hUPF1的两个功能位点对调控ZNF268基因转录活性的影响

h UPF1是人类无义介导mRNA降解途径的关键因子,前期研究结果显示h UPF1能够调控ZNF268基因的转录活性.为研究h UPF1的两个功能位点对调控ZNF 268转录活性的影响,使用双荧光报告实验体系,在He La细胞中转染R1R-DE637AA、R1R-RR857AA或质粒组合,然后测量ZNF 268启动子报告质粒p GL3(-37/1234)和p GL3(589/760)的活性.结果显示h UPF1的任何一个功能位点缺失都导致ZNF 268转录活性下降.为排除内源性h UPF1对实验结果的影响,使用RNA干扰的方法降解内源性h UPF1,再转染R1R-DE637AA或R1R-RR857AA质粒.实验结果得到进一步证实.研究表明h UPF1的两个功能位点对调控ZNF 268基因的启动子活性都是必要的.     

TGFβ1 shRNA对293细胞合成TGFβ1的干扰作用

目的:探讨自行设计的TGFβ1shRNA对293细胞TGFβ1基因表达的干扰作用,为研究纤维化病变的基因治疗方法提供技术基础和依据.方法:针对大鼠TGFβ1基因mRNA序列,设计、合成携带3条TGFβ1 shRNA和TCFβ1基因的绿色荧光蛋白融合表达质粒载体,并设阴性质粒组和空质粒组为对照,通过脂质体包裹分别转染293细胞.转染后24、48和72 h收集细胞,在荧光显微镜下观察干扰效果,采用荧光定量PCR检测TGFβ1基因表达情况,并计算干扰效率.结果:荧光显微镜下观察,可见转染后24、48和72 h TGFβ1shRNA质粒组细胞绿色荧光强度均明显弱于阴性质粒组细胞,空质粒载体组未产生绿色荧光;荧光定量PCR检测转染后293细胞TGFβ1mRNA表达量,转染后24、48和72 h TCFβ1shRNA质粒组TCFβ1mRNA表达量均显著低于阴性质粒组(P<0.01),其基因干扰效率则依次递减,分别为97.2%、97.1%和67.7%.结论:本研究证明自行设计的TGFβ1shRNA转染293细胞后24、48和72 h TGFβ1shRNA均能够高效干扰TGFβ1基因的表达,其基因干扰效率呈现一定的时间依赖性.     

慢病毒介导的RNA干扰抑制白血病细胞增殖的应用

通过慢病毒载体介导的RNA干扰(RNAi)技术,沉默成人T细胞白血病(ATL)中关键的病毒基因HBZ,并研究RNA干扰后对白血病细胞增殖的影响.首先根据HBZ基因序列设计RNA干扰片段,构建其慢病毒载体,并将其包装成病毒.然后用HBZ siRNA慢病毒感染白血病细胞株TL-Om1,通过RT-PCR和Western blot检测HBZ基因和蛋白表达情况,MTT技术检测沉默HBZ后TL-Om1细胞的增殖情况,利用RT-PCR检测病毒感染后下游生长相关基因的表达.实验结果表明:利用慢病毒介导的RNA干扰技术能有效降低HBZ的表达,进而抑制了白血病细胞的增殖;沉默HBZ后,细胞内E2F1,PCNA和Myc等下游生长相关基因的表达受到了明显抑制.这将为慢病毒介导的RNA干扰技术应用于临床治疗成人T细胞白血病提供重要的实验依据.     

乳腺癌Jab1蛋白调控Nov基因的表达受甲基化水平影响

为探讨癌基因Jab1在乳腺癌发生发展中的功能,首先在乳腺癌细胞MDA231中建立了慢病毒介导的Jab1基因的表达干扰系统,并通过人基因表达谱芯片分析结果以及实时定量PCR实验筛选出受Jab1调控的下游基因;此外,通过实时定量PCR以及Western blot实验证实Jab1干扰表达能降低Nov基因在转录和翻译水平表达,而且Nov启动子区域存在4个高甲基化CpG位点.进一步使用甲基转移酶抑制剂处理Jab1干扰表达细胞,发现与未使用抑制剂处理细胞相比,Nov基因的mRNA和蛋白质表达水平发生明显上调,说明Jab1基因调控Nov表达受甲基化水平的影响,提示Jab1可能是通过表观遗传学水平调控Nov基因的表达.     

