实时荧光PCR同时检测金黄色葡萄球菌和大肠杆菌O157：H7

目的建立改良分子信标一双重实时荧光PCR同时检测金黄色葡萄球菌和大肠杆菌0157：H7,应用于细菌性食物中毒的快速诊断。方法根据GeneBank公布的金黄色葡萄球菌nuc基因序列和大肠杆菌O157：H7rfbE基因序列,设计引物和改良分子信标探针,建立改良分子信标一双重实时PCR检测体系。结果双重荧光PCR反应体系检测151株金黄色葡萄球菌和27株大肠杆菌O157：H7,均出现特异的荧光信号,两种细菌检测互不干扰。对8762份大便、食品等标本进行检测,315份标本金黄色葡萄球菌实时荧光PCR阳性,其中286份金黄色葡萄球菌培养阳性;31份标本大肠杆菌O157：H7实时荧光PCR阳性,其中26份大肠杆菌O157：H7培养阳性。从样品处理到检测结果仅需要时间2h～1d。结论改良分子信标-多重实时荧光PCR检测体系快速、灵敏度高,特异性强,可用于金黄色葡萄球菌和大肠杆菌O157：H7食物中毒的快速诊断和肠道传染病的初筛,为食源性疾病的分子流行病学调查提供新的检测手段。     

改良分子信标-实时PCR快速检测霍乱弧菌

目的：建立改良分子信标-实时PCR检测霍乱弧菌的快速方法，应用于霍乱监测。方法：根据GenBank公布的霍乱弧菌肠毒素基因A亚单位(ctxA)的保守序列，设计一对引物和改良分子信标探针，并进行特异性和灵敏度分析；同时以11种细菌作对照，建立改良分子信标检测霍乱弧菌的实时PCR反应体系，应用于霍乱监测。结果：霍乱弧菌改良分子信标检测体系检测12种细菌，只有霍乱弧菌有荧光信号，与其他细菌无交叉反应，DNA灵敏度为102．4fg／ul，菌液灵敏度为32cfu／ml或3cfu／PCR反应体系。对100份海产品和30份腹泻病人大便标本进行检测，结果都为阴性。检测时间仅需2h。结论:改良分子信标-实时PCR检测体系快速、灵敏度高、特异性强，可用于霍乱的快速诊断，为霍乱的分子流行病学调查提供新的检测手段。     

免疫磁珠富集-实时荧光PCR检测生畜肉中大肠埃希菌O157∶H7的实验研究

目的 建立免疫磁珠富集(immunomagnetic separation,IMS)-实时荧光PCR(q PCR)技术快速检测肠出血性大肠埃希菌O157∶H7的方法。方法 根据肠出血性大肠埃希菌O157∶H7抗原特异性基因rfb EO157设计引物和Taq Man探针,建立q PCR检测体系;对样品中的O157∶H7大肠埃希菌用出血性大肠O157抗体标记免疫磁珠进行特异性捕获,再利用q PCR技术对磁珠吸附的菌株进行检测。结果 采用IMS-q PCR方法检测,当25 g样本中菌量为100cfu,样品被1∶2稀释时,检测结果呈阳性,检测全过程需时2~3 h。结论 IMS-q PCR检测O157∶H7大肠埃希菌的方法具有灵敏度高、特异性强、快速等优点,可用于大肠埃希菌O157∶H7食物中毒的快速诊断和食品微生物检测,为食源性疾病的分子流行病学调查提供新的检测手段。     

分子信标PCR检测志贺菌ipaH基因

目的用分子信标探针PCR快速检测志贺菌属(Shigella)。方法根据GenBank上公布的福氏志贺菌M32063株ipaH基因序列,设计引物和分子信标探针,以4种细菌进行对照,进行特异性和灵敏度分析,建立Shigella的实时PCR技术快速检测,应用于食物中毒和食品检测。结果检测20个样本,Shigella呈阳性,其它呈阴性,时间约2h。结论Shigella分子信标探针技术具有快速、灵敏度高、特异性强等特点,可用于Shigella食物中毒快速诊断和食品微生物检测,为食源性疾病的早期、准确诊断提供新的检测手段。     

