CLDN4对雨蛙素诱导的急性胰腺炎细胞模型凋亡和自噬的影响及其机制研究

目的 本研究目的在于探究CLDN4在急性胰腺炎中的作用及其作用机制。方法 使用雨蛙素分别处理大鼠胰腺腺泡细胞(AR42J)0、2、4、6、8、10 h建立急性胰腺炎细胞模型;本研究将AR42J细胞按随机数字表法分为5组：对照组：正常培养的AR42J细胞;雨蛙素组：经雨蛙素处理的AR42J细胞;si-control组：经雨蛙素处理且转染si-control的AR42J细胞;si-CLDN4组：经雨蛙素处理且转染CLDN4 siRNA的AR42J细胞;NF-κB组：经雨蛙素处理、转染CLDN4 siRNA且使用NF-κB激活剂的AR42J细胞。使用酶联免疫吸附试验检测细胞上清液中肿瘤坏死因子α(TNF-α)和白细胞介素(IL)-6的含量;使用流式细胞仪检测细胞凋亡水平;使用蛋白质印迹法分别检测CLDN4、LC3-I、LC3-II、t-p65、p-p65、p62和Beclin-1的表达水平。结果 在AR42J细胞被雨蛙素分别处理0、2、4、6、8、10 h后CLDN4表达水平分别为1.00±0.07、1.63±0.14、2.34±0.18、2.91±0.25、3.66±0.35和3.18±0...     

miR-21在脂多糖诱导的人鼻黏膜上皮细胞中表达变化及作用机制

目的 探讨微RNA-21（miR-21）在脂多糖诱导的人鼻黏膜上皮细胞（HNEpC）中表达变化及可能的作用机制。方法 应用脂多糖诱导建立HNEpC炎症反应细胞模型,分别应用荧光定量PCR（qRT-PCR）和蛋白免疫印迹法检测炎症细胞模型建立前后miR-21和磷酸酶及张力蛋白同源物 （PTEN）蛋白的表达水平变化。取脂多糖诱导的HNEpC细胞,分为miR-21抑制物组和阴性对照组,应用脂质体转染法分别将miR-21抑制物和阴性对照物转染入2组HNEpC细胞,比较转染后2组细胞中miR-21和PTEN蛋白的表达、细胞增殖活性和凋亡率以及细胞上清液中TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10的水平。结果 脂多糖诱导的HNEpC细胞中miR-21表达水平增高（P < 0.05）,PTEN蛋白的表达水平降低（P < 0.05）。miR-21抑制物组细胞中miR-21表达水平低于阴性对照组（P < 0.05）,转染后24、48、72 h后的吸光度值均低于阴性对照组（P均 < 0.05）,凋亡率高于阴性对照组（P < 0.05）,并且细胞上清液中TNF-α、IL-1β及IL-6水平均低于阴性对照组（P均 < 0.05）,IL-10水平高于阴性对照组（P < 0.05）,细胞中PTEN蛋白的表达水平高于阴性对照组（P < 0.05）。结论 miR-21在脂多糖诱导的HNEpC炎症反应细胞模型中表达升高,抑制miR-21可显著抑制脂多糖诱导的HNEpC细胞的增殖活性和炎症反应,同时促进其凋亡,其机制可能与其对PTEN基因的调控有关。     

靶向IRF-2基因的siRNA对胰腺腺泡细胞凋亡的机制研究

目的探讨靶向干扰素调节因子2(IRF-2)基因的小干扰RNA(siRNA)对胰腺腺泡细胞凋亡的影响及机制。方法以脂质体Lipofectamine TM2000为载体,参照其转染说明将设计并合成的IRF-2的siRNA转染AR42J细胞,并设置阴性对照siRNA(NC)及空白组(仅加入脂质体)。IRF-2的siRNA及阴性对照siRNA转染AR42J细胞24 h后与雨蛙肽(10-8mol/L)同培养,流式细胞仪检测各组细胞凋亡率及活性氧族(ROS)含量;Western blotting检测Bcl-2、Bax和p53的蛋白表达。结果转染IRF-2的siRNA的AR42J细胞IRF-2蛋白表达降低,与空白组比较差异具有统计学意义(P0.05)。雨蛙肽可明显诱导AR42J细胞凋亡,诱导ROS产生,上调Bax和p53蛋白表达,下调Bcl-2的蛋白表达,与NC组比较差异具有统计学意义(P0.05),而转染si-IRF-2后可降低由雨蛙肽诱导的AR42J细胞凋亡和ROS产生,下调Bax和p53蛋白表达,上调Bcl-2的蛋白表达,与NC+雨蛙肽组比较差异具有统计学意义(P0.05)。结论靶向IRF-2基因的siRNA可抑制胰腺腺泡细胞凋亡,机制可能与降低细胞内ROS含量及下调Bax、p53表达和上调Bcl-2表达有关。这种抑制可能与增加急性胰腺炎的炎症程度有关。     

