液质联用法分离鉴定甜叶菊叶片中的不同甜菊糖苷

为了进一步完善甜叶菊叶片中不同甜菊糖苷的测定方法,采用液质联用技术对多种甜菊糖苷标准品和‘鑫丰3号’甜叶菊叶片粗提物进行分析测定。最终共确定12种甜菊糖苷的出峰时间和顺序,其中甜茶苷、甜菊糖双苷和莱鲍迪苷E的出峰时间和顺序为首次确定。基于莱鲍迪苷A的测定标准曲线和多种甜菊糖苷的高效液相检测图谱结果确定‘鑫丰3号’叶片中的甜菊糖苷组成。‘鑫丰3号’叶片中共含有甜菊苷,莱鲍迪苷A、B、C、D、E和莱鲍迪苷F,甜茶苷,甜菊糖双苷9种甜菊糖苷,其中莱鲍迪苷D和E为痕量存在。本研究不仅为后续甜菊糖苷的测定提供了目前已有报道中最全面的紫外检测图谱依据同时也为新类型甜菊糖苷的发现和鉴定提供了方法参考。     

液质联用法分离鉴定甜叶菊叶片中的甜菊糖苷

为了进一步完善甜叶菊叶片中不同甜菊糖苷的测定方法,采用液质联用技术对多种甜菊糖苷标准品和‘鑫丰3号’甜叶菊叶片粗提物进行分析测定。最终共确定12种甜菊糖苷的出峰时间和顺序,其中甜茶苷、甜菊糖双苷和莱鲍迪苷E的出峰时间和顺序为首次确定。基于莱鲍迪苷A的测定标准曲线和多种甜菊糖苷的高效液相检测图谱结果确定‘鑫丰3号’叶片中的甜菊糖苷组成。‘鑫丰3号’叶片中共含有甜菊苷,莱鲍迪苷A、B、C、D、E和莱鲍迪苷F,甜茶苷,甜菊糖双苷9种甜菊糖苷,其中莱鲍迪苷D和E为痕量存在。本研究不仅为后续甜菊糖苷的测定提供了最全面的紫外检测图谱依据,同时也为新类型甜菊糖苷的发现和鉴定提供了方法参考。     

甜叶菊甜菊醇糖苷生物合成关键酶基因表达量与莱宝迪苷A含量的相关关系

莱宝迪苷A(rebaudioside,RA)是甜叶菊甜菊醇糖苷中的主要甜味成分,其含量受到生物合成中多个酶基因的影响。本研究以6个甜叶菊品种为材料,利用实时荧光定量RT-PCR测定RA生物合成途径中UGT85C2、UGT91D2m和UGT76G1三个关键酶基因的表达量,并与其RA含量进行相关性分析。结果显示UGT76G1基因相对表达量与RA含量有极显著相关关系(p=0.008),而UGT85C2和UGT91D2m基因表达量与RA含量无相关关系,说明UGT76G1基因的表达对RA合成有着较为重要的影响。研究结果可为利用基因工程手段人为调控甜菊醇糖苷的生物合成,提高RA的含量提供理论依据。     

金银花糖基转移酶基因LjUGT71E1的克隆及原核表达

糖基化广泛存在于生物体中,具有非常重要的作用,而糖基转移酶则是催化糖基化反应的关键酶。本研究根据转录组数据库,设计引物从金银花(Lonicera japonica Thunb.)中克隆得到一个糖基转移酶编码基因LjUGT71E1,序列分析表明该基因的CDS为1 503 bp,理论可编码氨基酸数目为501,等电点(p I)预测为5.09,理论分子量为55 579.71 Da。多重序列比对表明LjUGT71E1与其它植物UGT71家族成员在序列上保守性很高,并且其C端具有催化植物次生代谢产物糖基化的糖基转移酶所具有的保守的PSPG-box基序。系统发生分析表明LjUGT71E1与人参(Panax ginseng)和甜叶菊(Stevia rebaudiana)的UGT71E亚家族成员聚为一支。荧光定量PCR分析表明,该基因在金银花的五个花期均有表达,在幼蕾时期相对表达量达到峰值。进一步构建了LjUGT71E1基因的原核表达载体并且在大肠杆菌中诱导表达得到重组蛋白,为后续的功能研究提供了基础。     

