水母雪莲ISSR-PCR反应体系优化及引物筛选

目的优化并建立适合于水母雪莲的ISSR-PCR反应体系并筛选出稳定的ISSR引物。方法采用L16(45)正交设计方法,以Taq DNA聚合酶浓度、d NTP浓度、模板DNA浓度、引物浓度、Mg~(2+)浓度5种因素4个水平对水母雪莲ISSRPCR反应体系进行优化;并对反应体系进行验证。采用优化后的反应体系筛选出条带清晰且稳定的ISSR引物,通过退火温度梯度试验确定最佳退火温度。结果最终确立了水母雪莲20μl ISSR-PCR最佳反应体系,即包含Taq DNA聚合酶0.7U、d NTP 0.125mmol/L、引物0.3μmol/L、模板DNA 40ng、Mg~(2+)1.5mmol/L。在此基础上,从84条ISSR引物中筛选出条带清晰且稳定的8条引物,并通过梯度PCR反应确定最佳退火温度。结论经过11份水母雪莲种质验证,证明所建立的体系稳定可靠,可用于后续水母雪莲遗传多样性分析和种质资源鉴定。     

毛冬青基因组DNA提取方法及ISSR-PCR反应体系的优化

目的:优化毛冬青基因组DNA提取方法,建立稳定性高、重现性好、适合其遗传差异分析的ISSRPCR反应体系。方法:对比CTAB法、mCTAB法、SDS法、蛋白酶K法及植物基因组提取试剂盒的提取效果后,选择mCTAB法结合蛋白酶K法提取毛冬青基因组DNA,并优化了蛋白酶K用量。利用正交试验设计,对毛冬青ISSR-PCR反应的5个因素(Mg~(2+)、dNTPs、Primer、DNA、Taq酶)进行优化,PCR结果使用SPSS16.0软件进行分析,基于优化后体系对哥伦比亚大学公布的100条ISSR引物进行筛选,确定退火温度。结果:采用蛋白酶K-mCTAB法实现了4 h内提取高纯度毛冬青基因组DNA,蛋白酶K用量为20 ng·mL~(-1)时DNA平均提取量较传统CTAB法提升9.5倍;毛冬青ISSR-PCR最终反应体系为Mg~(2+)2.5 mmol·L~(-1),dNTPs 0.15 mmol·L~(-1),Primer 0.4μmol·L~(-1),DNA 70 ng,Taq酶0.5 U。实验从100条引物中筛选出16条引物并确定退火温度,绘制出毛冬青ISSR指纹图谱。结论:蛋白酶K-mCTAB法适合毛冬青基因组DNA的提取,筛选出的反应体系、引物及退火温度能够满足毛冬青ISSR-PCR实验的要求。     

蒲公英ISSR-PCR反应体系及扩增程序的建立与优化

目的:优化蒲公英ISSR-PCR反应体系及扩增程序;筛选适合的引物,并确定最佳退火温度.方法:采用CTAB法提取蒲公英叶片的DNA,利用正交试验设计,从Taq酶MIX、模板DNA、引物3种因素2个水平,对蒲公英ISSR-PCR反应体系进行考察;采用单因素实验对其扩增程序进行优化.结果:确立了适合于蒲公英的最佳ISSR-PCR反应方法,即在25 μL反应体系中,内含Taq酶MIX 15 μL(1.25 UTaq DNA聚合酶,1.8 mmol·L-1 Mg2+,dNTPs各0.24 mmol·L-1),0.3 μmol·L-1引物,5 ng模板.在此基础上,从50条引物中筛选出16条扩增稳定、多态性丰富的ISSR引物,并通过梯度PCR试验,确定引物最佳退火温度.结论:采用单因子试验和正交设计方法可以快速建立ISSR-PCR反应体系,经过验证,证明该体系稳定可靠,可用于蒲公英遗传分析.     