生长抑素及Octreotide对急性胰腺炎胰腺细胞凋亡的作用机制

目的：探讨生长抑素（ＳＳ）及其类似物（Ｏｃｔｒｅｏｔｉｄｅ）治疗小鼠急性胰腺细胞凋亡及凋亡调控基因ｂａｘ，ｐ５３的作用。方法：以雨蛙肽诱导ＣＤ－１小鼠急性胰腺炎模型，并应用细胞凋亡原位标记检测（ＴＵＮＥＬ）染色，免疫组化技术等检测胰腺细胞凋亡及凋亡调控基因ｂａｘ，ｐ５３的蛋白表达，以及生长抑素及其类似物治疗后对胰腺细胞凋亡及凋亡调控基因ｂａｘ和ｐ５３蛋白表达的影响。结果：ＨＥ染色见胰腺组织中典型的     

下调miR-572抑制人胃癌细胞株凋亡、迁移和侵袭机制的实验研究

目的　探讨下调微小核糖核酸（ miRNA, miR）-572对人胃癌细胞凋亡和迁移能力的影响及机制。方法　实时荧光定量 PCR（quantitative real-time PCR, qPCR）法检测 miR-572,第 10号染色体缺失的磷酸酶、张力蛋白同源物基因 (phosphatase and tensin hmmlogydeleted on ten, PTEN)和蛋白激酶 2 (protein kinase 2,AKT2)在不同胃癌细胞株（ HGC-27, AGS和 SGC-7901）和正常胃黏膜上皮细胞 GES-1中的表达情况。在胃癌细胞株 AGS细胞中加入 miR-572 inhibitor后, CCK8检测细胞活力; Tranwell实验检测细胞侵袭和迁移能力;流式细胞术检测细胞凋亡比例; qPCR检测 miR-572, PTEN和 AKT2的表达量。结果　miR-572和 AKT2在胃癌细胞系 HGC-27（6.97±1.62,4.98±1.34）,AGS（7.21±1.32, 5.39±1.14）和 SGC-7901（5.97±1.44,4.02±1.02）中较正常胃黏膜上皮细胞 GES-1表达升高（ 1.00±0.24,1.00±0.21）, PTEN表达降低（ 0.49±0.16,0.39±0.11,0.54±0.33 vs 1.00±0.13）,差异均有统计学意义 (t=2.727~3.197,均 P＜ 0.05);与对照组比较,转染 miR-572 inhibitor后,miR-572和 AKT2在 AGS中表达下调 (P＜ 0.05),PTEN表达上调 (P＜ 0.05); CCK8实验结果显示转染 miR-572 inhibitor后,与对照组比较 miR-572抑制剂组细胞活力降低 (P＜ 0.05);Transwell实验发现,与对照组比较 miR-572抑制剂组细胞的侵袭和迁移能力降低 (P＜ 0.05);流式细胞实验结果表明,与对照组相比 miR-572抑制剂组细胞的凋亡比例降低 (P＜ 0.05)。结论　下调 miR-572可抑制胃癌细胞的凋亡、侵袭和迁移,其机制可能是通过 PTEN/AKT2信号通路。     