重组腺病毒介导RNA干扰人DLK1基因表达的研究

构建抑制人DLK1基因表达的重组腺病毒载体,利用腺病毒载体介导的RNA干扰技术评价其在肝癌细胞株中的基因沉默效应.将针对人DLK1基因的RNAi寡核苷酸序列,连接到腺病毒穿梭质粒中,在含有腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的大肠杆菌BJ5183内进行同源重组.重组腺病毒载体在HEK-293细胞中包装扩增,得到高滴度的重组腺病毒.通过绿色荧光蛋白示踪腺病毒的感染效果,并通过荧光实时RT-PCR,western blot的方法证实重组腺病毒能够显著抑制DLK1基因在肝癌细胞株中的表达.     

Jab1基因的RNAi对乳腺癌MCF-7细胞增殖和迁移的影响

为探讨Jab1基因在乳腺癌细胞中的生物学功能,进一步揭示其作用的分子机制.首先在乳腺癌细胞MCF-7中,成功建立了慢病毒介导的Jab1基因的RNAi系统,并通过CCK8细胞增殖实验和细胞划痕实验证实Jab1基因表达的干扰使得MCF-7细胞的增殖和迁移发生显著的下降,细胞周期分析表明,干扰Jab1的表达能增加MCF-7细胞sub G1期的比例,诱导凋亡;此外,通过RT-PCR和Western blot实验首次发现Jab1能调控TBHS1的表达,添加甲基化转移酶抑制剂5-Aza-dC能抑制Jab1表达干扰介导的THBS1表达下调,提示Jab1可通过甲基化的表观遗传学途径调控THBS1基因的表达.     

无义mRNA降解途径的机制与进化

含有无义突变的mRNA在细胞中被无义介导的mRNA降解(nonsense-mediated mRNA decay,NMD)途径选择性降解,同时该途径还能调控细胞中一些生理性RNA的丰度。NMD途径的核心是含有无义突变的mRNA的识别和降解机制,其中关键因子上游移码蛋白(up-frameshift,UPF)和生殖器形态效应抑制因子(suppressor with morphological effect on genitalia,SMG)的功能及其调控机制是NMD途径研究的热点问题。NMD途径核心因子的种类和功能在不同进化地位的生物中既有一定的保守性,也有一定的差异,说明NMD途径具有一定的进化学特征。高等真核生物NMD途径机制的研究取得了一定的进展,而在原生生物中尚无机制层面的研究。利用原生动物作为模式生物开展NMD途径关键因子的功能和进化研究,有助于从进化学角度揭示NMD途径的功能和调控机制,为建立人类细胞中NMD途径的调控网络提供数据支持,为人类遗传学疾病和肿瘤的预防和治疗提供理论基础。     

pEGFP-C1-MCH真核表达载体的构建及其在HEK293 细胞系中的表达

目的:构建pEGFP-C1-MCH真核表达载体,并将其转染入HEK293细胞中,筛选阳性细胞克隆,为研究MCH基因在能量代谢中的功能及机制提供细胞模型.方法:提取脑组织总RNA,反转录为cDNA,参照Genbank中提供的序列设计引物扩增MCH基因全长.再将该基因全长cDNA克隆至质粒pEGFP-C1,经菌落PCR筛选及双酶切和DNA测序鉴定,成功构建了含有目的基因MCH的重组质粒pEGFP-C1-MCH.并利用脂质体2000介导其转染HEK293细胞,用荧光显微镜和RT-PCR检测EGFP和MCH在细胞中的表达.结果:克隆的pEGFP-C1-MCH质粒序列中的MCH与Gen Bank相符;细胞转染72 h后,转染成功的细胞在荧光显微镜下表达较强的绿色荧光,MCH基因稳定表达.结论:pEGFP-C1-MCH真核表达载体的构建及其在HEK293细胞中的稳定表达,为研究MCH基因在能量代谢中的功能及作用机制提供了实验模型.     