大豆异黄酮相关基因GmUGT73克隆及功能初步鉴定

UGT是一类糖基转移酶,它对黄酮类化合物进行糖基化修饰,合成异黄酮糖苷,在异黄酮的合成、转运、存储等方面发挥了重要的作用。为了探索UGT功能,通过RT-PCR方法从中豆27中克隆获得GmUGT73基因的CDS全长序列。利用ProtParam tool等在线软件对GmUGT73蛋白序列及理化性质进行分析,预测结果表明,GmUGT73基因的编码区编码464个氨基酸,分子质量为51.186 5 ku,理论等电点(pI)为6.27,总原子数为7 176,分子式为C_(2281)H_(3580)N_(608)O_(685)S_(22)。GmUGT73蛋白总正电和负电残基数分别为37和41,蛋白的不稳定系数为36.93,表明该蛋白较稳定,蛋白的脂溶指数为86.19,GRAVY值为-0.111,说明该蛋白为亲水性蛋白。将线性植物表达载体与目的片段进行连接,成功构建pCambia3300-GmUGT73植物表达载体,通过发根农杆菌介导法转化大豆毛状根并获得转基因阳性根系,利用高效液相色谱(HPLC)对根系进行异黄酮含量测定,结果表明,转基因阳性根中异黄酮含量与对照相比极显著提高(P0.01),说明该基因可能具有促进合成大豆异黄酮的功能。     

安徽农业大学茶学国家重点实验室揭示香气物质糖基化能够介导茶树抗寒性的作用机理

正近日,安徽农业大学茶树生物学与资源利用国家重点实验室宋传奎教授团队发表研究论文(https://nph.onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1111/nph.16364),首次发现挥发性香气物质橙花叔醇调控茶树抗寒性的新功能,并鉴定到控制橙花叔醇糖苷合成的糖基转移酶基因UGT91Q2。该研究首先明确了作为橙花叔醇储存形式的橙花叔醇糖苷在低温下积累,通过低温诱导表达模     

毛竹中黄酮-C-糖基转移酶基因的克隆和生物信息学分析

糖基转移酶是催化黄酮糖苷形成的关键酶。黄酮糖苷类化合物具有抗氧化、清除自由基、调节血脂和血糖等生理作用。基于毛竹基因库测序的完成,本研究通过RT-PCR技术首次获得一条完整的毛竹黄酮-C-糖基转移酶基因开放阅读框,将其命名为PeCGT,其基因的序列长度是1342 bp。对其编码蛋白的理化性质、保守结构域以及二级结构和空间结构等进行了生物信息学分析。结果表明:PeCGT基因编码的蛋白含有447个氨基酸,分子量是47.76 kD,理论等电点为4.91,酸性氨基酸(Asp+Glu)个数为54,碱性氨基酸(Arg+Lys)个数为35。PeCGT蛋白是疏水型蛋白,不存在信号肽,存在于线粒体中。结构域预测分析结果表明,PeCGT编码的氨基酸序列具有明显的糖基转移酶特征的保守域结构PSPG。通过同源性分析,其与乌拉图小麦(Triticum urartu)、节节麦(Aegilops tauschii subsp.Tauschii)和二穗短柄草(Brachypodium distachyonhiihii)具有较高的同源性。实时荧光定量PCR结果表明:PeCGT基因在叶中的表达量最高,在根中几乎不表达,在茎中有部分表达。此研究结果为以后毛竹黄酮-C-糖基转移酶的表达和功能鉴定提供了一定的帮助。     

独行菜UGT74B1基因的序列结构分析及时空表达特性

芥子油苷是独行菜种子的重要药用活性物质,也是重要的植物代谢调节物。但独行菜芥子油苷的合成途径及其调节还不清楚。为了探讨独行菜芥子油苷合成与生长阶段、组织器官的关系,本研究基于独行菜种子转录组数据库,以UGT (尿苷二磷酸-糖基转移酶)为关键词筛选在芥子油苷核心结构起修饰作用的关键酶基因序列,并对其结构及表达特性进行分析。结果表明,独行菜种子萌发中有98条Unigenes,其中一条c19350_g1与拟南芥UGT74B1相似性最高。进一步采用RT-PCR技术克隆到独行菜UGT74B1基因,命名为LaUGT74B1,结构分析显示,该基因的c DNA序列编码区为1 386 bp,编码产物为461个氨基酸的蛋白,蛋白的理论等电点为5.38,其不稳定系数为34.70,为稳定蛋白质,不具有跨膜结构。其二级结构主要由α螺旋和无规则卷曲构成,与独行菜与琴叶拟南芥、亚麻荠、荠菜的UGT74B1的序列相似性较高。另外,LaUGT74B1表达具有时空特异性,萌发阶段表达量呈现先下降后上升的变化趋势,苗期主要在叶中表达,花期主要在根中,结实期主要在老茎中。本研究结果可为独行菜芥子油苷生物合成途径阐明提供初步的试验基础。     

