产生抗单纯疱疹病毒单克隆抗体杂交瘤细胞系的建立

用HSV-1 SM44株免疫C×S/1小鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞系Sp2/O融合,经HAT选择培养,细胞融合率为100％。ELISA筛选后获得53孔产生抗HSV抗体的杂交瘤阳性孔。对1A12,2A8,1G8,1D10,2C5 5株细胞系用有限稀释法做2～5次克隆化,阳性克隆率均达到100％。杂交瘤细胞系经连续传代培养4个月,仍能稳定产生单克隆抗体,冻存的细胞系经复苏后亦能稳定产生抗体。应用ELISA及IF试验证明,5种单克隆抗体均与HSV-1和HSV-2标准株呈特异性反应。ELISA测定,杂交瘤培养上清抗体效价为10~(-2)～10~(-3),制备免疫腹水效价为10~(-4)～10~(-7)。5种单克隆抗体与EBV,CMV,JEV和HFRSV无交叉反应。     

抗伏马菌素B1单克隆抗体的制备和特性

目的建立敏感、特异和快速的针对伏马菌素B1(fumonisin B1, FB1)的酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay ,ELISA)检测方法,形成具有我国自主知识产权的快速检测试剂盒.方法利用B细胞杂交瘤技术,建立能分泌抗伏马菌素B1单克隆抗体的杂交瘤细胞株.结果用伏马菌素B1-牛血清白蛋白(FB1-BSA)偶联物免疫8～10周龄雌性BALB/c小鼠后,取脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞系Sp2/0融合,经过3～4次亚克隆建立了1个稳定分泌抗伏马菌素B1毒素抗体的杂交瘤细胞株,命名为5A9.将杂交瘤细胞打入BALB/c小鼠腹腔,获得含抗伏马菌素B1毒素单克隆抗体的腹水,并将腹水用饱和硫酸铵法进行纯化,得到单克隆抗体.该单克隆抗体的Ig亚类为IgG1,腹水中抗体的滴度分别为2.56×106,参考工作浓度为3.2×105.纯化后抗体的IgG含量为10.4 g/L,亲和常数为8.3×10-8 mol/L.该抗体与其他结构类似物无交叉反应,具有较高的特异性.结论制备了具有高特异性和亲和力的抗伏马菌素B1单克隆抗体,初步形成了针对伏马菌素B1的ELISA检测试剂盒.     

抗T-2毒素单克隆抗体的制备及特性

目的 :建立敏感、特异和快速的针对T 2毒素的ELISA检测方法 ,形成具有我国自主知识产权的快速检测试剂盒。方法 :利用B细胞杂交瘤技术 ,建立抗T 2毒素的单克隆杂交瘤细胞株。结果 :用T 2 羊免疫球蛋白 (T 2 GIgG)偶联物免疫 8～ 10周龄雌性BALB/c小鼠后 ,取脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞系Sp2 /0融合 ,经过 3～ 4次亚克隆建立了 2个稳定分泌抗T 2毒素抗体的杂交瘤细胞株 ,分别命名为 2A7和 6E4。将上述 2株杂交瘤细胞分别注入BALB/c小鼠腹腔 ,获得含抗T 2毒素单克隆抗体的腹水 ,并将腹水用饱和硫酸铵法进行纯化 ,得到 2A7和 6E4单克隆抗体。两株单克隆抗体的Ig亚类为IgG1,腹水中抗体的滴度分别为 6 .4× 10 6和 1.1× 10 7,参考工作浓度分别为1.0× 10 6和 3.2× 10 6。纯化后 2A7抗体的IgG含量为 16 .4g/L ,亲和常数为 8× 10 -8mol/L。 2A7抗体与其他结构类似物无交叉反应 ,具有较高的特异性。结论 :制备了具有高特异性和亲和力的抗T 2毒素单克隆抗体 ,初步建立了针对T 2毒素的ELISA检测方法。     

