棉花HSP70基因植物表达载体的构建及转化烟草的研究

为研究棉花HSP70 基因在转基因植物中抗旱效果,利用前期克隆的GhHSP70 基因,以pCAMBIA1304 质粒为植物表达载体,构建了GhHSP70 基因的植物表达载体CAMBIA1304-HSP70;采用冻融法转入根癌农杆菌EHA105 菌株,通过叶盘法对模式植物烟草进行遗传转化研究。结果表明,在潮霉素(50 mg/L)选择压力下获得的烟草转化不定芽和完整植株,经过PCR方法以及GUS基因组织化学法检测鉴定转基因烟草,其中有5 株为阳性植株。初步证实了GhHSP70 基因已导入烟草基因组中。为进一步研究该基因的功能提供实验基础,同时为后续转化棉花改善其抗旱能力奠定基础。     

准噶尔无叶豆EsDREB2B基因在烟草中的抗逆功能分析

DREB(dehydration responsive element binding protein)转录因子在植物响应非生物胁迫上具有重要作用,是颇具潜力的植物抗逆育种候选基因。本研究旨在通过烟草体系,验证前期从准噶尔无叶豆中克隆的Es DREB2B基因在种子萌发和成苗成长阶段的抗逆功能,并初步探究其调控的下游靶基因。结果表明:转基因株系在干旱、高盐、冷和热胁迫处理下的萌发率都高于野生型烟草,其中盐和热胁迫下萌发率差异尤为显著;两月大转基因烟草与野生型植株进行干旱、高盐、冷和热胁迫处理后,转基因较野生型植株叶片萎蔫,黄化和伤害程度较轻,在热胁迫下差异最为显著;恢复培养后,大多野生型烟草表现为枯死状态,转基因植株则叶片萎蔫减轻并开始生长,并且转基因烟草存活率显著高于野生型,均达到了野生型的3~4倍。ERD10B和Hsp70基因在四种胁迫后的转基因烟草中的表达量均较野生型高,Hsp90在热胁迫下较野生型表达量升高,而Mn SOD,P5CS等基因的表达量变化不显著。以上结果表明,Es DREB2B基因能提高烟草抗干旱、高盐、冷和热胁迫的能力,是具有潜力的抗逆分子育种候选基因。     

超量表达CsADH17基因提高烟草抗旱性及香气成分分析

乙醇脱氢酶是植物香气物质合成的脂肪酸代谢等途径中的关键酶之一,对茶叶芳香物质的形成有着重要作用,因此探究CsADH17基因有利于茶树的生长发育与品质提升。以本课题组前期筛选的CsADH17基因为研究对象,克隆CsADH17基因并构建植物表达载体,遗传转化烟草,对转基因烟草非生物胁迫下CsADH17的表达量和相关生理指标进行测定与分析。结果表明,对转基因与野生型烟草进行模拟干旱胁迫后,转基因烟草植株在干旱胁迫处理下的CsADH17基因相对表达量比野生型植株高。野生型烟草植株和CsADH17转基因烟草植株在干旱胁迫处理21 d后,超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)和抗坏血酸过氧化物酶(APX)的活性均高于野生型烟草;胁迫处理后,野生型烟草叶片中丙二醛(MDA)含量显著高于转基因烟草。香气成分分析,转基因烟草苯甲醛比野生型含量提高了44.4%,而烟碱含量比野生型提高不到5%。CsADH17基因在烟草干旱胁迫下具有抗旱作用,同时影响烟草的香气成分,为进一步揭示CsADH在茶树生长发育以及抗逆响应中提供参考。     

转大豆GmPRP和SbPRP基因烟草对非生物胁迫耐受能力分析

为实现PRPs基因在植物抗逆基因工程中的应用,将大豆中的2个脯氨酸富集蛋白基因GmPRP和SbPRP构建到植物表达载体pRI101上,通过叶盘法转化烟草。共获得GmPRP阳性转基因烟草2株,SbPRP阳性转基因烟草4株。对转基因烟草植株进行高盐、干旱和低温胁迫处理。结果表明,高盐处理后,SbPRP转基因烟草的脯氨酸含量和可溶性糖含量分别显著和极显著高于野生型,丙二醛含量极显著低于野生型。干旱处理对GmPRP和SbPRP转基因烟草脯氨酸含量、可溶性糖含量和丙二醛含量的影响均不明显。低温处理后,GmPRP和SbPRP转基因烟草的脯氨酸含量均极显著高于野生型,丙二醛含量均低于野生型。由此推测SbPRP可以提高转基因烟草的耐盐性和耐寒性,GmPRP可以提高转基因烟草的耐寒性,为后续SbPRP和GmPRP的应用奠定基础。     