miR-21 靶向调控PTEN/PI3K/AKT 通路对骨肉瘤细胞增殖、侵袭和凋亡的影响

目的 检测微小核糖核酸（micro RNA, miR）-21 在人正常骨细胞hFOB1.19 与人骨肉瘤细胞系U2OS,Saos-2和MG-63 中的表达,并探讨miR-21 对骨肉瘤细胞增殖、侵袭和凋亡的影响。方法 实时荧光定量PCR 法 (real-timefluorescent quantitative PCR, qRT-PCR) 检测人正常骨细胞hFOB1.19 与人骨肉瘤细胞系U2OS,Saos-2 和MG-63 中miR-21 的表达。选择MG-63 细胞随机分为3 组,利用脂质体2000 分别转染空白对照（control）、阴性对照miR-21-NC 及抑制剂组（miR-21-inhibitor）,再通过qRT-PCR 法验证转染后MG-63 细胞中miR-21 表达。CCK-8 法检测MG-63 细胞增殖能力变化;流式细胞技术检测抑制miR-21 表达对MG-63 细胞凋亡的影响;Transwell 实验检测对MG-63 细胞侵袭能力的影响以及采用Western blot 检测抑制miR-21 表达对MG-63 细胞中PTEN,PI3K,AKT 及p-AKT 蛋白表达的影响。结果 人骨肉瘤细胞系Saos-2,U2OS 和MG-63 中miR-21 相对表达水平分别为1.29±0.14,1.75±0.21 和2.12±0.25,较人正常骨细胞hFOB 1.19 中miR-21 表达水平（0.75±0.12）显著升高,差异具有统计学意义（F=38.037,P=0.002）。转染抑制剂培养48h 后,与Control 组miR-21 表达水平（2.07±0.28）和miR-21-NC 组miR-21 表达水平（2.02±0.33）相比,miR-21-inhibitor 组 miR-21 表达水平（1.07±0.15）显著下降,差异具有统计学意义（F=33.357,P=0.005）。CCK-8 结果表明,与Control 组和miR-21-NC 组相比,miR-21-inhibitor 组各个时间点A 值均显著下降,差异具有统计学意义（F=71.409 ～ 378.281,均P ＜ 0.001）。流式细胞检测结果表明,miR-21-inhibitor 组凋亡数占比为45.0%,较Control 组（8.65%）和miR-21-NC 组（10.60%）均有增加,差异有统计学意义（F=56.134,P<0.001）。Transwell 实验结果显示,miR-21-inhibitor 组细胞穿膜数（102±9 个）较Control 组细胞穿膜数（189±12 个）及miR-21-NC 组细胞穿膜数（177±16 个）明显减少,差异有统计学意义（F=158.781,F<0.001）。Western blot 结果表明,miR-21-inhibitor 组PTEN 表达上调,PI3K 和p-AKT 表达下调,差异均有统计学意义（F=86.309 ～ 138.615,均P ＜ 0.001）,但对AKT 蛋白表达无明显影响,差异无统计学意义（F=14.527,P=0.152）。结论 miR-21 在人骨肉瘤细胞系中呈高表达,抑制miR-21 表达可以抑制骨肉瘤细胞增殖和侵袭,促进其凋亡,作用机制可能与PTEN/PI3K/AKT 通路有关。     