多联实时荧光PCR定量方法检测四种肠道细菌的研究

目的 建立一种能同时检测空肠弯曲菌(CJ)、肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157：H7、副溶血性弧菌(VP)和单核增生李斯特菌(LM)的多联实时荧光PCR定量方法。方法根据CJ的C基因序列、EHEC O157：H7的RFBE基因序列、VP的toxR基因序列和LM的iap基因序列的开放阅读框(ORF)，分别利用ABI primer experess 2．0和DNAStar中的Primer Seleet软件设计出了数对特异性的引物和探针，筛选出最佳的各组引物和探针组合，对引物、探针的浓度、Mg^2 浓度、Taq酶的用量、反应条件等进行优化，从而建立了检测临床标本中CJ、O157：H7、VP和LM的多联荧光PCR反应体系和检测方法。结果实验显示该方法具有特异性强，灵敏度高，均达到100copies／ml。结论多联实时荧光PCR方法可定量检测临床标本中CJ、0157：H7、VP和LM，该法快速简便，准确高效，有利于上述病原菌所致痰病的早期诊断和治疗。     

应用插入序列PCR进行大肠杆菌O157:H7基因分型的研究

目的对不同地区、不同宿主大肠杆菌O157：H7分离株进行基因分型。方法应用插入序列PCR方法，对反应体系中dNTPs、引物以及镁离子浓度等反应条件进行优化。扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳检测和分析。结果14株不同来源O157：H7分离株根据插入序列PCR图谱可分为A、B、C、D四个基因型。不同地区O157：H7菌株存在不同的基因型；同一地区、毒力基因谱相同的O157：H7菌株基因型也不相同；不同宿主O157：H7菌株也存在相同的基因型。结论插入序列PCR技术用于大肠杆菌O157：H7的基因分型，简便、快速、敏感，对大肠杆菌O157：H7的分子流行病学研究具有重要价值。     

检测肠出血性大肠埃希菌O157:H7的环介导等温扩增和PCR法比较

目的建立基于环介导等温扩增(LAMP)技术的肠出血性大肠埃希菌(EHEC)O157:H7快速简便检测方法,并与PCR进行比较。方法针对EHEC O157:H7保守的rfbE基因序列,设计特异性引物,建立LAMP和PCR检测技术并优化其反应条件,比较这两种检测方法的灵敏度、特异性和对实际样品的检测结果。结果成功建立了LAMP和PCR检测体系,灵敏度检测结果显示,LAMP检测限低至10 cfu/ml,PCR检测限为102cfu/ml,LAMP检测灵敏度高于PCR;对39株近源菌进行检测,结果显示,LAMP法仅7株EHEC O157:H7得到阳性结果,非EHEC O157:H7菌株均为阴性,PCR产物则出现非特异性条带,LAMP法特异性比PCR法高。对于32份猪肉样品的检测,LAMP和PCR与常规检测结果一致,3份样品检测阳性。结论 LAMP检测技术的特异性和灵敏度较PCR高,并且操作简便、检测成本低,耗时短,更有望发展成为快速准确检测EHEC O157:H7的有效手段。     

分子信标荧光定量PCR快速检测结核分枝杆菌方法的初步研究

目的建立分子信标荧光定量PCR快速检测结核杆菌方法,为临床结核病的诊断提供特异性强、灵敏度高、可标准化、自动化的检测方法。方法根据GenBank数据库公布的结核分枝杆菌IS6110基因的保守序列,设计引物与分子信标探针,建立结核分枝杆菌荧光定量PCR检测方法;以10种细菌作对照分析该方法的特异性与灵敏度;应用已建立的方法检测结核分枝杆菌,评价其应用价值。结果所建立的分子信标荧光定量PCR检测10种细菌,只有结核分枝杆菌有荧光信号,与其他细菌无交叉反应,4拷贝/PCR反应体系的结核分枝杆菌都能有效检出。对100株结核分枝杆菌的检测结果为阳性,单一检测时间仅需2h。结论分子信标荧光定量PCR检测方法快速、灵敏度高、特异性强,可用于快速诊断结核病,为结核病的诊断与治疗提供新的检测手段。     