云南沉香ISSR-PCR反应体系的建立与优化

目的建立并优化出清晰稳定的云南沉香ISSR-PCR反应体系和扩增程序,并筛选出适合的引物。方法利用正交设计试验,对云南沉香ISSR-PCR反应体系中的5个主要因素进行优化,并设置温度梯度检测最佳退火温度。结果首次建立了云南沉香ISSR-PCR的最佳反应体系,即在20μl反应体系中,各个因素的浓度分别为:模板DNA 10 ng/20μl、Mg2+3mmol/L、Taq DNA聚合酶2.4 U/20μl、d NTP 0.6mmol/L、引物0.2μmol/L;引物UBC811的最佳退火温度为53.0℃。并且,从100条引物中筛选出16条扩增稳定、多态性丰富的ISSR引物。结论优化确立的云南沉香ISSR-PCR反应体系稳定可靠,可为后续云南沉香的遗传多样性分析研究奠定基础。     

麻花秦艽ISSR-PCR反应体系的建立与优化

目的:建立麻花秦艽的简单重复序列区间-聚合酶链反应(ISSR-PCR)最佳反应体系,为该药材的种质鉴定及遗传多样性等研究提供参考。方法:运用单因素试验和正交试验优选麻花秦艽的ISSR-PCR反应体系中DNA模板用量,Mg2+浓度,dNTPs浓度,TaqDNA聚合酶用量和引物浓度等参数,确定麻花秦艽每条引物的最佳退火温度。结果:ISSR-PCR最佳反应体系(20μL)为模板DNA1μL(36mg·L-1),10×PCR缓冲液(含Mg2+)1.75μL(20mmol·L-1),dNTPs0.8μL(10mmol·L-1),Taq酶0.1μL(0.5%)及引物0.6μL(10mmol·L-1);筛选出12条多态性高、扩增稳定的ISSR引物,UBC-809引物的最佳退火温度55.5℃。扩增出的7条带中多态性带为6条,多态性位点比率85.71%。结论:建立的麻花秦艽ISSR-PCR反应体系稳定可靠,位于500bp处的条带为非多态性条带,可作为该种属的特征性条带。     

溪黄草和线纹香茶菜的ISSR反应体系的建立与优化

目的构建溪黄草与线纹香茶菜的简单重复序列区间(inter-simple sequence repeat,ISSR)反应体系,为溪黄草药材种质资源的遗传多样性分析奠定基础。方法通过设定溪黄草ISSR-PCR的各反应因子的不同梯度,对反应条件进行优化,建立适合溪黄草与线纹香茶菜的ISSR反应体系;以溪黄草DNA为模板,用该体系对100条引物进行初筛,用线纹香茶菜进行复筛,并用23个溪黄草、16个线纹香茶菜单株样品验证体系稳定性。结果建立了溪黄草和线纹香茶菜ISSR最佳反应体系(25μL):2×Taq Master Mix 12.5μL(Mg~(2+)浓度4mmol·L~(-1),d NTP浓度0.4 mmol·L~(-1))、引物0.6μmol·L~(-1)、模板DNA 10 ng。结论建立的溪黄草和线纹香茶菜的ISSR反应体系稳定可靠、标记位点清晰、检测多态性能力强,可较好地应用于溪黄草与线纹香茶菜的ISSR遗传多样性分析的研究。     

正交设计优化翼梗五味子ISSR-PCR反应体系

目的对影响翼梗五味子ISSR-PCR扩增反应的各因素进行优化,建立稳定的反应体系。方法基于正交极差分析方法,以Taq酶、Mg2+、模板DNA、dNTP和引物5因素4水平的正交试验对翼梗五味子ISSR-PCR反应体系进行优化。结果翼梗五味子ISSR-PCR的最佳反应体系(20μL)为:Taq酶1.00 U、Mg2+1.50 mmol/L、模板DNA 40.00 ng、dNTP 0.25mmol/L、引物0.50μmol/L。筛选出12条扩增稳定、多态性丰富的ISSR引物,并确定了每个引物的最佳退火温度。结论所建立的翼梗五味子ISSR反应体系具有标记位点清晰、反应系统稳定、重复性好等优点,为翼梗五味子的分子水平研究提供实验依据。     