葡萄逆境胁迫诱导启动子的克隆及表达分析

为了研究葡萄抗逆基因(CAN70200.1)的表达特性,采用PCR技术从葡萄中克隆了CAN70200.1基因上游一段长度为1 354 bp的启动子片段,命名为PCAN。采用Plant CARE和PLACE启动子在线预测工具分析表明,PCAN启动子序列具有CAAT-box、TATA-box基本的顺式作用元件和一些参与非生物胁迫、光和植物激素应答相关的顺式作用元件。为验证启动子的表达特性,将PCAN启动子连接到p CAMBIA1391Z载体GUS基因的上游,构建成植物表达载体p1391Z-CAN,并通过农杆菌介导法转化烟草,经PCR鉴定,获得转基因植株。对转基因烟草植株进行逆境胁迫处理发现,在干旱处理120 min后,PCAN启动子活性达到最强;而4℃低温处理30~60 min时,PCAN启动子活性达到最强,表明PCAN启动子具有低温和干旱胁迫诱导表达特性。     

烟草转录因子NtNAC080在非生物胁迫下的表达分析及功能鉴定

NAC作为植物特有的转录因子,广泛参与植物生长发育、衰老及胁迫响应等生物学过程。为探究烟草NtNAC080在非生物胁迫响应中的功能,利用qRT-PCR技术分析了不同胁迫处理下NtNAC080的表达模式,结果表明,NtNAC080的表达受干旱、高盐胁迫以及ABA、MeJA和SA激素的诱导;以NtNAC080基因的敲除突变体及野生型(K326)烟株为材料,分析敲除株系在高盐和干旱胁迫下抗逆表型。试验表明,与野生型相比,2个敲除株系的耐盐抗旱能力均明显增强;干旱和盐胁迫下敲除株系的抗氧化酶(SOD、POD、CAT)活性以及可溶性蛋白、脯氨酸含量显著高于野生型,而丙二醛含量显著低于野生型。相反地,异源表达NtNAC080的转基因拟南芥与野生型(Col-0)相比对盐和干旱的耐受性明显减弱。qRT-PCR分析发现在干旱和盐处理后胁迫相关基因(NtDREB1A、NtKAT2、NtNHX1等)在NtNAC080基因敲除株系中表达水平显著高于野生型。以上结果表明,NtNAC080在烟草的非生物胁迫响应中起负调控作用,这可能是通过调控抗氧化酶活性及胁迫相关基因的表达来实现的。     

蚜虫基因RNAi载体的构建及其在转基因烟草中dsRNA的表达分析

RNAi机制可以通过dsRNA诱导同源mRNA的降解,从而导致该基因转录后沉默。RNA干扰作用从发现以来就具有了利用转录后基因沉默（PTGS）来进行抗虫的一种潜在可能性。针对dsRNA的这种作用,研究中提取蚜虫RNA,克隆出蚜虫Cathepsin B基因的干扰片段并构建出RNAi载体,转入本氏烟草中,在转基因烟草体内表达dsRNA。成功构建RNAi载体后,通过农杆菌转化和叶盘法将RNAi载体导入烟草中并采用组织培养方法培养出转基因烟草,通过PCR鉴定显示15株生根的转基因烟草中14株显示阳性。提取转基因烟草的RNA进行RT-PCR和Northern表达分析显示转基因烟草植株中dsRNA表达的存在。实验结果说明了在转基因植物体内表达RNAi载体可以产生dsRNA,从而在蚜虫进食植物时达到利用dsRNA抗蚜虫的作用。     

转PuP5CS基因烟草对低温胁迫的生理响应

以朝鲜碱茅PuP5CS基因(HQ637435)为目的基因,构建了PuP5CS基因的正义表达载体和反义表达载体,通过农杆菌介导的叶盘法转化烟草,研究了PuP5CS基因对烟草耐寒性的影响。结果显示,低温胁迫下,正义转基因烟草体内可溶性糖、脯氨酸、叶绿素a和叶绿素b的含量均显著高于野生型烟草,丙二醛含量增幅显著低于野生型烟草,提高了转基因烟草的抗寒性,而反义转基因烟草体内各项生理指标变化不明显。     

