基于苦瓜转录组序列的SSR分子标记开发

为了全面了解苦瓜转录组SSR位点特征和满足苦瓜分子育种对分子标记的需求,利用MISA软件对来自苦瓜材料‘大沥-11’6个组织的59740条转录组Unigene序列进行SSR位点搜索,共检测出31066个SSR位点,出现频率(发现的SSR个数与总Unigene数之比)为52.00%,平均每2.62 kb出现1个SSR位点。在苦瓜转录组SSR位点中,基元类型主要为三核苷酸,占总SSR位点的42.17%;其次是二核苷酸,占总SSR位点的31.66%。利用Primer 3软件对搜索到的苦瓜转录组SSR位点进行引物设计,然后把获得的引物序列比对回苦瓜的参考基因组,选择上下游引物序列都是唯一比对的序列并去除重复后共获得9135对特异SSR引物。选择MC00上的232对特异SSR引物对‘谭边大顶’和‘华艺320’两个苦瓜品种基因组DNA进行PCR扩增,其中有219对特异引物可扩增出清晰的条带,有效扩增率为94.40%;有31对特异引物扩增产物表现出多态性,多态率为13.36%。本研究开发的苦瓜转录组特异SSR引物为苦瓜的种质资源分析、基因定位、分子标记辅助选择等理论与应用研究提供了引物数据参考。     

基于RAD-seq的荸荠SSR标记开发

荸荠(Eleocharis dulcis)是一种重要的特色水生蔬菜,为开发用于荸荠遗传学研究的简单重复序列(SSR)分子标记,本研究基于RAD-seq技术对荸荠进行简化基因组测序,并进行SSR标记开发与引物设计。结果显示,共检测到5039个SSR位点,其中4127个SSR位点可利用并成功设计引物。在可利用的SSR位点中,三碱基重复基序类型所占比例最高,数量为1894个,占位点总数的45.89%;其次是二碱基重复基序类型,数量为1406个,占位点总数的34.07%。随机选取了100对引物进行有效性验证,扩增成功率为93%,从扩增成功的引物中选取83对引物对两个品种进行多态性检测,83对引物共得到232条条带,其中多态性条带为128条,具有多态性的引物为60对,多态性比率为72.28%。通过RAD-seq开发的荸荠SSR标记有效性和多态性较高,为后期荸荠种质资源的高效利用、品种的遗传改良及分子育种提供了基础。     

基于转录组测序的黑枣EST-SSR引物开发与鉴定分析

目前黑枣已有的分子标记比较匮乏,本研究基于转录组测序技术对黑枣品种进行SSR引物开发,为黑枣种质资源评价及分子标记辅助育种提供有力的技术支持。本研究对‘冀洪1号’黑枣转录组序列进行了分析筛选和开发,并利用开发出的引物进行了验证分析。结果表明:共得到52 537个Unigene序列,SSR位点总数22 327个,包含SSR的Unigene序列数为15 286条。黑枣SSR位点的重复单元中,二核苷酸重复类型的SSR最多(52.26%),其次为单核苷酸(25.84%)及三核苷酸(19.25%)。随机挑选90对EST-SSR引物进行验证,有效扩增率为77.78%(70对),多态性引物比例为18.57%(13对),对13个多态性位点进一步分析可得,共扩增了35个等位基因,PIC值介于0.233~0.677之间,平均为0.430。本研究开发出的EST-SSR分子标记,为后期进行黑枣良种的鉴别及分子育种提供了分子技术手段。     

苦荞全基因组SSR位点特征分析与分子标记开发

目前苦荞SSR多态性标记数量较少,根据已发表的苦荞基因组测序数据,利用MISA软件对1~6核苷酸重复的SSR位点进行了查找和序列特征分析,批量设计引物并对引物进行了有效性和多态性检测。结果表明,苦荞基因组中共检测到1 640个SSR位点,其中三核苷酸重复型SSR最多,占比63.29%,五核苷酸重复型最少,仅占0.12%。AT/TA、AAG/CTT、ACC/GGT和ATC/GAT为出现频率较高的重复基序。苦荞基因组SSR序列长度变化范围为12~476bp,平均长度23.14bp,长度12~19bp的占比71.71%,长度≥20bp的占比28.29%。根据不同类型SSR位点设计并合成引物479对,选择200对引物对5份苦荞资源和3份甜荞资源进行多态性检测,有56对扩增出多态性条带,17对在苦荞种质中产生多态性条带,48对在甜荞种质中产生多态性条带,9对同时在两种种质中产生多态性条带。利用苦荞全基因组序列可实现SSR标记的批量开发,可鉴定出适用于苦荞和甜荞遗传多样性分析、遗传图谱构建和品种鉴定等研究的SSR引物。     

