DNA条形码序列对9种蒿属药用植物的鉴定

目的 采用DNA条形码序列对9种常见的蒿属药用植物进行鉴定,为常见蒿属药用植物的鉴定提供分子依据。方法 对9种常见蒿属药用植物的4条候选DNA条形码序列（ITS2、rbcL、matK、psbA-trnH）进行PCR扩增和测序,比较各序列的扩增和测序效率,应用BLAST1、Distance方法来评估各序列的鉴定效率。此外,基于MEGA5分析9种常见蒿属药用植物ITS2序列种间K2P遗传距离并构建NJ树。结果 除matK外,其余3条片段的PCR扩增和测序效率均为100%,ITS2序列对9种蒿属药用植物的物种水平鉴定成功率最高,为100%,而psbA-trnH、rbcL、matK、matK＋rbcL的鉴定成功率（BLAST1法）分别为83.3%、66.7%、54.5%、75%。通过ITS2序列的种间K2P遗传距离及NJ树均能将不同物种全部区分。结论 ITS2序列可以作为鉴定蒿属药用植物的潜在条形码。     

紫苏及其变种的分子鉴定和亲缘关系研究

目的 构建紫苏属种、变种之间系统发育关系,准确鉴别紫苏Perilla frutescens var. arguta、白苏P. frutescens与其他变种。方法 提取紫苏、白苏及其他变种的DNA,对ITS和psbA-trnH序列扩增和测序,计算物种种内（变种内）种间（变种间）Kimura 2-parameter（K2P）遗传距离。采用最简约法（MP）和邻接法（NJ）构建分子系统树,进行系统发育和鉴定分析。结果 ITS和psbA-trnH MP系统树显示白苏和紫苏的不同地域的样本聚为一单系分支（支持率为100%和93%）,紫苏与回回苏构成姐妹群分支（支持率为95%和90%）,野生紫苏和耳齿紫苏构成一单系分支（支持率为100%和90%）;白苏、紫苏与其他变种间的ITS和psbA-trnH序列遗传距离0.008 21～0.018 18和0.002 38～0.029 31,明显大于白苏与紫苏间遗传距离0～0.001 65和0,大于各变种内遗传距离。结论 白苏和紫苏合并为一个种紫苏;紫苏与回回苏亲缘关系最近,野生紫苏与耳齿紫苏亲缘关系最近;ITS和psbA-trnH序列可以准确鉴别紫苏与其他变种。     

半夏及近缘种叶绿体非编码区序列分析

目的 通过测定半夏及近缘种的DNA叶绿体的非编码区序列,为半夏的分子鉴别和遗传多样性研究提供依据。方法 在我国半夏主要分布区收集到43份半夏及滴水珠和虎掌半夏2个近缘种,采用PCR法克隆叶片基因组DNA中psbK-psbI和atpF-atpH两段序列,借助生物信息学软件进行比对分析。结果 半夏atpF-atpH序列长为337～342 bp,较为保守,仅含变异位点7个,其中信息位点1个,遗传距离为0～0.024。半夏psbK-psbI序列长为432～435 bp,变异位点37个,其中信息位点17个,遗传距离为0～0.069。聚类分析结果均显示出与表型以及地理居群的不一致。结论 psbK-psbI序列较atpF-atpH有更好的鉴别能力,在半夏种内具有较丰富的变异位点。     

棕背鼠平性别的快速鉴定

目的 野生棕背鼠平因其活动敏捷?性情凶猛?不易抓取,很难从外表对其性别做出准确判断,影响分笼及后期的实验室繁育,拟建立一种快速?准确?简便的性别鉴定方法?方法 以棕背鼠平的新鲜被毛为材料,Chelex?100 提取毛囊DNA,利用PCR 技术分别扩增锌指结构基因(ZFY/ZFY)片段和Y 染色体性别决定区基因(SRY)片段,并建立双重PCR 扩增方法?结果 雄性棕背鼠平扩增出ZFY/ZFY和SRY 两个基因片段,而雌性棕背鼠平只扩增出ZFY/ZFY基因片段?利用这种方法对23 只棕背鼠平?10 只Wistar 大鼠和8 只BALB/ c 小鼠进行性别鉴定,扩增结果与表型判断和解剖结果一致?结论 以被毛为实验材料,减少了对棕背鼠平的惊吓和损伤;建立的双重PCR 扩增方法准确?快速,可应用于鼠的性别鉴定?     