马铃薯块茎糖基转移酶基因的克隆及其RNAi载体的构建

为探讨鼠李糖基转移酶(rhamnosyltransferase, sgt3)基因与类固醇糖苷生物碱(steroidal glycoalkaloid, SGAs)合成关系, 揭示sgt3基因在SGAs合成中的作用, 本研究根据GenBanK No：DQ266437保守区设计特异引物, 通过RT-PCR技术获得马铃薯块茎sgt3相似基因;采用生物信息学相关软件分析, 预测sgt3相似基因cDNA序列编码的蛋白质结构和功能, 构建基于sgt3基因的植物干扰表达载体。结果表明, 克隆的sgt3相似基因与报道的sgt3基因序列相似性达到99.54%, 其ORF长1 500 bp, 编码505个氨基酸残基, 具有UDPG糖基转移酶保守结构域及许多重要功能位点;三级结构预测表明, 该氨基酸同糖基转移酶单体结构模型相似, 为糖基转移酶家族成员, 表明可能具有合成类固醇糖苷生物碱功能, 基因序列已注册到GenBank, 序列登录号为HM188447。以此为靶序列, 构建由Actin启动子和CIPP启动子驱动的与sgt1和sgt2基因相似度高的含有sgt3基因序列的干扰表达载体, 将为糖苷生物碱的合成、代谢的进一步研究及低糖苷生物碱转基因马铃薯品种的培育奠定基础。     

杜仲EuGT2基因的原核表达及蛋白纯化

本研究以克隆所得杜仲(Eucommia ulmoides)EuGT2基因为基础,利用基因重组技术构建原核表达载体pMCSG19-EuGT2。重组载体转化到E.coli Rosetta(DE3)中,用0.05 mmol/L异丙基β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)在37℃下诱导6 h。使用镍-亚氨基二乙酸(Ni-IDA)亲和层析柱进行纯化,并用15%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝胶电泳进行检测。研究结果表明,杜仲EuGT2基因在E.coli Rosetta(DE3)中得到成功表达,重组蛋白表达形式为部分包涵体、部分可溶性蛋白。经SDS-PAGE凝胶电泳检测,在相对分子质量约56 kD处有1条特异性蛋白条带,经质谱鉴定该特异性蛋白条带确为杜仲EuGT2蛋白。以上研究结果为后续研究杜仲糖基转移酶的功能提供了科学依据。     

不同基因型甜叶菊产量和甜菊糖苷含量研究

为了充分了解甜叶菊的生态适应性,为甘肃甜叶菊生产基地建设提供理论支持,从江苏、河北、安徽等地引进7个甜叶菊进行栽培比较试验,通过对参试基因型的生长特性、产量和甜叶菊糖苷含量分析结果表明：甜叶菊具有较强的适应性,在西北地区可以广泛种植;引进的ZS-4的干叶产量和茎杆产量都最高,达4801.50kg/hm2和5647.33 kg/hm2;ZS-3的莱苞迪苷A和总苷含量都高,分别为7.69％、12.39％,达极显著水平。综合分析得出,ZS-3甜叶菊糖苷产量最高,可以作为优势种在河西推广栽培,ZS-4也具有一定的推广价值。     

杜仲EuGT2基因的克隆及表达分析

糖基转移酶(glycosyltransferase,GT,EC 2.4.x.y)是植物次生代谢过程中一类重要的结构修饰酶,可参与催化受体分子进行糖基化修饰。本研究以杜仲为材料,基于前期构建的杜仲转录组数据设计杜仲糖基转移酶编码基因EuGT2克隆引物,克隆得到全长为285 bp的EuGT2片段,序列分析表明,该基因可编码94个氨基酸,且EuGT 2蛋白结构预测表明,该蛋白分子量为11.2 kDa,理论等电点(pI)为7.88,无信号肽、无跨膜结构域,属疏水性蛋白。蛋白同源序列比对以及系统进化树分析结果表明,与黄灯笼辣椒(Capsicum chinense)的糖基转移酶CcGT 6的亲缘关系较近,序列同源一致度为69.14%。Real-time PCR分析表明,EuGT2基因在杜仲初生幼苗期(2片真叶)的根、茎和叶中表达量没有显著差异性,而在杜仲小苗期(初生)的各器官中出现显著差异,其中EuGT2在茎中的表达量最高,分别为幼苗生长30 d左右根和叶片中表达量的2.5倍和5.5倍。     