产毒大肠杆菌不耐热肠毒素单克隆抗体杂交瘤细胞系的建立及初步应用

用亲和层析纯化的产毒大肠杆菌(ETEC)不耐热肠毒素(LT)免疫BALB/C小鼠,将小鼠脾细胞与SP_(2/0)骨髓瘤细胞(1:8)在PEG(MW1000)作用下融合,采用ELISA筛选抗-LT抗体阳性孔,细胞融合率为50％,抗体阳性率为4.5％,经3～5次克隆后筛选出2株分泌抗-LT杂交瘤细胞株(2D_、2E_5),用ELISA测定杂交瘤细胞培养上清及腹水的效价,后者约为前者的100倍,高达90万～110万。通过平板免疫溶血试验和ELISA双抗夹心法分别对2株杂交瘤分泌的抗LT单克隆抗体(McAb)的特异性进行了试验,结果表     

产生抗登革4型病毒单克隆抗体杂交瘤细胞系的建立

用登革4型H241株病毒免疫的小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合,获得了5个产生抗登革4型病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞系。这些杂交瘤细胞的上清液及小鼠腹水抗体均用间接免疫荧光法检测。其中两个杂交瘤细胞系产生的抗体对登革4型病毒具有型特异性,它们的荧光抗体滴度分别为1:10,240～1:20,480和1:2,560。另两个细胞系产生的抗体对登革2型病毒有交叉;另1个对登革1型病毒有交叉。     

用免疫荧光法筛选抗人μ链单克隆抗体的研究

用人血清IgM球蛋白重链——μ链免疫的BALB/C小鼠脾细胞与鼠骨髓瘤SP2/0细胞在聚乙二醇(PEG)作用下融合,用改进的免疫荧光技术筛选出6株分泌单克隆抗体(McAb)的杂交瘤细胞,其中5株分泌物确定为抗人μ链McAb,1株未定.杂交瘤细胞经4次克隆,半年多传代,接种BALB/C鼠可稳定地产生腹水抗体.     

抗PSMA7单克隆抗体的制备和初步鉴定

目的制备抗蛋白酶体α7亚基(PSMA7)的单克隆抗体,为PSMA7的功能研究奠定基础。方法以纯化的重组蛋白PSMA7为抗原免疫BALB/c小鼠,运用杂交瘤技术制备PSMA7单克隆抗体,并用间接ELISA法和Western blot法对单克隆抗体的特性进行鉴定。结果成功建立两株稳定分泌抗PSMA7蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株,分别命名为B013和B001。检测杂交瘤细胞培养上清抗体效价为1∶128和1∶256,腹水效价为1∶25600和1∶32000。两株单克隆抗体的免疫球蛋白亚类均为IgG1。Westernblot及免疫组化实验证实,两株单克隆抗体均能特异性结合真核细胞内源性PSMA7蛋白。结论成功建立了两株效价高、特异性好的抗PSMA7单克隆抗体杂交瘤细胞,制备的单克隆抗体可用于PSMA7蛋白的鉴定,为其生物学功能研究奠定了基础。     

产生流行性乙型脑炎病毒单克隆抗体杂交瘤细胞系的建立

用JEV-SA,免疫BALB/C小鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞(NS_1)在PEG作用下融合,以ELISA、HI、IF 3种方法检测抗体,建立了1株针对JEV-SA_4的单克隆抗体杂交瘤细胞系。该细胞系染色体在74～98之间,含中着丝点标志染色体,经4次克隆化,连续传代5个月仍持续分泌特异性抗体,该抗体为IgG_3亚类。     

分泌抗B型肉毒毒素单克隆抗体的产生与特性鉴定

以B型肉毒类毒素免疫BALB/C小鼠,取脾细胞与NS-1骨髓瘤细胞进行细胞融合。用ELISA方法筛选有杂交细胞生长孔的上清液,其中有66.7％的孔可分泌肉毒毒素特异性抗体。用有限稀释法进行克隆化培养后,获得4株稳定的杂交瘤细胞系(3B10、3B11、3G12和4A5),在体外培养中均持续分泌抗体,培养液抗体效价达10~(-3)～10~(-5);注入BALB/C小鼠腹腔制备出富含抗体的腹水,抗体效价达10~(-6)～10~(-8)。经用A型和B型类毒素作特异性鉴定,表明抗体3G12及4A5与A型无交叉反应,为B型特异性的。抗体3B10及3B11与A型有弱交叉反应。Ig种类鉴定表明抗体3B10及3G12为IgG_1;抗体3B11及4A5为IgG_2。染色体检查证明4株细胞均为杂交瘤细胞。小白鼠体内进行中和保护力测定表明4种单克隆抗体对肉毒毒素均无保护作用。     