海滨雀稗EST资源的SSR信息分析及EST-SSR标记开发

本研究探讨海滨雀稗EST序列中SSR位点的分布特征,开发EST-SSR引物分析其在草坪草种质资源遗传多样性研究中的应用。利用SSRIT软件对81220条海滨雀稗EST序列进行SSR位点搜索,分析EST-SSR的分布和特点,并利用Primer 3.0软件设计50对引物,选择10份草坪草对引物进行有效性和多态性检测。结果表明,从13705条海滨雀稗EST序列中检测到了22721个SSR位点,出现频率为16.87%。三核苷和单核苷酸重复为主要类型,所占比例分别为31.71%和29.28%。在检测到的163种基元中,出现最多的重复基元是A/T,其次是CCG/CGG和AGC/CTG。选择合成了50对EST-SSR引物,以海滨雀稗‘Adalady’基因组DNA为模板进行PCR扩增,其中37对引物能扩增出条带。利用这些引物对10份草坪草品种进行多态性检测,其中12对引物的扩增结果具有多态性。利用开发的EST-SSR标记对10份草坪草进行聚类分析,可将其分为4类。利用海滨雀稗EST序列开发SSR标记是可行的,开发的EST-SSR标记能有效用于草坪草遗传多样性研究。     

普通菜豆基因组SSR标记开发及在豇豆和小豆中的通用性分析

分子标记具种属间通用性可提高其利用效率,并降低标记开发成本。本研究基于Roche 454超高通量测序技术获得普通菜豆基因组测序结果,共开发了560个普通菜豆基因组SSR标记。利用2份普通菜豆品种对标记进行初步筛选,有421个标记能够有效扩增。用新开发的标记分析16份豇豆和16份小豆的通用性。结果显示,185个普通菜豆基因组SSR标记在豇豆中能有效扩增,通用性比率为43.9%;161个SSR标记在小豆中能有效扩增,通用性比率为38.2%;在豇豆和小豆中都能获得有效扩增条带的标记共138个;并且普通菜豆基因序列SSR标记在豇豆和小豆中的通用性比率高于基因间序列SSR标记。通用性标记的多态性分析表明,豇豆和小豆的多态性比率分别为34.0%和24.8%;且豇豆和小豆中基因间标记的多态性都比基因内标记的多态性高。上述通用性标记为豇豆属作物的多样性评价、连锁图谱的构建及基因定位等方面的研究提供了便利。     

基因组DNA混合池技术在SSR引物筛选中的可靠性分析

SSR-PCR产物的重测序是SSR标记技术开发和应用的必要步骤。本研究以6个桉树DNA样品为对照组,1个基因组DNA混合池为试验组进行基因组DNA混合池在SSR引物筛选中的可靠性性分析。通过SSR-PCR产物的重测序分析,6个桉树单一DNA样品与基因组DNA混合池的扩增序列比对结果分析显示,两种模板扩增结果差异不显著,即基因组DNA混合池可以替代多个单一DNA样品进行SSR引物的高效筛选。利用20对SSR引物在6种桉树DNA样品中的扩增序列进行多态性分析发现,同一位点不同桉树种间的扩增序列存在长度多态性和核苷酸多态性,从而证实了SSR序列的多态性和复杂性,为SSR标记技术在桉树遗传育种研究中的应用提供了理论依据。     

桃(Prunus persica [L.] Batsch)转录组SSR信息分析及其分子标记开发

利用MISA软件筛选桃(Prunus persica[L.]Batsch)转录组数据,获得的109 248条Unigene,检测出24 102个SSR位点,分布于22 689条Unigene中,出现频率为20.76%。SSRs位点中主导类型是以AG/CT(占总SSRs的18.70%)为主的二核苷酸重复,占总SSRs的33%;其次是三核苷酸重复,出现频率为27%;四核苷酸重复,占总SSRs的25%。利用Primer 5共设计出9 657对SSR引物。随机选择50对引物进行PCR扩增,其中20对扩增出清晰可重复的条带,并且在同属材料(苹果试材)中也能获得理想结果,引物多态性检测发现,在15份桃试材中,10对引物具有多态性,利用UPGMA作图,可将15个桃材料很好区分。结果表明,桃转录组测序产生的Unigene是开发SSR标记的有效信息,为SSR标记在桃的遗传分析上提供可靠的标记选择。     