慢病毒载体及其介导的RNA干扰在基因治疗中的应用研究

主要就慢病毒载体及其介导的RNA干扰技术在基因治疗中的应用研究进行了综述,并对其在该领域具有的广阔前景进行了展望.慢病毒载体作为一种新型的载体,可有效地将携带的目的基因导入宿主细胞,并将其整合到宿主细胞基因组中,从而使目的基因得以持久稳定地表达.该载体因具有高感染性、高表达效率及不易诱发宿主免疫反应等优点,已成为基因治疗研究中的一个重要工具.RNA干扰技术可以特异性抑制或关闭特定基因的表达,因此该技术可广泛应用在基因功能探究和恶性肿瘤治疗等领域.由慢病毒载体介导的RNA干扰技术能持久、稳定、特异性地抑制各类细胞中特定基因的表达,在病毒感染、肿瘤等疾病的基因治疗中被广泛应用,成为生物医学领域的新热点.     

BGC-823细胞中慢病毒途径针对HIF-1α基因的RNAi实验

目的：构建人HIF-1α基因的shRNA慢病毒载体、包装生产重组慢病毒颗粒,病毒途径高效感染胃癌细胞株BGC-823,并验证基因沉默效率。方法：在NCBI数据查找人HIF-1α基因序列,然后使用siRNA在线设计软件,设计针对基因CDS区的3条siRNA序列及Negative序列。根据设计好的siRNA序列设计双链互补的shRNA-Oligo DNA,退火形成双链后与线性化载体链接,构建shRNA重组表达载体。经由293TN细胞包装shRNA重组慢病毒颗粒,随后使用重组病毒感染BGC-823,通过荧光标记蛋白GFP确定感染效率后收集细胞样本,分别采用Real-time PCR和Western blot方法检测靶基因在mRNA和蛋白质水平的沉默效率。结果：shRNA重组表达载体测序结果与设计序列完全一致,包装病毒后滴度达到1×104 ifu/μL。慢病毒感染BGC-823细胞取得了极高的基因转导效率。mRNA检测结果显示,siRNA3对于对与目的基因的沉默效果最好,较阴性对照序列组相比较,mRNA的表达量下降了92%,Western blot检测的结果与mRNA检测结果完全相符合。结论：通过慢病毒途径,可以在BGC-823细胞中高效的进行HIF-1α基因的沉默。     

Translational control of intron splicing in eukaryotes

Most eukaryotic genes are interrupted by non-coding introns that must be accurately removed from pre-messenger RNAs to produce translatable mRNAs. Splicing is guided locally by short conserved sequences, but genes typically contain many potential splice sites, and the mechanisms specifying the correct sites remain poorly understood. In most organisms, short introns recognized by the intron definition mechanism cannot be efficiently predicted solely on the basis of sequence motifs. In multicellular eukaryotes, long introns are recognized through exon definition and most genes produce multiple mRNA variants through alternative splicing. The nonsense-mediated mRNA decay (NMD) pathway may further shape the observed sets of variants by selectively degrading those containing premature termination codons, which are frequently produced in mammals. Here we show that the tiny introns of the ciliate Paramecium tetraurelia are under strong selective pressure to cause premature termination of mRNA translation in the event of intron retention, and that the same bias is observed among the short introns of plants, fungi and animals. By knocking down the two P. tetraurelia genes encoding UPF1, a protein that is crucial in NMD, we show that the intrinsic efficiency of splicing varies widely among introns and that NMD activity can significantly reduce the fraction of unspliced mRNAs. The results suggest that, independently of alternative splicing, species with large intron numbers universally rely on NMD to compensate for suboptimal splicing efficiency and accuracy.     