地高辛特异性单克隆抗体制备的研究(摘要)

研究了应用淋巴细胞杂交瘤技术制备地高辛特异性单克隆抗体(MAb),并对抗体特性进行了分析,以探讨该抗体用于监测地高辛血药浓度及治疗严重中毒的可能性。作者用过碘酸钠法将地高辛分别偶联于牛血清白蛋白(Dig—BSA)和卵白蛋白(Dig—OVA);用Dig—OVA加Freund完全佐剂腹腔注射,免疫8周龄雌性BALB/c小鼠获取牌细胞与SP2/O骨髓细胞。以ELISA间接法筛选地高辛特异性抗体分泌阳性的杂交瘤克隆,并用有限稀释法进行克隆化。所获杂交瘤细胞系经扩大培养、液氮冻存、注入BALB/c小鼠腹腔制备MAb腹水,并测定MAb的特异性、MAb与地高辛、洋地黄毒甙、毛花强心丙、毒毛旋花子甙K和     

利用DNA免疫建立分泌登革2型病毒E蛋白单抗的杂交瘤细胞系

目的:利用DNA免疫建立分泌登革2型病毒E蛋白特异单抗的杂交瘤细胞系,为研究E蛋白的结构和功能及其抗原表位提供新手段.方法:以构建的病毒全长prM-E基因的真核重组质粒DNA作为免疫原,免疫BALB/c小鼠后将其脾细胞和SP2/0瘤细胞融合,通过IFA、间接ELISA和空斑减少中和试验对杂交瘤细胞系进行筛选和鉴定.结果:获得了4株分泌登革2型病毒E蛋白单抗的杂交瘤细胞系(2B4,6B4,4C10和2D5),它们结合的抗原表位均位于E蛋白Ⅲ区,其中4C10对登革2型病毒具有中和活性.这些单抗与登革1、3和4型病毒有强的交叉反应,但与黄病毒其他成员反应较弱.结论:DNA免疫法可用于分泌登革2型病毒E蛋白特异单抗的杂交瘤细胞系的建立,该结果有利于登革病毒E蛋白特异抗原表位的研究及新的登革病毒诊断试剂的研制.     

登革2型病毒单克隆抗体的制备与鉴定

用登革2型病毒参考株免疫的BALB/C小鼠脾细胞与SP2/0小鼠骨髓瘤细胞在PEG1000作用下进行融合,获得了10株分泌抗登革2型病毒单克隆抗体的杂交瘤。经间接免疫荧光鉴定,有4株杂交瘤产生的单克隆抗体对登革2型病毒是型特异的;2株对登革1型有交叉反应;1株对登革3型有交叉反应;1株对登革4型有交叉反应;另2株为黄病毒属特异的。经补体结合和血凝抑制试验鉴定,有2个单克隆抗体是黄病毒属血凝抑制特异的。这10个单克隆抗体对登革热的诊断是很有用的。     

抗A型肉毒毒素鼠源性单克隆抗体的制备和鉴定

目的：制备与鉴定抗A型肉毒神经毒素重链C端（ heavy chain of botulinum neurotoxin serotype A, BoNT／AHc）特异性鼠单克隆抗体。方法通过纯化BoNT／AHc抗原、免疫BALB／c小鼠并建立杂交瘤细胞以制备鼠单抗,用ELISA、Western印迹实验和抗体分型试剂盒进行分析鉴定,并通过ELISA检测鼠单抗与BoNT／AHc突变体结合,初步鉴定其在BoNT／AHc的结合表位。结果得到纯度较高的BoNT／AHc抗原,制备了4株特异性鼠单抗1A4、3H3、3H7、5H8。间接ELISA结果显示,单抗细胞上清效价均＞3．0×103;Western印迹检测结果显示,单抗均能与BoNT／AHc特异性结合;抗体亚型鉴定结果为1A4、3H7属于IgG1（Κ）,3H3属于IgM（Κ）,而5H8属于IgG2b （Κ）;叠加ELISA实验表明,4株单抗抗原识别表位相近;用ELISA检测单抗与BoNT／AHc突变体结合实验结果初步确定了4株单抗与BoNT／AHc的结合表位。结论对抗A型肉毒毒素鼠源性抗体完成了制备和鉴定,为肉毒毒素中和抗体的开发与阐明中和抗体的表位奠定了基础。     