基于雌雄花序表达谱测序的板栗SSR标记开发及其应用

本研究基于板栗雌雄花差异表达谱数据库,筛选鉴定到雌雄花特异表达基因,在雌雄花特异表达基因中识别和定位了19个SSR位点。通过在SSR两端设计特异引物,经过PCR扩增,筛选到5对多态性和稳定性较好的引物。进一步采用毛细管电泳检测技术对17份板栗资源进行亲缘关系分析。结果显示17个品种可分为3大类,其中第Ⅰ类群包含‘超短枝1号’、‘超短枝2号’、‘沂蒙短枝’、‘燕红’等6个品种,主要为北方板栗品种;第Ⅱ类群中包含10份资源,主要为包括湖北地方品种在内的南方板栗品种;第Ⅲ类仅包括‘金栗王’,与前两大类亲缘关系明显较远。本研究开发的SSR分子标记重复性和多态性较高,可用于板栗资源遗传多样性分析,并为开发板栗雌雄花特异分子标记提供科学依据。     

葡萄种质资源亲缘关系的SSR分析

对供试材料进行亲缘关系分析,为葡萄分类、种质鉴定和育种提供重要依据。利用SSR标记对新疆44个相对适宜制干葡萄品种（系）材料进行了遗传多样性分析。从52对SSR引物中筛选出8对用于葡萄的SSR扩增,共扩增出190条带,均为多态性条带,多态性百分率为100%。多态性信息含量指数(PIC)变幅为0.6868~0.9640,平均为0.9084。根据SSR扩增结果,Jaccard相似性系数分析表明44份葡萄材料的遗传相似系数的变异范围为0.63~0.92,平均遗传相似系数为0.775。UPGMA聚类分析表明,在遗传相似系数0.654处,可将44份供试材料分为5个类群：第1类包括‘奥迪亚无核’、‘赫什无核’等22份葡萄;第2类包括‘无核白鸡心’、‘葡萄园皇后’等7份葡萄;第3类包括‘美丽无核’、‘艾麦纳’等5份葡萄;第4类包括‘黎明无核’、‘红脸无核’等6份葡萄;第5类包括‘白香蕉’、‘波尔莱特’等4份葡萄。SSR标记能比较准确地检测基因型之间的遗传背景与遗传关系,其中亲缘关系较远的不同类群间及亚类间的种质资源可作为杂交育种的亲本。     

基于全基因组重测序信息开发玉米H99自交系特异分子标记

随着基因组测序技术和计算生物学的发展,利用生物信息学的方法大规模挖掘基因组特异分子标记已成为可能。玉米自交系H99具有较强的可再生能力,是玉米转基因研究的主要供体材料,但是目前对H99基因组信息了解甚少。本研究利用高通量Illumina测序技术,对H99全基因组进行重测序,利用生物信息学手段大规模挖掘并开发了4043个H99特异性的SSR分子标记。随后利用模拟PCR策略,对开发的SSR分子标记进行电子多态性筛选,针对B73×H99、Mo17×H99和B73×Mo17三个群体亲本组合共开发2699候选的特异多态性SSR分子标记。随机挑选20对SSR分子标记对群体亲本B73、H99和Mo17进行多态性筛选,进一步证实候选的多态性具有95%的准确率。此外,基于B73参考序列对开发的多态性SSR分子标记进行全基因组染色体定位及基因注释,揭示了候选多态性SSR分子标记在全基因组及基因内的分布特征。为玉米自交系H99开发了大量的分子标记资源,同时也为快速开发品种间多态性分子标记提供了一套高效可行的分析方法。     

国内外甘蓝型油菜种质SSR标记遗传多样性分析

用SSR分子标记对国内外48份甘蓝型油菜品种进行遗传多样性分析,结果表明：筛选出的45对引物共扩增出326个位点,多态位点281个,多态性比率为86.2%;平均每对引物扩增的条带数和多态性条带数分别为7.2和6.2。多态性信息含量（PIC）在0.374~0.856,平均为0.699。遗传相似系数在0.48~0.79之间,参试材料差异较大;以0.51为阈值将48份参试材料划分为冬性、半冬性和春性三大类群,三大类群间相对独立又有一定程度的渗透,说明材料之间存在不同程度的亲缘关系。主成分分析与聚类分析结果一致。说明SSR标记能够较全面地反应种质材料的遗传多样性,能够为种质的保存提供帮助,同时可以用来分析育种材料的遗传多样性,对育种工作有重要的参考意义。     