翻白草的化学成分研究

目的 研究翻白草Potentilla discolor的化学成分。方法 采用70%乙醇提取,利用硅胶、反相（ODS）、凝胶等柱色谱及制备液相色谱进行分离,并根据理化性质和光谱数据鉴定化合物结构。结果 从翻白草中分离得到10个化合物,分别鉴定为β-谷甾醇（1）、山柰酚-3-O-β-D-葡萄糖苷（2）、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷（3）、8-甲氧基草质素-3-O-β-D-槐糖苷（4）、芦丁（5）、山柰酚-3-O-β-D-葡萄糖醛酸苷（6）、异鼠李素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸苷（7）、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸苷（8）、槲皮素-7-O-β-D-葡萄糖苷（9）、短叶苏木酚酸（10）。结论 化合物4、7为首次从该属植物中得到,化合物4、7、9、10为首次从该种植物中得到。     

基于CRISPR/Cas9系统定点编辑小鼠MAD2L1基因及其脱靶效应分析

目的 建立利用CRISPR/Cas9系统对小鼠MAD2L1基因第二外显子基因编辑的方法体系，并分析CRISPR/Cas9对MAD2L1基因编辑的脱靶效应。方法 通过CHOPCHOP网站设计位于小鼠MAD2L1基因第二外显子的靶点序列，并构建Cas9-MAD2L1载体，将该载体转染到NIH/3T3细胞中，通过嘌呤霉素筛选并结合荧光显微镜观察GFP后，提取细胞转染后的基因组DNA，利用PCR方法，结合T7E1分析和桑格尔测序，鉴定对小鼠MAD2L1基因编辑情况，并对转染后的NIH/3T3细胞进行CRISPR/Cas9脱靶效应分析。结果 将Cas9-MAD2L1载体转染到NIH/3T3细胞并进行嘌呤霉素筛选后，荧光显微镜下观察到大量表达GFP的细胞，PCR结合T7E1结果显示，以转染后的细胞DNA为模板扩增出的228 bp MAD2L1 PCR产物，可被酶切成166 bp和62 bp片段，测序结果显示，成功对MAD2L1基因第二外显子靶点处进行基因编辑，脱靶效应分析未检测到CRISPR/Cas9有对脱靶位点进行基因编辑。结论 成功建立对小鼠MAD2L1基因第二外显子进行基因编辑的方法体系，设计的对MAD2L1基因编辑靶点未检测到脱靶效应的发生。     

ITS2序列作为DNA条形码鉴定紫堇属植物的有效性研究

[目的]利用DNA条形码技术对6种紫堇属植物进行分子鉴定,评价内转录间隔区2(internal transcribed spacer 2,ITS2)序列对紫堇属植物的鉴别能力。[方法]从江苏南京、安徽合肥、浙江磐安、浙江缙云等地采集紫堇(Corydalis edulis)、黄堇(C.pallida)、小花黄堇(C.racemosa)、延胡索(C.yanhusuo)、东北延胡索(C.ambigua)和刻叶紫堇(C.incisa)6种紫堇属植物共29份样品。提取其DNA后用ITS2序列的通用引物进行PCR扩增并测序,运用Codon Code Aligner软件拼接和校对序列,MEGA5.1软件分析序列并构建K2P模型的邻接树。[结果]ITS2序列对所研究的29个样品的扩增和测序成功率均为100%。ITS2序列长度在225bp~248bp间,保守位点190个,变异位点71个,变异比例为27.2%。首次扩增获得小花黄堇和紫堇的ITS2序列并上传至Gen Bank。6个物种的种内遗传距离为0~0.0206,种间遗传距离为0.0403~0.1678,小花黄堇和黄堇的遗传距离最小;黄堇与刻叶紫堇的遗传距离最大。不同物种在邻接树中各自进化为单系。6种紫堇属植物的ITS2二级结构均有不同程度的差异。[结论]ITS2序列能够准确鉴定紫堇、黄堇、小花黄堇、延胡索、东北延胡索和刻叶紫堇这6种紫堇属植物,对中药鉴定具有潜在的应用价值。     