人退变椎间盘髓核组织中 miR-146a的表达及对 NP细胞增殖、凋亡和炎性细胞因子的影响作用机制

目的　检测人退变椎间盘髓核组织中 miR-146a的表达变化,并探讨其可能的作用机制。方法　实时荧光定量 PCR (qRT-PCR) 检测人退变腰椎间盘髓核组织中 miR-146a表达。用脂多糖（LPS）刺激人髓核（nucleus pulposus,NP）细胞模拟椎间盘变性,qRT-PCR检测 NP细胞中 miR-146a的表达变化。将 miR-146a mimics或 miR-146a inhibitor转染至 NP细胞,然后 LPS刺激 NP细胞,观察 miR-146a对 NP细胞增殖活性、凋亡、 TLR4蛋白表达及 IL-1β,TNF-α和 IL-6等炎性因子水平的影响。结果　miR-146a在椎间盘退变（intervertebral disc degeneration, IVDD组）椎间盘髓核组织中表达（0.65±0.12）明显低于对照组（ 1.01±0.10）,miR-146a在 LPS组 NP细胞中表达（ 0.29±0.11）明显低于阴性对照组（1.06±0.07）,差异均有统计学意义（ t=11.856,10.229,均 P＜ 0.01）。与阴性对照组比较, LPS组上清液中的 IL-1β, TNF-α和 IL-6含量明显升高,差异均有统计学意义（ t=15.572~23.354,均 P＜ 0.001）。上调 NP细胞 miR-146a表达,能够提高 LPS刺激的 NP细胞的增殖活性（ t=4.436~7.995, 均 P＜ 0.05）,降低其凋亡率（ t=9.255,P=0.001）,降低 TLR4蛋白（ t=5.881,P=0.004）和 IL-1β,TNF-α和 IL-6等炎性细胞因子水平（ t=8.854~10.772,均 P＜ 0.01）;而下调 NP细胞 miR-146a表达则出现相反的结果（ t=2.977~6.777,均 P<0.05）。结论　miR-146a在退变椎间盘髓核组织中表达降低, miR-146a可能能够通过靶向 TLR4调控 NP细胞的增殖、凋亡和炎症反应,为椎间盘退变的生物治疗提供了新的方向。     

重症急性胰腺炎大鼠IL-8 IL-10及NF-κB的表达

目的 通过观察重症急性胰腺炎（SAP）大鼠白介素-8（IL-8）、白介素-10（IL-10）及胰腺NF-κB的表达，探讨重症急性胰腺炎的发生发展机制。方法将40只大鼠随机分为正常对照组（假手术组）、模型组（重症急性胰腺炎组），每组20只，造模后24h测定血淀粉酶、IL-8及IL-10，切取相同部位的胰腺组织观察组织病理学改变，进行NF—κB的免疫组织化学染色。结果模型组大鼠血清淀粉酶、IL-8及IL-10的浓度均显著高于对照组，模型组NF-κB免疫组化染色较对照组显著增强。结论IL-8、IL-10及NF—κB在重症急性胰腺炎的发生发展中起重要作用，重症急性胰腺炎的早期即有胰腺组织NF—κB的活化。     

miR-223对结肠癌SW480细胞生物学行为的影响

目的 观察miR-223对结肠癌SW480细胞增殖、细胞周期及凋亡的影响.方法 PLL3.7-miR-223和PLL3.7-miR-EV质粒转染SW480细胞,Real-time PCR检测转染24h后miR-223的表达变化,CCK-8试剂盒检测转染12、24、48 h后细胞的增殖能力,流式细胞仪分析转染48 h后细胞周期和凋亡情况,Western blot检测IGF-1R、AKT蛋白表达情况.结果 转染24 h后,Real-time PCR检测结果显示PLL3.7-miR-223转染组miR-223的表达量（6.55±2.04）较PLL3.7-miR-EV（以其miR-223的表达量为1）明显上调（P＜0.01）.与对照EV组相比,SW480细胞在转染miR-223后生长明显受到抑制,细胞周期在G1期发生阻滞[（61.61±4.02）％vs.（35.99±1.62）％],凋亡增加明显[（67.43±4.75）％vs.（44.23±3.11）％],均P＜0.01,并且能够降低生长相关蛋白IGF-1R及细胞凋亡相关蛋白AKT的表达.结论 miR-223可以通过调节IGF-1R和AKT的表达影响结肠癌细胞SW480的增殖、细胞周期和凋亡.     