靶向肿瘤多药耐药基因mdr1的siRNA的构建与鉴定

mdr 1基因及其表达产物P-gp是引起肿瘤细胞多药耐药(MDR)的主要原因,抑制mdr 1基因的表达可用于逆转MDR.RNAi可用于特异抑制靶基因的表达,本研究的目的是构建获得可特异有效靶向mdr 1基因的siRNA元件.应用siRNA设计软件与mRNA结构分析软件设计构建了3个分别靶向mdr 1基因mRNA环结构和茎结构的siRNA元件,同时构建了携带mdr1基因序列的luc报告质粒,通过siRNA表达质粒与携带靶序列的报告质粒的共转染抑制实验检测不同siRNA的抑制效率,结果显示靶向环结构siMDR1B具有较好的抑制效率和特异性.进一步将siMDR1B表达载体与mdr1基因表达载体共转染细胞,应用免疫流式细胞术检测显示,相比对照细胞,siMDR1B可显著抑制其转染后mdr1基因产物P-gp蛋白的表达活性.同时采用CCK-8细胞活性检测试剂评价了siMDR1B对细胞活性的影响,结果显示siMDR1B不会影响细胞活性,具有良好的特异性.本研究获得的可有效靶向mdr 1基因的siRNA元件可为进一步开展逆转MDR研究提供重要基础.     

FTH1在布鲁氏菌侵染宿主细胞中的作用

为了探究布鲁氏菌侵染宿主巨噬细胞过程中铁蛋白(FTH1)生物学功能,本研究根据FTH1蛋白核苷酸序列,分别设计4条特异性小干扰RNA(short interfering RNA,siRNA)分子,亚克隆到RNAi-Ready pSIREN-RetroQ ZsGreen载体,并转染RAW264.7巨噬细胞,实时定量PCR筛选干扰效果最优的质粒;布鲁氏菌侵染干扰前、后的RAW264.7巨噬细胞,实时定量PCR检测布鲁氏菌基因16S rRNA和细胞凋亡相关基因的mRNA表达量。结果显示:获得了4条特异性siRNA分子,经测序正确,pSIREN-C siRNA质粒对FTH1干扰效果最高可达98%。干扰后布鲁氏菌侵染抑制率为84%,凋亡相关基因的mRNA表达量5个降低,3个上升。本研究表明:FTH1基因沉默后布鲁氏菌胞内的生存能力下降;布鲁氏菌侵染可以抑制细胞凋亡发生,FTH1基因沉默后细胞凋亡升高。     

特异性siRNA对大鼠肝星状细胞TIMP-1表达的影响

观察金属蛋白酶组织抑制因子-1（TIMP-1）小干扰RNA真核表达载体转染肝星状细胞株HSC-T6后TIMP-1基因表达的情况。构建携带绿色荧光蛋白（GFP）基因的小干扰RNA真核表达载体pGCsi-U6／TIMP-1 shRNA,利用该载体介导四个特异性和一个非特异性的TIMP-1 shRNA,分别为TIMP-1 shRNA1、TIMP-1 shRNA2、TIMP-1 shRNA3、TIMP-1 shRNA4和TIMP-1 shRNA—NON。采用阳离子脂质体介导法转染HSC-T6细胞,激光共聚焦显微镜观察GFP表达,荧光实时定量PCR方法检测TIMP-1 mRNA表达情况。质粒转染HSC—T6细胞后,激光共聚焦显微镜观察转染组细胞内均见绿色荧光,未转染组未见绿色荧光;mRNA水平检测显示：与正常对照组相比,TIMP-1 shRNA1、TIMP—1 shRNA2和TIMP-1 shRNA4对TIMP-1基因表达较强的抑制作用,尤TIMP-1 shRNA1抑制作用最强（P〈0．01）。pGCsi—U6介导的TIMP-1 shRNA1能更加有效的抑制肝星状细胞中TIMP—1的表达。     

低表达长非编码RNA MALAT1对人宫颈癌HeLa细胞体外生长和迁移的影响

设计3个针对MALAT1不同靶序列的小干扰RNA(small interfering RNA, siRNA), 筛选出有效的siRNA序列, 设计并构建短发夹RNA(short hairpin RNA, shRNA)干扰质粒, 转染到HeLa细胞中, 构建低表达MALAT1的稳定细胞株.通过细胞的生长曲线和细胞划痕实验验证降低MALAT1对HeLa细胞增殖和迁移的影响.结果显示MALAT1表达水平在HeLa细胞中得到有效地降低, 低表达MALAT1的HeLa细胞生长速度和迁移速度减小.表明MALAT1在HeLa细胞中具有调控细胞增殖和迁移的能力     