斑马鱼sat1.a突变体的鉴定

目的 在我们的前期研究工作中，通过Tol2转座子介导的插入突变，筛选到了一批组织特异性表达绿色荧光蛋白GFP的斑马鱼品系。其中一个品系Tol2：20141221t的GFP在神经系统中表达，但还没有鉴定到Tol2转座子插入到基因组什么位置，造成了哪个基因的突变。本文的主要研究目标就是对这一由Tol2转座子插入诱导的斑马鱼突变品系进行鉴定。方法 使用交错式热不对称PCR（thermal asymmetric interlaced PCR，TAIL-PCR）鉴定Tol2转座子插入的基因组位置；利用原位杂交检测被突变的基因的时空表达是否与该品系GFP表达具有一致性；筛选鉴定纯合体突变体，并进一步分析该基因突变造成的发育缺陷。结果 在该品系中，Tol2转座子插入到了亚精胺/精胺N1-乙酰基转移酶1a（spermidine/spermine N1-acetyltransferase 1a，sat1.a）的第八个内含子区域，致使sat1.a基因转录提前终止。我们筛选到了sat1.a纯合突变体，但是没有检测到明显的发育缺陷。结论 筛选鉴定的Tol2转座子介导的斑马鱼sat1.a突变体没有明显的发育缺陷，但可以作为研究神经系统发育的有力工具。     

基于ITS序列对独活17个种的分子鉴定

目的 通过对17个种共26个独活样本的ITS序列分析,为国内中药市场上的常见独活的分子鉴定提供依据,并探索其科学分类标准。方法 对26个样本的ITS进行PCR扩增和测序。通过MEGA 5.0软件比较各序列间的差异性,计算K2P遗传距离;采用邻接法构建NJ系统树并应用Network 4.2.0.1软件进行中间连接网法分析构建单倍型网状图。结果 NJ系统树和单倍型网状图显示,26个样本聚集为5大类群,综合分析后将17种独活归为4大类;重齿毛当归Angelica pubescens的ITS序列具有特征碱基片段,可明显区别于其他样本;除牛尾独活类中3个样本不能通过ITS序列鉴定到种以外,其他样本均可以通过ITS序列鉴定到种。结论 ITS序列可为药用独活的鉴定和分类提供有力证据,四带芹类可以作为独活的首选替补品,牛尾独活类其次,九眼独活为最后之选。     

黄花铁线莲根部的化学成分

从黄花铁线莲Clematis intricata Bunge根部分离得到6个化合物,分别鉴定为:7β-乙氧基-6α-羟基-1,4-二氧杂环辛烷(1),4,6,7-三甲氧基-5-甲基香豆素(2),东莨菪素(3),3,5,7,4′-四羟基黄酮(4),对羟基苯甲酸(5),3,4-二羟基苯甲酸(6)。其中化合物1为新化合物,化合物2、5、6首次从该属植物中分离得到。     

实验动物四种病原体多重PCR方法的建立与应用

目的建立快速检测多杀巴氏杆菌、支气管鲍特杆菌、支原体和肺炎克雷伯杆菌4种实验动物病原体的多重PCR方法。方法根据Gen Bank基因设计出特异性引物;经过多重PCR的优化,特异性和敏感性的检测,建立多重PCR体系。应用该PCR体系检测人工感染样本和实验动物的气管分泌物,并与传统方法做对比。结果多重PCR扩增出多杀巴氏杆菌(356 bp)、支气管鲍特杆菌(237 bp)、支原体(266 bp)和肺炎克雷伯杆菌(142 bp)的目的条带。肺炎克雷伯杆菌敏感性为10 pg,多杀巴氏杆菌、支气管鲍特杆菌、支原体敏感性为1 pg,特异性检测未从其他病原菌中检测出目的条带。应用建立的多重PCR体系检测人工感染样本的不同组合,45只实验动物气管检测出15只多杀巴氏杆菌阳性,9只肺支原体阳性,但传统培养方法和血清学方法未检测出阳性标本。结论本文建立的多重PCR方法操作简单、快速、特异性强、灵敏度高,能够实现对多杀巴氏杆菌、支气管鲍特杆菌、支原体和肺炎克雷伯杆菌4种实验动物病原体的快速检测。     

