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)所致肝细胞凋亡的保护作用。体外培养L-02细胞,采用CCK-8法检测细胞存活率,采用流式细胞仪检测细胞凋亡,分别采用Western和q PCR法检测相关蛋白和mRNA的表达情况。研究发现,TM能够以时间和剂量依赖的方式降低L-02细胞的存活率,与正常组相比,模型组中L-02细胞的凋亡率和ERS相关因子GRP78,PERK,e LF2α,ATF4,CHOP,Bax的mRNA和蛋白水平均显著升高(P0.05,P0.01),Bcl-2的mRNA和蛋白水平均显著下降(P0.05,P0.01)。与模型组相比,不同浓度的EWAs处理后,L-02细胞的存活率显著增加,细胞凋亡显著减少,ERS相关因子GRP78,PERK,e LF2α,ATF4,CHOP,Bax的mRNA和蛋白表达水平显著下降(P0.05,P0.01),Bcl-2的mRNA和蛋白水平明显升高(P0.05,P0.01),且呈剂量依赖性。这些结果表明,EWAs对TM诱导L-02细胞ERS所致的肝细胞凋亡具有显著的保护作用,其机制可能与下调ERS相关因子GRP78,PERK,ATF4,e LF2α,CHOP,Bax的表达,减轻L-02细胞的ERS,上调Bcl-2的表达,促进受损细胞增殖有关。     

柞蚕雄蛾提取液对荷瘤大鼠放疗后肿瘤组织缺氧诱导因子-1α表达的影响

目的探讨柞蚕雄蛾提取液对放疗后荷瘤大鼠肿瘤组织缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)表达的影响。方法制备W256荷瘤模型,常规放疗后,柞蚕雄蛾提取液16.53 mg/kg连续ig给药10 d。采用免疫组化染色检测肿瘤组织中HIF-1α和血管内皮生长因子(VEGF)的表达;原位杂交法检测肿瘤组织中HIF-1αmRNA表达。结果免疫组化结果显示,与模型组比较,放疗组肿瘤组织HIF-1α和VEGF蛋白表达有增强趋势(P>0.05);放疗联合柞蚕雄蛾提取液(联合组)和柞蚕雄蛾提取液组肿瘤组织HIF-1α和VEGF的表达均显著减弱(P<0.05),且HIF-1α与VEGF呈明显正相关(r=0.649,P<0.01)。原位杂交结果显示,放疗组较模型组HIF-1αmRNA表达无统计学意义(P>0.05);联合组及柞蚕雄蛾提取液组肿瘤组织HIF-1αmRNA表达均降低(P<0.05)。结论柞蚕雄蛾提取液对放疗后及未实施放疗的肿瘤组织HIF-1α的表达有下调作用。     

肺心汤对低氧性肺动脉高压模型大鼠低氧诱导因子-1α及血管内皮生长因子的影响

目的探讨肺心汤对低氧性肺动脉高压(hypoxic pulmonary hypertension,HPH)模型大鼠低氧诱导因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)和血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的影响及其治疗HPH的作用机制。方法将40只健康雄性SD大鼠随机分为正常对照组、模型组、肺心汤组和硝苯地平组,每组10只。采用常压间断缺氧法复制HPH大鼠模型。除正常对照组外,其余各组均置于自制的有机玻璃缺氧舱中饲养,每天缺氧8h,持续14天后,正常对照组及模型组以30mL/kg蒸馏水灌胃;肺心汤组及硝苯地平组以相应药物灌胃(28g/kg、20mg/kg),均每天1次,连续灌胃14天,且在给药同时继续间断缺氧14天。末次给药后次日行平均肺动脉压力(mean pulmonary arter ypressure,mPAP)检测、肺小动脉形态学检测,测定肺动脉管壁面积/管总面积比值(WA%);分别采用免疫组织化学及原位杂交技术检测HIF-1α和VEGF的蛋白及mRNA表达。结果与正常对照组比较,模型组mPAP、WA%、HIF-1α和VEGF蛋白及mRNA表达明显增加(P<0.01,P<0.05);与模型组比较,肺心汤组mPAP、WA%、HIF-1α和VEGF蛋白及mRNA表达明显减少(P<0.01,P<0.05)。结论肺心汤通过降低HIF-1α的表达而下调其靶基因VEGF的表达,部分逆转肺血管平滑肌重塑可能是其治疗HPH的作用机制之一。     

补阳还五汤干预缺氧预适应成纤维细胞促间充质干细胞迁移的机制

目的:探讨补阳还五汤干预缺氧预适应心脏成纤维细胞促间充质干细胞迁移的相关机制。方法:以6.5,13,26 g·kg~(-1)补阳还五汤和等量蒸馏水连续灌胃SD大鼠7 d后,制备补阳还五汤含药血清及空白血清。0.56,1.12,2.25 g·m L~(-1)含药血清干预缺氧预适应的心脏成纤维细胞(cardiac fibroblasts,CFs)24 h后,酶联免疫吸附测定(ELISA),实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR),蛋白免疫印迹法(Western blot)检测CFs培养液中缺氧诱导因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α),单核细胞趋化因子-1(monocyte chemotactic protein-1,MCP-1)及肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)的含量,mRNA及蛋白表达情况,并将补阳还五汤干预缺氧预适应CFs的培养液干预间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSC)后,检测MSC的细胞迁移能力。结果:与常氧组比较,缺氧可以显著促进CFs分泌HIF-1α,MCP-1及HGF(P0.01),同时给予缺氧预处理的CFs培养液干预MSC后,HIF-1α,MCP-1及HGF的水平亦显著升高(P0.01),当给予不同剂量的补阳还五汤含药血清干预后,与缺氧组比较,它们的表达进一步升高(P0.05,P0.01);而给予HIF-1α抑制剂YC-1处理后,补阳还五汤各组可升高MCP-1,HGF的表达(P0.05)。结论:补阳还五汤协同缺氧预适应CFs旁分泌效应能够促进MSC迁移,其可能机制是通过上调HIF-1α的表达,提高迁移因子MCP-1,HGF的表达而实现的。