寡核苷酸阵列芯片快速鉴定大肠杆菌O157:H7初步研究

目的设计、制作一种微型化寡核苷酸阵列芯片，评价快速鉴定肠出血性大肠杆菌O157：H7的效果。方法多重PCR扩增大肠杆菌O157：H7七个特异性基因位点（rfbE、flicH7、intimin、Shiga-like toxins Ⅰ and Ⅱ、hemolysin A和uidA）．通过PCR反应掺入SpectrumOrang^TM-dUTP获取荧光标记的靶序列，与制备的芯片寡核苷酸探针杂交。结果寡核苷酸阵列芯片检测结果与试验预期相符，获取的杂交图分辨效果明显优于多重PCR琼脂糖凝胶电泳。结论基于玻片的寡核苷酸阵列芯片制作简便，鉴定病原菌检测细菌毒力因子快速、灵敏、特异，有良好的应用前景。     

食品污染产单核李斯特菌不同检测方法学评估

目的评价以不同方法检测食品中污染产单核李斯特菌（LMO）效果，并对其检测方法进行优化。方法同时用国标法、改良国标法、改良分子信标-实时荧光PCR法、免疫磁性分离法对深圳市2004—2006年食品样品进行LMO分离鉴定并进行比较。结果228份样品中8份增菌液LMO实时荧光PCR阳性，其中6份LMO细菌培养阳性。国标法、改良国标法，改良分子信标-实时荧光PCR法、免疫磁性分离法都能栓出LMO，栓出率分别为2、63％、2．63％、3．50％、2、63％。深圳市食品中LMO的污染率为2.63％（国标法），速食类冻品污染率为12．8％（国标法）。结论荧光PCR法栓出率最高，将检测时间由原来的至少4—5d缩短至1d，可用于食品污染LMO状况调查的初筛扣食物中毒的快速诊断；国标法与改良国标法的栓出率相等，而后者的操作更方便。免疫磁性分离法的栓出率最低。     

实时荧光PCR同时检测丙型副伤寒沙门菌和猪霍乱沙门菌方法的建立和应用

目的建立丙型副伤寒沙门菌和猪霍乱沙门菌的实时荧光PCR快速检测方法,用于沙门菌属内的分型鉴定。方法根据GenBank公布的丙型副伤寒沙门菌和猪霍乱沙门菌的保守序列,设计引物和改良分子信标探针,建立实时PCR检测方法。结果检测体系灵敏度高,纯DNA和菌液的最低检出限分别可达10fg和20CFU/反应体系;特异性好,对71株细菌的检测符合率达100%。20株沙门菌采取盲号模拟血培养标本进行血培养检测及鉴定,检出5株丙型副伤寒沙门菌和4株猪霍乱沙门菌,与试验的菌株相符。70份食品中用实时荧光PCR同时检测丙型副伤寒沙门菌和猪霍乱沙门菌均为阴性,而用传统方法分离培养未检出。结论建立的实时PCR检测方法可以快速、特异、灵敏地检测出丙型副伤寒沙门菌和猪霍乱沙门菌。     

Preparation of Monoclonal Antibody and Development of Enzyme-linked Immunosorbent Assay Specific for Escherichia coil O157 in Foods

OBJECTIVE: To prepare monoclonal antibodies (MAb) and antisera specific for Escherichia coli (E. coli) O157, and to develop a sandwich enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) to detect E. coli O157 in foods. METHODS: Spleen cells from BALB/c mice immunized with the somatic antigen of E. coli O157:H7 were fused with murine Sp2/0 myeloma cells. The hybridoma cell line specific for E. coli O157 was established after having been subcloned. Antisera specific for E. coli O157 was prepared by intravenous injection into New Zealand rabbits with a stain of E. coli O157:H7. The sandwich ELISA was developed with the polyclonal antibody as the capture antibody and the MAb 3A5 as the detection antibody. The inoculated ground poultry meat and pasteurized milk were tested to confirm efficiency of the method. RESULTS: MAb 3A5 specific for E. coli O157 and O113:H21 belonged to subtype IgM. The ascetic titers of the antibody was 1:1x10(6). No cross-reactivity of the MAb was observed with strains of Salmonella spp, Yersinia enterocolitica, Shigella dysenteriae, etc. The purified polyclonal antibody had a titer of 1:1x10(5) with E. coli O157. The detection limit of this sandwich ELISA was 10(3)-10(4) cfu E. coli O157/mL in pure culture with a high specificity, which was characterized by every non-O157 strain with negative response. With 10h enrichment procedure, E. coli O157:H7 recovered well from inoculated ground poultry meat and pasteurized milk at levels of 0.1 cfu/g and 0.1 cfu/mL. CONCLUSION: MAb 3A5 specific for E. coli O157 and O113:H21 can be produced by immunizing BALB/c mice with a strain of E. coli O157:H7. Then a sandwich ELISA can be developed with the polyclonal antibody as the capture antibody and the MAb 3A5 as the detection antibody. The method is proved to be a sensitive and specific technique to detect low number of E. coli O157 in food.     