宋金元时期《灵枢经》流传情况初探

<灵枢经>古称<九卷>、<黄帝针经>,系<黄帝内经>的一部分.北宋时期到史崧本刊出之前的传本则多为<黄帝针经>或简称<针经>.对<灵枢经>在北宋、南宋及金元时期的流传情况进行了考查,并把金元时期医家著作中引用<灵枢经>及<针经>部分与现行史崧本<灵枢经>进行对照分析,认为<针经>自身可能有不同传本,今本<灵枢经>可能来自<针经>.     

金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌和肺炎克雷伯杆菌多重PCR方法的建立与初步应用

目的建立金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌和肺炎克雷伯杆菌多重PCR检测方法,为实验动物细菌检测提供快速、灵敏、简便的方法。方法根据金黄色葡萄球菌nuc基因、绿脓杆菌Las I基因、肺炎克雷伯杆菌Pho E基因和细菌通用16S rRNA基因设计出特异性引物;经过多重PCR引物浓度和退火温度的优化,特异性和敏感性的检测,建立多重PCR体系。应用该PCR体系对人工感染标本、实验动物粪便样本进行验证检测,与传统检测方法对比。结果多重PCR分别扩增出金黄色葡萄球菌(153 bp)、绿脓杆菌(600 bp)、肺炎克雷伯杆菌(368 bp)和通用(520 bp)的目的条带。多重敏感性为10 pg,特异性检测未从其他细菌中检测出目的条带。应用建立的多重PCR体系检测出不同组合的人工感染标本,从76只粪便检测出绿脓杆菌阳性1例,与传统检测方法结果一致。结论本文建立的多重PCR方法具有特异、灵敏、简便、快速等优点,为实验动物微生物的快速检测提供了可靠的方法。     

香砂平胃丸质量控制研究

目的 完善香砂平胃丸质量控制方法。方法 采用TLC法对其处方中木香、苍术、陈皮、甘草进行定性分析,其中木香、苍术用同一种方法提取、显色且点于同一板上使实验更简易、经济;采用HPLC法测定香砂平胃丸中厚朴酚、和厚朴酚的量,并进行方法学研究。结果 TLC鉴别方法能特征地鉴别木香、苍术、陈皮、甘草,斑点均清晰,阴性无干扰;厚朴酚在186.3～1 552.5 ng（r＝0.999 9）线性关系良好,平均加样回收率103.9%,RSD为0.35%;和厚朴酚在121.39～1 011.55 ng（r＝0.999 9）线性关系良好,平均加样回收率104.5%,RSD为0.28%。结论 TLC鉴别方法简单易行;HPLC测定方法专属性强、重现性良好,能够准确测定香砂平胃丸中厚朴酚、和厚朴酚的量。     

海藻、芫花反甘草的研究进展

中药配伍中相反指两种药物合用产生或增强毒性或使疗效降低,而“十八反”是重要的配伍禁忌,也是现代药性理论争议最多的问题,且至今尚未形成较统一的判断标准和结论。主要介绍了“十八反”中有关海藻、芫花反甘草的毒性和机制研究,探讨了影响“十八反”的因素,并在此基础上提出根据不同药物的特点确定其特定部位的安全药理实验内容的观点。     

《黄帝内经》中“开鬼门、洁净府”理论的现代临床应用

“开鬼门、洁净府”理论最早记载于《素问·汤液醪醴论》,通过查阅文献并整理,明确其具体含义指宣肺发汗、通腑排浊与清利小便之法。文章拟对现代医家运用“开鬼门、洁净府”理论指导临床治疗心、肺、肾系疾病、肢节类疾病、皮肤类疾病的应用进行梳理,体现经典理论对于现代临床疾病的指导意义与价值。“开鬼门、洁净府”是中医治疗疾病的经典理论法则,合理应用将取得良好疗效,对中医经典理论传承具有重要意义,值得中医学者进一步研究及探讨。     