新型呼肠病毒S1基因与宿主细胞相互作用的初步研究

摘要 目的 筛选出新型呼肠病毒S1基因和宿主相互作用的关键区段,为后续的宿主受体蛋白筛选工作提供可靠的基础。 方法 将编码全长S1基因,以及N端和C端阅读框分别克隆入真核表达载体pIRSE2-EGFP,转染敏感细胞株鼠成纤维细胞（L929）和人宫颈癌细胞（Hela）后,通过荧光报告基因EGFP的表达分析,筛选出S1基因与宿主细胞相互作用时起决定性影响的区段。 结果 同等量的3种真核表达质粒在单独转染L929时,pGSN质粒转染后荧光表达量最大,pGSC质粒转染后荧光表达量最小。 不同比例混合的pGS与pGSN进行共转染时,pGSN在转染质粒中的比例越高,荧光表达量也越高。 在Hela细胞中的转染结果与L929相同。 结论 新型呼肠病毒R4株的S1基因N端阅读框编码区（62-406bp）在S1基因转染时起关键作用。     

AGO1基因对拟南芥叶边缘锯齿状发育的影响

在拟南芥和水稻中Argonaute(AGO)蛋白是RNA介导的沉默复合体(RISC)的核心组分,在植物叶极性的分化方面具有重要的调节作用。实验根据AGO1基因序列设计一对特异引物,提取野生型拟南芥RNA作为模板,采用反转录PCR方法扩增出AGO1基因,并插入到克隆载体pGEM-T中。筛选鉴定后将AGO1连接到植物表达载体pBI121上,构建起植物表达载体pBI121-AGO1。并且利用农杆菌介导的方法转化拟南芥,通过抗性筛选,获得转基因植株。然后对转基因植株进行表型分析及AGO1蛋白的RT-PCR检测。通过对转基因拟南芥表达分析发现,与野生型拟南芥相比超表达AGO1蛋白的转基因拟南芥叶片明显呈锯齿状,说明AGO1基因影响拟南芥叶片发育。     

快速检测猪瘟兔化弱毒疫苗株的TaqMan荧光定量RT-PCR方法的建立

在猪瘟病毒兔化弱毒疫苗株（HCLV）的5′端非编码区设计一对引物和一条TaqMan探针,通过优化反应条件,成功建立了特异性检测HCLV的荧光定量RT-PCR方法．结果表明：该方法检测的最低拷贝数为45拷贝／μL,灵敏度比普通PCR方法高10^4倍,在较广的范围内（4．5×10^1-4．5×10^6拷贝／μL）有良好的线性关系（r=0．994）;分别以乙型脑炎病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、副猪嗜血杆菌、牛病毒性腹泻,黏膜病病毒作为模板进行TaqMan RT-PCR扩增,未出现阳性信号：4个不同浓度标准品组内试验变异系数为1．90％～5．82％,组间试验变异系数为4．02％～5．69％：HCLV3个cDNA样本组内试验变异系数为3．72％～4．93％;组间试验变异系数为2．99％～4．02％．该方法具有很好的灵敏性、特异性及稳定性,能够快速准确定量检测HCLV,为HCLV疫苗的研制、猪瘟病毒分子生物学等方面研究提供了一种快捷有效的工具．     

通过载体表达siRNAs抑制禽流感病毒复制的研究

禽流感病毒是养禽业危害最严重的病原微生物之一。为探讨小干涉RNA(siRNA)对A型禽流感病毒复制的干扰作用,以H5亚型AIV PB2基因为靶序列,设计合成了4对编码siRNAs的DNA序列,将其克隆到psiRNA-hH1neo载体中,构建siRNAs表达载体,鉴定正确后将重组质粒转染MDCK细胞,采用G418筛选建立抗性细胞系,用血凝(HA)试验和real time RT-PCR试验检测抑制效果, 在细胞水平筛选出具有高效抑制AIV复制的2个靶位点PB2-1154、PB2-342、为AIV的基因功能研究,抗病毒药物的开发和转基因动物的研究奠定了基础。