抗Salmonella minnesota R_(595)菌脂多糖杂交瘤的建立及其抗体特性的初步鉴定

将煮沸致死的R_(595)菌体免疫BALB/C小鼠,取其脾细胞在PEG介导下与SP_(2/0)细胞融合,经筛选获得2个阳性孔2D_6、3H_4。将2D_6、3H_4阳性孔细胞克隆,传代最终获得8株能稳定分泌抗R_(595)内毒素单抗的杂交瘤株。经鉴定,杂交瘤细胞染色体数90余条,抗体效价(EL1SA法)10~4～10~5,2D_6B_1,2D_6E_7单抗的Ig类型为IgG_1,3H_42F_7、3H_42H_3单抗Ig类型为IgG2_b,轻链均为K链。类脂A抑制试验显示,单抗识别的表位为类脂A或KDO,表明抗体识别内毒素保守区域。间接EL1SA试验表明,抗体能与多种GNB交叉反应,提示抗体具广谱交叉反应性。玻片凝集试验显示,抗体仅能凝集R_(595)菌,不能凝集其它GNB菌。     

登革1型病毒的单克隆抗体

我们用SP2/0-Ag14小鼠骨髓瘤细胞与用登革1型病毒免疫的BALB/C小鼠脾细胞在融合剂PEG-1000的诱导下进行融合,获得了15株产生抗登革1型病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞系。其中14株属登革病毒型特异,1株属登革病毒亚群特异,它们的荧光效价均在10,240以上。15株杂交瘤均无血凝活性,3株有补体结合活性。1D_4,1B_9的IgG亚类为IgG_1,1F_(11)为IgG_2a,轻链均为K型。1株杂交瘤(1D_4)的染色体数为87～115。用SDS-PAGE测定1D_4分子量,重链为54,000,轻链为24,000。15株杂交瘤连续传代3～6个月,冻存复苏后抗体水平未见下降。     

8－氮鸟嘌呤诱变3D_5杂交瘤细胞的初步研究

小鼠杂交瘤３Ｄ５为一株分泌抗人红细胞非凝集性单克隆抗体的杂交瘤细胞株，用８－氮鸟嘌呤（８－ＡＧ）诱变处理可以使之成为具有模拟骨髓瘤性质的次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶缺失的杂交瘤细胞系，并且保留杂交瘤细胞系分泌抗体的能力，在利用自身血细胞凝集试验对各种病原体的快速诊断中应用广泛。实验表明，用不同剂量的８－ＡＧ进行诱变，在不同剂量水平上３Ｄ５杂交瘤细胞主要呈现细胞生长抑制、部分细胞衰老死亡、存活细胞分裂生长成为多细胞克隆及细胞适应８－ＡＧ诱变后恢复正常生长能力等一系列的变化过程。利用间接免疫荧光方法检测３Ｄ５分泌抗体结果表明，诱变后３Ｄ５杂交瘤细胞株仍然保持有分泌抗人红细胞非凝集性单克隆抗体的能力，此细胞系的建立不仅为研制自身血细胞凝集试验的双功能抗体奠定了基础，同时也具有一定理论意义     