药物肠道代谢研究方法进展

肠道是口服药物的必经通道, 肠道中不仅存在着影响药物吸收的转运体, 还含有许多与药物代谢相关的酶, 包括消化道上皮细胞存在的结合酶和消化道菌丛产生的酶, 这些酶不同程度的影响着药物在体内的存在形式、吸收过程等。因此, 胃肠道对药物的有关代谢作用日益受到重视, 其研究方法也不断改进。现就目前药物在肠道中代谢的研究方法及其特点进行综述。     

实验树鼩空肠弯曲菌、沙门氏菌和志贺菌多重荧光定量PCR方法的建立

目的为实验树鼩微生物检测提供一种快速、简便、灵敏,并且特异性强的空肠弯曲菌、沙门氏菌和志贺菌多重荧光定量PCR检测方法。方法根据空肠弯曲菌的Hip O区域、沙门菌的in V区域和志贺菌的ipa H区域设计特异性引物和探针,并进行单病原定量PCR检测验证;后分析多重PCR的灵敏度和特异性,并使用该多重PCR方法检测实验树鼩样品。结果本研究的PCR要素可用于空肠弯曲菌、沙门氏菌及志贺菌等单种菌的实时荧光定量PCR扩增。多重定量PCR扩增出了空肠弯曲菌、沙门氏菌和志贺氏菌标准扩增曲线;该方法的灵敏度为1×103ng/μL;特异性检测未从其他参考菌株中检出阳性。结论该多重定量PCR方法在实验树鼩微生物检测中具有很好的应用和推广前景。     

制川乌与川贝母、浙贝母配伍前后化学成分的变化研究

目的 研究制川乌与川贝母、浙贝母配伍前后其化学成分的整体变化情况,从而分析乌头反贝母的相反机制。方法 使用UPLC-ESI-LTQ-MS对配伍前后的煎煮液进行分析,采用主成分分析（PCA）对数据进行分析并采用多级串联质谱技术对化学标志物进行鉴定。结果 制川乌与川贝母、浙贝母配伍前后成分均有明显差异,其中与川贝母配伍产生5个化学标志物,与浙贝母配伍产生6个化学标志物,重复出现的标志物为次乌头碱和苯甲酰基次乌头原碱。结论 制川乌与两种贝母配伍后的化学标志物差异较大,仅有2个相同,结合前期的急性毒性试验结果,推测制川乌与不同贝母配伍后LD₅₀的变化与其配伍后化学成分的变化相关;从而说明相反不完全是通过其化学成分变化引起的,其相反机制可能还通过其他因素共同引起。     

三味辛温归肺经中药对复合因素致肺阳虚大鼠肺功能的影响

目的 观察豆蔻、紫苏叶、白芷3味辛温归肺经中药对复合因素致肺阳虚大鼠肺功能的影响。方法 采用烟熏（外邪犯肺）＋常温及冰水游泳（形寒劳倦）＋服用冰水（内饮生冷）多因素复合造成肺阳虚大鼠模型。造模的同时ig给予豆蔻、紫苏叶、白芷水提取物,连续24 d。末次给药后,大鼠气管插管测量肺功能指标;取血测定血清内皮素（ET）、血栓素B₂（TXB₂）、6-酮-前列腺素F_1α（6-keto-PGF_1α）的量。结果 豆蔻、紫苏叶及白芷水提取物均能在一定程度上减少呼气时间、一次呼吸周期时间、气道阻力,增加呼吸频率、每分通气量（VE）、呼气峰值流速（PEF）、呼气至最大流速时间与呼气时间之比（TPEF/TE）、吸入75%潮气量时吸气速度（IF₇₅）、吸入75%潮气量时吸气速度与峰值流速之比（IF₇₅/PIF）、呼出75%潮气量时呼气速度（EF₇₅）、呼出50%潮气量时呼气速度（EF₅₀）、呼出75%潮气量时呼气速度与峰值流速之比（EF₇₅/PEF）、呼出50%潮气量时呼气速度与峰值流速之比（EF₅₀/PEF）,减少血清TXB₂水平。结论 豆蔻、紫苏叶、白芷水提取物均能不同程度调节肺功能指标,降低血清TXB₂水平。