紫花苜蓿转录因子MsNF-YB4的克隆及其耐盐作用的评价

核因子Y的B亚基(NF-YB)可以在植物的生长、发育和抗逆响应中调节多种基因的表达,在植物的各种生理活动中发挥重要作用。紫花苜蓿是重要的牧草,具有较强的抗逆能力。本研究从紫花苜蓿中克隆了一个NF-YB基因,即MsNF-YB4(Gen Bank登录号为KX966286)。该基因的开放阅读框长度为405 bp,编码134个氨基酸残基。经过比对发现,该基因与蒺藜苜蓿的NF-YB4(Mt NF-YB4)在m RNA的编码区内同源性为92%,而在蛋白水平上的同源性为94%。通过比对分析,发现MsNF-YB4含有典型的NF-YB转录因子保守结构域。我们通过qPCR的方法对MsNF-YB4基因的表达模式进行了分析,结果发现,在盐碱和干旱胁迫下,根瘤和根中的表达量显著上调,暗示该基因在盐碱和干旱胁迫的响应中发挥作用。我们构建了植物表达载体pCBC-MsNF-YB4,并通过农杆菌介导法获得了过量表达MsNF-YB4基因的转基因烟草。对T1代转基因烟草的耐盐性测试结果表明,MsNF-YB4基因的表达提高了转基因烟草的耐盐性,转基因烟草幼苗可以在含有1.4%Na Cl的培养基上生长。这些结果表明,MsNF-YB4在紫花苜蓿的盐胁迫响应中发挥重要作用。     

拟南芥DREB2A基因的克隆及植物荧光表达载体的构建

以拟南芥幼苗总RNA为模板,采用RT-PCR技术扩增到DREB2A基因,并将其克隆到植物表达载体pCAM-BIA1304中CaMV 35 S启动子与poly(A)终止子之间。酶切鉴定及测序列结果都表明,成功构建了植物表达载体pCAMBIA1304-DREB2A。另外,获得了携带DREB2A基因的根瘤农杆菌菌株,为以后转基因植物工作奠定了基础。     

菜豆几丁质酶基因Bchi的克隆及其在转基因烟草中的表达

本文根据GenBank中公布的菜豆几丁质酶基因cDNA序列设计引物,通过RT-PCR得到一个菜豆几丁质酶基因家族基因Bchi.该基因编码一个327个氨基酸的多肽,其结构包括信号肽、几丁质结合区、铰链区、催化区和液泡定位多肽,属于Class Ia类内切几丁质酶.构建该基因的植物表达载体pMHL7133-Bchi,并通过发根农杆菌R1000介导转化烟草,经PCR和Southern blot鉴定获得了4株转基因烟草株系.几丁质酶活性分析表明,转基因烟草几丁质酶活力明显高于对照.抗真菌实验结果显示,转基因烟草的叶片基本无病斑产生,表明Bchi基因在烟草中高水平的表达显著提高了烟草对真菌病害的抗性.     

植物DREB转录因子及其转基因研究进展

DREB(dehydration responsive element binding protein)类转录因子是AP2/EREBP(APETALA2/an ethylene-responsive element binding protein)转录因子家族的一个亚家族,拥有保守的AP2结构域,能够特异性地与抗逆基因启动子区域的DRE顺式作用元件相结合,在低温、干旱和盐碱等条件下调节一系列下游逆境应答基因的表达,是逆境适应中的关键性调节因子.拟南芥中与逆境相关的DREB转录因子可分为DREB1/CBF和DREB2两类,其中DREB1/CBF类成员主要参与低温胁迫应答反应,DREB2类成员则主要参与干旱胁迫应答反应.根据近十年来的报道,目前已从拟南芥、水稻、玉米、小麦、黑麦、大豆、西红柿和油菜等几十种植物中分离并鉴定出调控干旱、高盐及低温耐性的DREB基因,并利用这些基因得到了抗逆性增强的拟南芥、油菜、西红柿、小麦以及杨树等转基因植株.转基因结果表明DREB转录因子家族在双子叶植物,单子叶植物,草本植物及木本植物抗逆品种改良中均具有重要的应用价值.本文总结了十多年来特别是近五年来国内外相关研究进展,并对DREB转录因子的研究前景及其在木本植物良种选育中的研究趋势进行了展望.     