穿龙薯蓣ISSR-PCR反应体系的优化及引物筛选

目的建立穿龙薯蓣ISSR-PCR扩增的稳定体系。方法利用单因素及正交试验设计的方法对影响穿龙薯蓣ISSR-PCR扩增效果的d NTPs浓度、引物浓度、模板DNA用量Taq DNA聚合酶用量、Mg~(2+)浓度进行优化。结果穿龙薯蓣的ISSR-PCR的20μl最佳反应体系为:2.0μl 10×Taq Buffer,2.0 mmol/L Mg~(2+),0.225mmol/L d NTPs,1.5 UTaq DNA聚合酶,1.0μmol/L引物,2.0 ng/μl DNA模板,dd H2O补齐。应用该反应体系筛选出来适用于穿龙薯蓣ISSR扩增的12条引物,并确定了各引物的最佳退火温度。结论确立了一个适用于穿龙薯蓣ISSR-PCR扩增的体系。     

桔梗ISSR反应体系的建立和优化

目的建立并优化桔梗ISSR-PCR反应体系和扩增程序。方法采用正交试验和单因子试验,对ISSR反应体系主要因子(dNTPs、Taq酶、引物、Mg2+、模板)进行筛选。之后通过单因子试验,进行引物退火温度、循环次数的筛选。结果桔梗ISSR-PCR的最佳反应体系(20μl)为:dNTPs 0.25mmol/L、Taq酶1.0U、引物0.30μmol/L、Mg2+1.50mmol/L、模板DNA10ng。利用此反应体系从54条引物中筛选出12条扩增稳定、多态性丰富的ISSR引物,确定了引物UBC853[序列为(TC)8RC]的最佳退火温度为55℃和循环次数为45次。结论建立的桔梗ISSR-PCR反应体系,经过白、紫花桔梗共20份样品检验,证明该体系具有稳定性和可靠性,可用于桔梗遗传多样性研究。     

阳春砂ISSR-PCR反应体系的建立和优化

目的 建立起适合阳春砂的ISSR-PCR反应体系.方法 综合运用单因素实验和L9(34)正交实验两种方法,对DNA模板、引物、dNTPs、Taq DNA聚合酶等因素进行优化,以及采用温度梯度筛选引物的退火温度.结果 最终获得的阳春砂的最优ISSR-PCR体系为:总体积为20 μl,其中包括10×Ex Taq Buffer(含15 mmol·L-1 Mg2+)2 μl,25 ng DNA模板,0.50 μmol·L-1引物,0.75 mmol·L-1 dNTPs和1.0 U Ex Taq酶.通过温度梯度筛选出引物UBC808的最佳退火温度为52.0 ℃.结论 这一优化体系为阳春砂的ISSR分析奠定了基础.     

金樱子ISSR-PCR反应体系的建立与优化

目的为获得稳定的金樱子ISSR反应体系。方法采用L16(45)正交试验设计,以金樱子DNA为模板,研究PCR反应体系中5种主要成分,即Mg2+、d NTPs、Tag酶、引物及模板对金樱子ISSR-PCR扩增结果的影响。结果金樱子ISSR在20μl的最佳反应体系中,Mg2+浓度为0.5mmol/L,Tag酶为0.9 U/μl,d NTPs为0.3 mmol/L,引物为0.2(100μmol/L),模板DNA用量为2ng/μl。结论实验结果可用于金樱子ISSR的构建。     