Development of a sequence-specific PCR marker linked to the Ku gene which removes the vernalization requirement in narrow-leafed lupin

Wild types of Lupinus angustifolius require vernalization to promote flowering. Modern domesticated cultivars carry the early-flowering gene Ku which removes this requirement. A microsatellite-anchored fragment length polymorphism marker was identified as co-segregating with the Ku gene in a recombinant inbred line (RIL) population derived from a domesticated × wild-type cross. DNA sequencing showed that the marker contained a 7 bp insertion/deletion polymorphism, as well as a single nucleotide polymorphism. A pair of sequence-specific primers was designed and successfully converted the size polymorphism into a simple polymerase chain reaction based co-dominant marker. This marker is closely linked to the Ku gene, as it co-segregates with the Ku phenotyping in a population consisting of 106 RILs.     

Principal Axis Rotating Speed Control System of Friction Welding Machine

Based-on the new 8-bit microcontroller P89C51RD2 of PHILIPS company,the principal axis rotating speed of friction welding machine is controlled in closed loop by the system. That guarantee the stability of important parameter in friction welding.The design of software and hardware and the principle of the system is introduced detailedly.The output pulse of photo- coder is measured by using catching mode of P89C51RD2' PCA.And the D/A conversion is achieved by PWM pulse wide modulate mode of P89C51RD2' PCA also. With ISP function, the system program can be written or upgraded on-line and with long-distance.The whole circuit formed in module is very concision.The system runs well in practical production.     

Identification and fine mapping of a candidate gene for oil yellow leaf 2 conferring yellow leaf phenotype in maize

Leaf colour is an important agronomic trait for studying molecular mechanisms in chlorophyll biosynthesis and chloroplast development. Here, a novel mutant oil yellow leaf 2 (Oy2) with a typical yellow leaf phenotype at the seedling stage was identified from the mutant population derived from the maize inbred line RP125. Compared with wild type, Oy2 mutant displays decreased chlorophyll content, reduced photosynthetic capacity and impaired chloroplast structure, which is likely controlled by a single recessive gene. The Oy2 locus was then delimited into a 117 kb region on chromosome 5 harbouring four genes, amongst which the gene Zm00001d013013, encoding a magnesium chelatase subunit D, was identified as the only candidate gene associated with Oy2 mutant phenotype. Moreover, the expression levels of candidate gene Oy2 and genes associated with chlorophyll biosynthesis and photosynthesis were tested by RNA‐seq and qRT‐PCR, implying that the causal gene Oy2 playing a critical role in chlorophyll synthesis. Taken together, we propose that the causal gene Oy2 highly associated with the yellow leaf phenotype may be helpful in elucidating photosynthetic pigments biosynthesis and chloroplast development in maize.     

Identification and verification of pleiotropic QTL controlling multiple amino acid contents in soybean seed

Soybean is important throughout the world due to its high seed protein and oil, while the quality and quantity of seed amino acids need to be improved. To improve the multiple amino acid concentrations in soybean simultaneously, detecting and utilizing the pleiotropic quantitative trait loci (QTL) and related genes become increasingly important. In view of this, a F_6:7 recombinant inbred line population was genotyped using 1739 polymorphic SNP and 127 SSR markers in the present study and was phenotyped for seventeen types of amino acids simultaneously. In total, twelve co-located or overlapped pleiotropic additive QTL clusters, which explained 2.38–16.79% of the amino acid variation, were identified. Of them, one novel pleiotropic QTL cluster with a phenotypic variation explained ranging from 8.84 to 16.79% for ten kinds of amino acid contents (glycine, alanine, isoleucine, leucine, valine, methionine, aspartic acid, glutamic acid, lysine and phenylalanine), was located at the same position on linkage group D2, and the confidence interval was only 0.8 cM. Moreover, the individuals in this family-based population (345 lines) and another cultivar-based population (254 varieties) with different genotypes at the common flanking markers for this QTL cluster showed significantly different amino acid contents, which further validated the QTL mapping results. Additionally, some candidate genes that might participate in the amino acid biosynthesis process were found in these pleiotropic QTL regions. Thus, novel pleiotropic QTL clusters could be applied in marker-assisted selection breeding or map-based candidate gene cloning in soybean for multiple amino acid genetic improvements in seed in the future.