薤白EPSP合成酶基因转化烟草提高其草甘膦抗性

葱属植物薤白具有较强的草甘膦抗性.将薤白中与草甘膦抗性相关的EPSP合成酶基因(EPSPsA)cDNA重组到植物表达载体pWM101中,构建薤白植物表达EPSPsA重组载体,采用根癌农杆菌介导法将其转入烟草品种WS38,获得转薤白EPSPsA基因烟草.PCR分析表明,目的基因已经整合进烟草基因组中.对转基因烟草愈伤组织及幼苗进行的草甘膦抗性检测表明,转基因烟草对草甘膦的耐受性明显提高.     

水稻BZIP类转录因子在逆境胁迫下的作用

BZIP类转录因子在植物的逆境胁迫下起着重要作用。本研究构建水稻转录因子OsBZIP88过量表达载体pHB-Osbzip88和干涉载体RNAi-Osbzip88,通过遗传转化获得转基因植株,并对转基因植株在逆境胁迫下的表型鉴定。结果表明,过表达转基因植株抗胁迫能力高于野生型和干涉转基因植株。对OsBZIP88定量表达实验表明:OsBZIP88在水稻各组织中均有不同程度表达,且在叶片中表达量最高。本研究初步探明水稻转录因子OsBZIP88在水稻逆境胁迫应答中具有重要的作用,过量表达转录因子OsBZIP88能够增强水稻的抗逆能力。研究结果为进一步了解BZIP类家族基因和挖掘水稻抗逆基因提供了一定的依据。     

昆虫抗冻蛋白基因转化烟草的抗寒性

将准噶尔小胸鳖甲抗冻蛋白基因MPAFP149亚克隆至pCAMBIA1302中,构建成单价植物表达载体pCAMBIA1302-MPAFP149,转化至农杆菌EHA105中,利用叶圆盘法转化烟草。通过PCR、PCR-Southern及RT-PCR检测表明抗冻蛋白基因已整合至烟草基因组中,并发生了转录。对T0代转基因烟草以－1℃处理48 h,转基因烟草的相对电导率和表型明显优于野生型烟草。室温恢复试验验证转基因烟草可存活并恢复生长,而野生型烟草受到了不可逆的低温冻害。研究证明转化后携带昆虫抗冻蛋白基因的烟草比野生型烟草具有明显的抗寒能力,该结果为减轻冷敏感经济作物在春季遭受霜害提供了理论依据和应用基础。     

菊花DmDREBa/b基因提高转基因烟草耐逆性研究

本研究组前期从菊花(Dendranthema morifolium)中克隆得到两个DREB同源基因-Dm DREBa/b,发现两者都受到低温诱导。为了进一步探究该基因的功能,本研究通过农杆菌介导的叶盘转化法将Dm DREBa/b分别导入烟草,并对这两个基因进行了耐逆性分析。结果表明,在4℃低温处理下,过表达Dm DREBa和Dm DREBb基因的烟草的鲜重和存活率都显著高于对照,并且转基因烟草的MDA含量低于对照,而POD活性高于对照;在高盐胁迫下,过表达Dm DREBb基因烟草株系的鲜重、POD活性以及脯氨酸含量都显著高于对照和过表达Dm DREBa基因烟草株系,并且过表达Dm DREBb烟草的存活率达到53%,显著高于对照的存活率20%;而对转基因烟草进行干旱胁迫后,过表达Dm DREBa烟草株系鲜重、POD活性和脯氨酸含量则均显著高于对照和过表达Dm DREBb烟草,且有60%的过表达Dm DREBa烟草恢复生长,显著高于对照(13%)和过表达Dm DREBb烟草(27%)。因此,本研究进一步证明菊花Dm DREBa和Dm DREBb基因均参与低温胁迫调控网络途径,能够提高转基因烟草耐低温能力,其中,Dm DREBa表现为更加积极调控转基因烟草的干旱胁迫,而Dm DREBb则更可能参与响应转基因烟草的高盐胁迫。     

盐角草甜菜碱合成相关基因的共表达提高转基因烟草的耐盐性

植物在逆境下能合成甜菜碱,其中磷酸乙醇胺N-甲基转移酶（PEAMT）和胆碱单加氧酶（CMO）是甜菜碱合成过程中的关键酶。本文将盐角草SePEAMT基因、SeCMO基因以及烟草的核基质结合区序列（Mar）利用Cre/loxP重组系统构建到同一表达载体上,得到植物表达载体pYLTAC747N-Mar-SePEAMT-SeCMO-Mar。该载体用电击转化法转入农杆菌EHA105中,通过农杆菌介导法转化烟草,经PCR检测确定转基因植株。在含250mM NaCl的MS培养基上35d后,转基因植株生根而野生型植株不能生根;转基因烟草植株甜菜碱积累量显著高于野生型植株,约是野生型植株的5.6~7.7倍;转基因植株与野生型相比,相对电导率显著降低,叶绿素含量明显升高。以上结果表明共表达SePEAMT 和SeCMO能有效提高烟草甜菜碱表达量从而提高烟草的耐盐性。     