青天葵ISSR-PCR体系优化及引物筛选

目的:建立适合青天葵遗传差异分析的简单重复序列区间(ISSR)-聚合酶链式(PCR)反应体系。方法:采用正交试验设计对影响青天葵ISSR-PCR反应体系的5种因素(dNTP、模板DNA、引物、Mg2+和Taq DNA聚合酶)4个水平进行优化,并结合新复极差法,对试验中各单因素进行分析。结果:确立了青天葵最佳反应体系,即在20μL的总反应体积中含有10×PCR buffer 2μL,dNTP 225μmol·L-1,Mg2+2.5 mmol·L-1,引物0.4μmol·L-1,Taq DNA聚合酶1.0 U,模板DNA60 ng;从100条引物中筛选出16条扩增稳定、多态性丰富的ISSR引物。结论:建立的青天葵ISSR-PCR反应体系,经过24份青天葵样品检验,得出该体系稳定可靠,可用于青天葵遗传差异分析。     

三桠苦ISSR反应体系的优化与引物筛选

目的构建三桠苦ISSR反应体系,为三桠苦种质资源遗传多样性分析及分子鉴定奠定基础。方法通过设定影响三桠苦ISSR-PCR反应诸因子的不同梯度,检测不同反应体系的扩增效果,对条件进行优化,并筛选引物及退火温度,建立三桠苦ISSR-PCR最适反应体系,并用23个不同三桠苦样品验证体系稳定性。结果首次建立了三桠苦ISSR最佳反应体系(25μl):Master Mix 12.5μl(Mg2+浓度4 mmol/L,d NTP浓度0.4mmol/L)、引物0.6μmol/L、模板DNA 20ng。利用该体系从60条ISSR引物中筛选出了扩增条带清晰、多态性好的12条引物。结论所建立的三桠苦ISSR反应体系稳定可靠、标记位点清晰、检测多态性能力强,这一体系的建立及引物筛选可应用于三桠苦种质资源评估及遗传多样性分析的研究。     

开口箭ISSR-PCR实验反应体系条件的优化

目的:建立与优化药用植物开口箭ISSR-PCR实验反应体系.方法:以开口箭DNA为材料,分析了Mg2+,dNTP,引物及Taq DNA聚合酶浓度对ISSR-PCR扩增结果的影响.结果:确立了稳定的、可重复的开口箭ISSR最佳反应体系,即在10 μL的PCR反应体系中,含1 × buffer,2 U Taq DNA聚合酶,2 mmol·L-1 MgCl2,0.2 mmol·L-1 dNTP,0.75 μL引物.结论:从80条简单序列重复区间(ISSR)通用引物中筛选出了16条条带清晰稳定的引物,设置了不同的引物退火温度,为进一步进行开口箭的遗传多样性分析的研究奠定了基础.     

利用综合评分法优化柴胡ISSR-PCR反应体系

目的研究柴胡ISSR-PCR的最佳反应体系。方法应用综合评分法,对Taq酶、Mg2+、引物、总DNA和dNTPs 5种ISSR反应成分进行优选。结果优化反应体系为:25μL反应体系中含有1×buffer、Taq酶1.0 U、Mg2+2.5 mmol.L-1、引物0.4μmol.L-1、DNA 75 ng、dNTPs 0.3 mmol.L-1。结论综合评分法优化柴胡ISSR反应体系可行,为下一步试验提供了可靠参数。     

羌活和宽叶羌活简单重复序列区间扩增反应体系的正交优化

目的通过探讨羌活和宽叶羌活ISSR实验中各种因素的影响,以建立羌活和宽叶羌活的简单重复序列区间扩增(ISSR-PCR)最佳反应体系。方法利用正交实验设计L9(34)对羌活和宽叶羌活ISSR-PCR反应体系的4因素(Mg2 ,dNTP,引物,Taq酶)在3个水平上进行优化实验,PCR结果用SPSS13.0统计软件分析,并设置梯度PCR进行引物退火温度筛选。结果在20μl ISSR-PCR反应体系中,各组分的最适浓度为:2.0 mmol/L Mg2 ,250μmol/L dNTPs,0.50μmol/L引物,1UTaq酶,40 ng DNA模板;模板DNA40~90 ng,不同引物有不同的最佳退火温度,范围在48~52℃。结论该优化体系的建立为进一步进行羌活和宽叶羌活种群间遗传多样性研究提供了参考。     