绿豆SSR标记的开发及遗传多样性分析

SSR标记以其数量丰富、多态性好、共显性遗传等优点在基础研究和育种工作中发挥了重要作用,但目前绿豆基因组中的SSR标记依然较少。本研究将磁珠富集法和测序技术相结合高通量检测绿豆基因组SSR位点,鉴定出3,275,355个SSR位点,开发了2742个SSR标记。选取其中157个SSR进行PCR验证,发现有90个(57.33%)标记在10份材料中表现出多态性。挑选40个条带清晰、多态性高、染色体上均匀分布的标记对90份绿豆资源进行遗传多样性分析,单个位点检测到的等位变异数为2~8个,平均为3.0个,有效等位基因数为1.31~4.21个,平均为2.16。Nei’s基因多样性指数在0.23~0.76之间,平均为0.51。多态性信息含量为0.22~0.72,平均为0.43。聚类分析将90份材料分为2个类群,包含4个组。第I组主要由北方资源组成,第Ⅱ组种质来源较为分散,第Ⅲ组主要由山东的资源构成,第Ⅳ组包含多数河北的种质资源。本研究开发的多态性SSR标记不仅可以用于绿豆种质资源的遗传多样性分析,也将在高密度遗传图谱构建、基因定位和分子标记辅助育种中发挥重要作用。     

ET-ISJ标记的开发及陆地棉遗传图谱构建

根据植物结构基因外显子拼接位点的保守序列,设计扩增外显子的ET-ISJ (exon targeted intron-exon splice junction)标记引物。利用1 280对ET-ISJ引物组合,在陆地棉品种渝棉1号和T586中,筛选获得69对多态性引物组合,占引物组合的5.4%。用多态性ET-ISJ引物组合检测(渝棉1号×T586)F_2:7重组近交系群体,得到70个位点。以70个ET-ISJ标记位点与523个SSR、59个IT-ISJ、29个SRAP和8个形态标记进行连锁分析,构建的遗传连锁图谱包括59个连锁群和673个位点(68个ET-ISJ、510个SSR、58个IT-ISJ、29个SRAP和8个形态标记)。连锁图覆盖3 216.7 cM,占棉花基因组的72.3%,标记间平均长度为4.8 cM。68个ET-ISJ标记分布于20条染色体。研究表明ET-ISJ标记多态性较高、稳定性好,可有效用于棉花与其他植物遗传连锁图谱构建。     

新疆彩色棉23个品种指纹图谱的构建及遗传多样性分析

以新疆截止2012年审定的23份新彩棉品种为材料,利用SSR标记进行DNA指纹图谱的构建和遗传多样性分析。从5000对SSR引物中,挑选出多态性高、稳定性好、均匀分布在棉花26条染色体上的52对引物,在23份新彩棉品种中筛选出核心引物47对,SSR扩增检测到多态性基因型位点数共计162个,每个标记检测到的基因型位点数在2~7之间,平均为3.45个;引物多态信息量(PIC)值介于0.4537~0.8686之间,平均值为0.7096。结果显示:在23份新彩棉品种中,14份品种采用特异或特征引物可以一次性区分开,其余9份品种需要采用引物组合来实现区别该品种与其他品种。最少选用18对特异引物及组合引物就可以完全区分开新彩棉1~23号品种。利用18对SSR标记构建了新彩棉1号至23号品种的指纹图谱。利用NTSYS-pcV2.10软件聚类分析表明:23个新彩棉品种遗传相似系数变化范围是0.3781~0.9298,平均为0.5511,表明新彩棉品种之间存在着丰富的遗传多样性。     