急性缺血性脑卒中小鼠模型脑组织中miR-21 表达对炎症反应和细胞凋亡的影响及相关机制研究

目的 研究急性缺血性脑卒中（acute ischemic stroke, AIS）小鼠模型脑组织中miR-21 表达对炎症反应和细胞凋亡的影响,并探讨其相关分子机制。方法 选取C57/BL6 小鼠30 只随机均分为假手术组、短暂局灶性大脑中动脉闭塞（tran-sient middle cerebral artery occlusion,tMCAO）模型组（利用线栓法构建短暂局灶性大脑中动脉闭塞小鼠模型）及miR-21 agomir 激动剂预处理组（tMCAO 术后侧脑室注射miR-21 agomir 激动剂）。RT-PCR 法检测小鼠脑组织中miR-21 表达水平;改良神经严重程度评分（modified neurological severityscore,mNSS）评估小鼠神经功能;2,3,5-三苯基氯化四氮唑（2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride,TTC）染色法检测小鼠脑梗死体积;酶联免疫吸附法检测炎症因子（TGF-β1,TNF-α,IL-18 和IL-10）水平变化;原位末端标记（terminal-deoxynucleoitidyl transferase mediatednick end labeling,Tunel）法观察小鼠神经细胞凋亡情况;蛋白免疫印迹法检测TLR4/NF-κB/NLRP3 通路相关蛋白及凋亡蛋白（Bcl-2/Bax）表达情况。结果 假手术组﹑ tMCAO 模型组和miR-21 agomir 组小鼠脑组织中miR-21 表达水平分别为0.83±0.17,0.50±0.11 和1.55±0.32,组间差异有统计学意义（F=43.805,P<0.05）。假手术组小鼠神经功能mNSS 评分均为0 分,tMCAO 组mNSS 评分明显高于miR-21 agomir 组（11.30±3.42 vs 5.61±1.73）,差异有统计学意义（t=12.784,P<0.05）。假手术组小鼠脑组织未出现梗死现象,tMCAO 组脑梗死体积（62.72%±5.30%）高于miR-21 agomir 组（38.22%±3.31%）,差异有统计学意义（t=31.309,P<0.05）。与tMCAO 组比较,miR-21 过表达明显降低促炎因子TNF-α 和IL-18 水平,升高抗炎因子TGF-β1 和IL-10 水平,差异均有统计学意义（t=3.785 ～ 9.693,均P<0.05）。假手术组脑组织皮层细胞凋亡数约为9.40±5.21 个,明显低于 tMCAO 组的75.52±12.81 个,差异有统计学意义（t=38.552,P<0.05）;miR-21 agomir 组细胞凋亡数约为42.41±9.62 个,低于tMCAO 组,差异有统计学意义（t=19.174,P<0.05）。与tMCAO 组比较,miR-21 过表达组小鼠脑组织中TLR4, NF-κB,p-NF-κB 和NLRP3 蛋白表达降低,Bcl-2/Bax 表达升高,差异均有统计学意义（t=2.314 ～ 3.098,均P ＜ 0.05）。结论 miR-21 在急性缺血性脑卒中后小鼠脑组织中表达明显下降,其过表达可以调节脑缺血后促炎因子和抗炎因子之间的平衡,改善皮层细胞凋亡,可能是通过调控TLR4/NF-κB/NLRP3 通路发挥脑损伤保护作用。     

腹腔内注射骨髓间充质干细胞对急性胰腺炎小鼠相关肺损伤的影响及相关机制研究

目的研究腹腔内注射骨髓间充质干细胞(BMSC)对雨蛙素诱导的急性胰腺炎(AP)小鼠肺损伤的影响,并进一步探讨其可能的机制。方法选取Balb/c小鼠作为研究对象,分为Sham组(注射0.9%氯化钠溶液),AP组(腹腔注射雨蛙素诱导AP模型)和AP+BMSC组(经BMSC治疗的AP模型),每组各8只。分别在AP诱导成功后12、24、48 h,收集小鼠血液并处死小鼠,测定不同组小鼠肺组织湿/干重比值,并用苏木精-伊红染色法评估小鼠肺组织病理变化,并检测3组小鼠肺组织髓过氧化物酶(MPO)活性和血清肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-10(IL-10)、淀粉酶(AMY)以及丙二醛(MDA)含量。结果与Sham组相比,AP组和AP+BMSC组小鼠在诱导建立AP模型后12、24、48 h肺组织湿/干重比值、血清淀粉酶、肺组织MPO以及血清TNF-α、IL-6、IL-10和丙二醛均显著升高,差异均有统计学意义(P<0.05);与AP组小鼠相比,AP+BMSC组小鼠在诱导建立AP模型后12、24、48 h肺组织湿/干重比值、血清淀粉酶、肺组织MPO以及血清TNF-α、IL-6、IL-10和丙二醛均显著降低,血清IL-10含量显著升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论腹腔内注射骨髓间充质干细胞可显著减弱AP引起的肺损伤,其作用机制可能与改善AP小鼠氧化应激及炎症反应水平有关。     