柴胡ISSR—PCR反应体系的建立与优化

目的建立适于柴胡ISSR分析的PCR反应体系；筛选适宜引物，并确定最佳退火温度。方法CTAB法提取叶片DNA，通过单因子实验分别找出合适的ISSR-PCR反应条件，利用梯度PCR确定引物最佳退火温度。结果适于柴胡ISSR分析的PCR反应体系为25μl总体积中含有1×Taq酶缓冲液，2．0mmol／L MgCl2，各0．15mmol／L的dNTPs，0．3μmol／L引物，1．5U Taq酶（上海生工），20ng模板DNA，2％去离子甲酰胺。在100条引物中筛选出30条扩增条带清晰且条带数目较多的引物，最佳退火温度为49．9～63．6℃（因引物不同而异）。结论建立了柴胡ISSR—PCR反应体系，筛选出30条引物并确定了最佳退火温度，为应用ISSR技术鉴定柴胡种质资源、分子标记辅助选择育种及其遗传多样性研究奠定了基础。     

当归ISSR-PCR反应体系的建立优化及引物筛选

目的建立并优化当归的ISSR-PCR反应体系,并进行引物筛选。方法以当归基因组DNA为模板,通过单因素实验研究了ISSR反应体系中主要成分(Taq DNA聚合酶、d NTP、模板、引物)以及热循环参数(退火温度、退火时间、变性时间、延伸时间、循环数)对扩增结果的影响。结果找出了各自的最适条件,建立了适合当归ISSR分析的反应体系和扩增程序,即在20μl反应体系中,内含10×Taq Buffer(含1.5 mmol·L-1Mg Cl2)、1.25U Taq DNA聚合酶、250μmol·L-1d NTP、40 ng模板、0.25μmol·L-1引物。扩增程序为94℃预变性5 min,然后进行35个循环:94℃变性30 s,(根据引物的退火温度)复性30 s,72℃延伸150 s,循环结束后72℃延伸7 min,-4℃保存。结论以此体系为基础进行引物筛选,在100条ISSR引物中筛选出17条扩增条带清晰、多态性较高、重复性好的引物。该研究为当归药材DNA鉴定、种质资源研究以及优良品种选育奠定了基础。     

对叶百部基因组DNA提取及ISSR-PCR体系优化

目的建立适合对叶百部基因组DNA提取方法及ISSR-PCR最佳反应体系。方法通过改良的CTAB法提取对叶百部基因组DNA,并采用正交试验设计方法对影响ISSR-PCR反应体系的5种因素(d NTP、模板DNA、引物、Mg2+和Taq聚合酶)4个水平进行正交试验,优化ISSR-PCR反应体系。结果确立了对叶百部最佳反应体系,即在20μl的总反应体积中含有10×PCR buffer 2μl,d NTP 175μmol/L,Mg2+1.7mmol/L,引物0.6μmol/L,Taq酶1.0U,模板DNA 15ng。结论建立并优化了对叶百部基因组DNA提取方法及ISSR-PCR反应体系。     

拳卷地钱基因组DNA提取及ISSR-PCR扩增体系优化

目的建立一种拳卷地钱基因组DNA的提取方法;对影响拳卷地钱ISSR-PCR反应的各因素进行优化,建立稳定的反应体系。方法采用改进的CTAB法提取拳卷地钱基因组DNA;以Taq酶、Mg2+、dNTP和引物4因素3水平的正交设计对拳卷地钱ISSR-PCR反应体系进行优化。结果采用改进的CTAB法提取的拳卷地钱基因组DNA质量高,且适用于ISSR-PCR扩增;获得拳卷地钱最佳反应体系(20μl)为:Taq酶0.5 U,Mg2+2.0 mmol/L,dNTP 250μmol/L,模板DNA 50ng,引物0.6μmol/L。结论建立并优化了拳卷地钱总DNA提取方法及ISSR-PCR反应体系。