水稻OPR基因的克隆及其在烟草中抗镉性分析

12-氧-植物二烯酸还原酶是茉莉酸生物合成途径的一个关键性酶,广泛参与植物生长过程中生物与非生物胁迫。本研究主要探讨OPR基因在植物非生物胁迫中的作用。从水稻中克隆了OPR基因,该基因的cDNA编码区全长1 203 bp,编码400个氨基酸,将其连接到植物表达载体pSH 737上,通过农杆菌介导的方法,将含有目的基因的载体遗传转化烟草,获得31株转基因植株。选取生长状况基本一致的8株不同转基因株系和4株野生型烟草,在非生物胁迫下,用300μmol·L~(-1) CdCl_2溶液浇灌处理,观察植株生长并对抗镉能力进行初步分析;选取T 1代3个转基因株系(TP 7、TP 8和TP 12)和野生型烟草的种子,放入含有3个不同浓度CdCl_2溶液的滤纸上萌发进行镉胁迫并统计发芽率。在300μmol·L~(-1) CdCl_2溶液胁迫15 d后,种子发芽率比野生型高40%以上,转基因烟草的抗氧化酶活性显著高于野生型,丙二醛的含量显著低于野生型植株。利用RT-PCR方法分析相关基因表达情况,结果表明,在Cd~(2+)胁迫下,OPR,Snakin-2和GRP-2基因表达均上调,因此推测OPR基因的高表达是其具有高抗性的主要原因。OPR基因的过量表达使烟草提高了对重金属Cd~(2+)的抗逆性能力。     

陆地棉GhSAD2基因表达载体的构建、转化及抗寒性初步分析

为研究Δ9-硬脂酰-ACP脱氢酶基因的功能及其与植物抗寒性的相关性,以陆地棉GhSAD2基因(KX197920)为目的基因,构建植物表达载体pBI121-GhSAD2,将该表达载体通过电击法导入根癌农杆菌GV3101中,采用根癌农杆菌介导的叶盘法转化烟草。通过PCR和GUS活性染色鉴定外源GhSAD2基因是否导入并整合到烟草基因组上转录表达。将转pBI121-GhSAD2型和野生型烟草置于4℃下处理48 h后,检测其电解质渗漏率并观察其表型。研究结果证明目的基因GhSAD2已整合到烟草及棉花的基因组中,共获得转基因植株9株,转化率为75%。陆地棉GhSAD2基因能够显著增强非低温驯化植物烟草的抗寒性,从而提高植物细胞的低温防御能力,为进一步探究该基因的功能鉴定了基础。     

费尔干猪毛菜病程相关蛋白SfPR1a基因的异源表达增强了烟草对干旱、盐及叶斑病的抗性

为明确一年生草本盐生植物费尔干猪毛菜(Salsola ferganica Drob.)病程相关蛋白基因SfPR1a (GenBank登录号为JQ670917)是否参与了植物对逆境胁迫的响应,采用qRT-PCR检测了该基因在不同组织部位和脱落酸(ABA)、茉莉酸(JAs)、乙烯合成直接前体(ACC)等相关激素胁迫及NaCl处理下的表达规律,同时对转基因烟草在盐、旱及丁香假单胞菌等胁迫下的抗性进行了鉴定。结果显示, SfPR1a基因在费尔干猪毛菜根中的表达量显著高于茎叶中,且受到ABA、JAs、ACC、NaCl的积极诱导;干旱胁迫下,转基因烟草的丙二醛(MDA)含量显著低于野生型烟草,显示出较强的抗旱表型;盐胁迫下,异源表达SfPR1a的转基因烟草幼苗生长显著优于野生型烟草;丁香假单胞菌攻毒后的转基因烟草叶片呈现严重的坏死反应,但植株的整体抗性表型显著优于野生型烟草;亚细胞定位结果显示该蛋白定位于植物细胞质外体空间。以上结果表明,费尔干猪毛菜病程相关蛋白SfPR1a基因参与了植物对非生物及生物胁迫的抗性。