利用SRAP与SSR标记分析不同类型甜菜的遗传多样性

为选育优质甜菜新品种, 指导种质资源引进和利用, 为进行分子标记辅助选择育种提供科学依据, 采用SRAP和SSR两种分子标记方法相结合, 对甜菜单胚雄性不育系及保持系等49份材料进行遗传多样性分析。利用4个表型差异显著的甜菜品系对SRAP的64对引物组合及SSR的11对引物组合进行扩增, 分别筛选出有效引物组合11对和9对。SRAP的11对引物组合共产生199条扩增带, 其中有86条多态性带, 多态性带的比率平均为43.7%。SSR的9对引物共产生35条扩增带, 多态性比率为100%。全部材料的平均遗传距离为0.3860, 平均遗传相似系数为0.6795, 大约30%的材料遗传距离或遗传相似系数具显著或极显著差异。遗传相似系数平均值比较, 多胚四倍体品系0.7264＞单胚杂交组合0.7243＞国外品种0.7060＞多胚二倍体品系0.6908＞单胚品系0.6837。在遗传距离0.20处, 将49个甜菜材料划分为A、B、C、D 4个类群, D类群又分为4个亚类, 较好地显示了甜菜材料丰富的遗传多样性。表明不同甜菜品种具有相当高的异质性, 国外与国内材料的遗传基础存在一定差异, 但生产应用的甜菜品种间存在亲缘关系较近、遗传基础较窄的倾向。     

Abundance, polymorphism and genetic mapping of microsatellites in oilseed rape (Brassica napus L.)

The objective of the present study was to estimate the abundance and degree of polymorphism of simple sequence repeat (SSR) markers in rapeseed. By screening about 45000 clones of a small inserts library of rapeseed total DNA the abundances of GA/TC and CA/TG simple sequence repeats in the rapeseed genome were estimated to be approximately one repeat every 100 kb and 400 kb, respectively. After sequencing 13 positive clones, primer pairs could be designed for 11 microsatellite loci. Seven of these primer pairs produced reproducible amplification products in a set of 31 rapeseed genotypes, with one pair amplifying two independent products, giving a total of eight amplified loci. The different microsatellite loci displayed between one and three visible alleles. At four loci, additional null alleles were observed. With up to four alleles, polymorphic microsatellite markers show significantly higher allele numbers in rapeseed than restriction fragment length polymorphism (RFLP) markers. Four of the eight microsatellite markers could be mapped on four different linkage groups of an RFLP map of the rapeseed genome.     

Association of molecular markers with cold tolerance and green period in zoysiagrass (Zoysia Willd.)

Cold tolerance and the green period are key traits in the breeding of zoysiagrass (Zoysia Willd.). Identification of molecular markers associated with cold tolerance and the green period of zoysiagrass will contribute to efficient selection of elite cultivars. These two traits were measured in 96 zoysiagrass accessions in 2004 and 2005–2006, respectively. The mapping population was screened with 29 pairs of simple sequence repeat (SSR) primers and 54 pairs of sequence-related amplified polymorphism (SRAP) primers. A multi-loci in silico mapping approach implemented with an empirical Bayes method was applied for association mapping of cold tolerance and green period. We detected 254 SSR polymorphic loci and 338 SRAP polymorphic loci, among which three SSR loci (Xgwm131-3B-187, Xgwm469-6D-194 and Xgwm234-5B-244) and one SRAP locus (Me11Em7-406) were significantly associated with cold tolerance with effect values of 57.83%, 38.05%, 36.92% and 37%, respectively. Three SSR loci (Xgwm132-6B-225, Xgwm111-7D-34 and Xgwm102-2D-97) and two SRAP loci (Me19Em5-359 and Me16Em8-483) were significantly associated with the green period with effect values of 79.54%, 62.59%, 99.04%, 49.01% and 82.57%. These markers will be useful for genetic improvement of the cold tolerance and green period of zoysiagrass by marker-assisted breeding.     

21种不同类型葡萄种质资源遗传多样性的SSR分析

本研究通过SSR标记解析不同类型葡萄种质遗传多样性差异和亲缘关系,为资源分类与品种鉴定提供理论依据。利用15对SSR引物对21种不同类型葡萄种质进行PCR扩增,对扩增情况、遗传距离与亲缘关系等进行分析。15对SSR引物共扩增出等位基因位点91个,其中多态性位点89个,多态性比率高达97.8%,其中13对引物扩增多态性百分率达到100%。21份供试材料间遗传相似系数变化范围在0.45~0.91之间,并在遗传相似系数0.62处被分为2个类群。研究表明SSR标记从分子水平上解析了不同类型葡萄种质的遗传差异性,揭示了材料间亲缘关系,为育种研究提供了一定参考依据。