天然生物活性N-酰基高丝氨酸内酯小分子抗原的化学合成及其抗体生成初探

目的人工合成N-酰基高丝氨酸内酯(N-acylated homoserine lactones,N-aHSLs)完全抗原并制备相应单抗,建立N-aHSLs免疫检测的新方法及海洋弧菌N-aHSLs动态监测。方法以月桂酸和高丝氨酸内酯为主要原料,通过多步系列化学反应人工合成N 十二酰高丝氨酸内酯(N-lauroyl-homoserine lactone,N-C12-HSL)及含羧基活性交联基团的半抗原衍生物12-羧基-N-十二酰高丝氨酸内酯（12-carboxyl-N-decanoyl-L-homoserine lactone,12-CD-LHL）,用1H-磁共振、高压/效液相色谱仪和液相色谱 质谱联用方法确证合成产物的结构,并用生物感应法检测合成N-aHSLs的天然生物活性;用N-羟基琥珀酰亚胺活泼酯法将12-CD-LHL半抗原衍生物连接到载体蛋白;将N-C12-HSL人工完全抗原通过传统单抗制备技术,获得抗N-aHSLs杂交瘤细胞株,用酶联免疫吸附测定法鉴定其特异性和效价。结果质谱、磁共振氢谱分析结果与理论预测相同,成功合成目标产物N-C12-HSL和12-CD-LHL半抗原衍生物;所合成的N-aHSLs能够分别激活生物感应菌株大肠杆菌MG4和紫色色杆菌026并使之显色;紫外吸收光谱扫描结果显示,半抗原已分别与牛血清白蛋白和卵清蛋白发生偶联,成功制备完全抗原;共获得3株抗N-C12-HSL单抗,均具有良好的免疫反应性。结论N-aHSLs完全抗原和相应的单抗制备为N-aHSLs动态监测和后续研究奠定了基础。     

抗人IgK和Igλ链单克隆抗体的制备及临床初步应用

用初乳和血清IgA免疫Balb/c小鼠的脾细胞与SP_2/O和NS-1瘤细胞融合,以ELISA双抗原夹心法检测获得5株杂交瘤细胞。其中3株(1D1、5C3、11A7)分泌抗人游离和结合型λ轻链;2株(4G12、14A6)分泌抗人游离和结合型K轻链。4G12与结合型K链反应比游离K链好。这些细胞株在长达1年的培养中仍能稳定分泌特异性单克隆抗体,经液氮冻存10个月后杂交瘤细胞仍保持原有的特性。用固相抗原竞争ELISA试验表明,两个抗K链McAb是针对不同的抗原位点,而3株抗λ链则针对相同的抗原位点。用于检测副蛋白和本周氏蛋白具有很好的特异性和敏感性。把McAb4G12-HRP和1D1-HRP混合,用于检测-EB病毒早期抗原(EA)和壳抗原(VCA)抗体被证明是满意的,同时试用于抗核抗体的检测也获得了初步的结果。     

脾内注射法免疫小鼠制备抗—HBc单克隆抗体的研究

用基因工程菌产乙型肝炎核心抗原(HBcAg)对 Balb/c 小鼠脾内多点注射法免疫,将该鼠的脾淋巴细胞与鼠骨髓瘤细胞在 PEG 作用下融合,用固相放射免疫分析法(SPRIA)筛选,成功地获得了2株抗-HBc 阳性的杂交瘤细胞株。通过中和试验和交叉鉴定,2株抗-HBc 单克隆抗体只能与 HBcAg 起反应,而不能与 HBsAg 和 HBeAg 反应。经多次亚克隆后,所得腹水中的抗-HBc 滴度达1:64000～1:28000。这2株单克隆抗体做包被抗体检测 HBcAg 和(125)~Ⅰ标记查患者血清标本时,所测得的结果与人抗-HBc 多克隆抗体做包被或(125)~Ⅰ标记所测得的结果相一致。2株杂交瘤细胞连续传代3个多月,冻存复苏后仍能稳定地分泌特异的抗-HBc 单克隆抗体。     

Iteration of hybridoma growth and productivity in hollow fiber bioreactors using 31P NMR

Applications of nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy to isolated or cultured mammalian cells have been limited because of technical difficulties in maintaining cultures at the extremely high densities required by NMR. Among the well-engineered systems available for such analyses, hollow fiber bioreactors (HFBRs) can maintain the greatest cell density. This attribute of HFBRs makes them ideal for application to NMR-based studies. These systems are currently being applied in biotechnology, where they are used for the production of mammalian cell-derived products, such as monoclonal antibodies. In this paper, the application of a HFBR system designed especially for NMR-based investigations is described. Performance of this system is monitored by NMR and the resulting stability and density of hybridoma cultures are reported. The resulting signal-to-noise per unit time is the highest seen to date for a mammalian cell system.