急性胰腺炎胰腺腺泡细胞凋亡对大鼠腹腔巨噬细胞功能影响的研究

目的：研究急性胰腺炎胰腺腺泡细胞凋亡对巨噬细胞免疫功能的影响。方法：采用奥曲肽（OCT）诱导cae-rulein处理的AR42J细胞凋亡作用于大鼠腹腔巨噬细胞,检测巨噬细胞的粘附和吞噬功能;使用ELISA试剂盒检测细胞培养上清中TNF-α的含量。结果：急性胰腺炎胰腺腺泡细胞凋亡显著降低巨噬细胞的粘附功能和吞噬功能（P〈0.05）,同时能降低巨噬细胞分泌TNF-α的功能。结论：急性胰腺炎胰腺腺泡细胞凋亡能降低巨噬细胞的功能。     

激素对急性胰腺炎大鼠血中细胞因子的影响及其意义

目的 :探讨激素对急性胰腺炎血中细胞因子的影响及其意义。方法 :将试验大鼠分成正常对照组、急性胰腺炎组和激素治疗组 ,观察各组大鼠血中炎症性细胞因子 (TNF α、IL 1和IL 6 )和抗炎症性细胞因子 (TGF β1和IL 10 )和血中淀粉酶的水平以及胰腺病变和胰腺湿重。结果 :①急性胰腺炎时血中炎症性细胞因子 (TNF α、IL 1和IL 6 )和抗炎症性细胞因子 (TGF β1和IL 10 )均明显升高 ,激素治疗后上述细胞因子较急性胰腺炎组均下降 ,TNF α、IL 1和IL 6在 2、 6小时时段下降最明显 (P <0 0 5 ) ,TGF β1和IL 10在 2 4小时时段明显下降(P <0 0 5 )。②急性胰腺炎组胰腺病理改变重 ,胰腺湿重较正常对照组明显增加 (P <0 0 5 ) ,经激素治疗后 ,胰腺病变明显减轻 ,胰腺湿重较急性胰腺炎组明显减少 (P <0 0 5 )。③急性胰腺炎组血中淀粉酶较正常对照组明显升高 (P <0 0 5 ) ,激素治疗后血中淀粉酶仍较正常对照组明显升高 (P <0 0 5 ) ,与胰腺炎组无统计学差异 (P >0 0 5 )。结论 :①在急性胰腺炎病程中 ,的确存在着一个免疫过激和免疫抑制的先后并存的双向免疫异常状态。②糖皮质激素可通过抑制炎症性细胞因子和抗炎症性细胞因子等对急性胰腺炎有多层面调节作用。     

miR-34a通过调控YY1抑制肾癌细胞的增殖及侵袭

目的探讨miR-34a在肾癌组织中表达、miR-34a对人肾癌ACHN细胞增殖和侵袭的影响及调控机制。方法实时聚合酶链反应(PCR)检测miR-34a在20例肾癌及癌旁组织中的表达;采用脂质体转染法将miR-34a mimics转染入肾癌ACHN细胞中,试验分空白对照组、阴性对照组、miR-34a mimics转染组。实时PCR检测转染24 h后miR-34a表达量;噻唑蓝(MTT)试验检测细胞增殖;流式细胞术检测细胞周期;Transwell及Matrigel检测细胞侵袭能力;实时PCR和蛋白质印迹(Western blot)技术检测转染后转录因子YY1表达水平。结果与癌旁组织相比,20例癌组织中miR-34a平均表达量为1.06±0.67,显著低于癌旁组织(1.62±0.83,P<0.01);转染后24 h,miR-34a mimics转染组的miR-34a表达量为157.04±13.01,较阴性对照组显著上调(P<0.01);miR-34a mimics转染组细胞增殖能力显著降低(P<0.01),细胞生长被阻滞在G0/G1期;细胞侵袭能力明显减弱(P<0.01);转染miR-34a mimics后YY1基因在mRNA表达无明显变化(P>0.05),蛋白水平下调。结论 miR-34a在肾癌中低表达,可能与肾癌的发生有关;miR-34a调控YY1的表达可能是抑制肾癌细胞生物活性的重要机制之一。