肠出血性大肠埃希菌O157：H7的分布及特征

目的了解H市外环境（食品、生活污水及菜地土壤）中肠出血性大肠埃希菌O157∶H7的分布与特性。方法用免疫磁珠富集法进行O157：H7分离;按《全国食品污染物监测相关实验室手册》（细菌学部分）及相关国家标准鉴定分离菌株;标准血清分型;PCR法测定菌株SLT1,SLT2,ereA,hly毒素基因;纸片琼脂扩散（K-B）法测定菌株耐药性。结果自H市外环境标本（食品、生活污水、菜地土壤）检出O157：H7共15株,检出率1.42%～4.34%,鸡肉与生活污水检出率高;农贸市场食物中O157：H7的检出率（2.25%）高于超市（0.56%）;它们中有93.33%（14/15）是携带SLT1、SLT2、eae、hly毒力基因的高致病菌株;食源性O157：H7耐药性严重,耐药菌株多,仅对哌拉西林、亚胺培南敏感。结论H市外环境有O157：H7分布,且检出的多是高致病性强毒菌株,应警惕其流行造成感染的潜在危险。     

网状分枝扩增技术快速检测大肠埃希菌O157∶H7及其他产志贺样毒素大肠埃希菌

目的：建立一种简便、快速、灵敏和特异的检测食品和临床标本中大肠埃希菌O157∶H7及其他产志贺样毒大肠埃希菌(STEC)的方法。方法：设计并合成了检测志贺毒素2(stx2)基因特异的环形探针和捕获探针，确定网状分枝扩增方法（RAM）的灵敏度；含有stx2基因的不同血清型的菌株包括O46∶H38、O22∶H8 、O111∶NM，用于RAM特异度的测定。用RAM检测所有分离的菌株，并进一步对瞬时RAM进行研究。结果：RAM最低能检测10个拷贝的stx2合成靶基因和临床分离的菌株，表明RAM与PCR具有一样的灵敏度。特异度的测定结果表明不同血清型的大肠埃希菌均为stx2阳性，而非致病性大肠埃希菌ATCC23716则为阴性。在32株菌株中，28株细菌含有stx2基因，其余则为阴性， 与PCR检测结果100%一致。瞬时RAM结果也表明最低能检测10个细菌，检测信号的出现依赖于样品的浓度。 结论：RAM的简便和等温扩增特点可替代PCR检测各种标本中大肠埃希菌O157∶H7和STEC。     

汕头市食源性致病菌及食源性疾病监测分析

目的 了解汕头市主要食品食源性致病菌污染状况及食源性疾病的发生情况，食品污染来源及其与食源性疾疾病发生的关系，以便能采取相应的预防与控制措施。方法 于2004～2006年每年夏秋季在集贸市场、超市采集样品进行致病菌监测，按国标方法对食品中的沙门菌、单核细胞增生李斯特菌、大肠杆菌0157：H7以及海产品中的副溶血性弧菌进行分离和鉴定。结果 采集5类样品共251份检出致病菌56份，总检出率为22．31％（56／251），其中，沙门菌检出率为1．99％（5／251），单核细胞增生李斯特菌检出率19．92％（50／251）、大肠杆菌O157：H7检出率为0．40％（1／251），海产品的副溶血性弧菌检出率高达41．93％（13／31）。结论 汕头市5类主要食品均受到食源性致病菌不同程度的污染。因此，应加强对各类食品食源性致病菌监测，并采取相应的预防和控制措施，以便防止食源性疾病的暴发。     

伤寒和甲、乙、丙型副伤寒沙门菌多重PCR及荧光PCR分型方法的建立与评价

目的建立伤寒和甲、乙、丙型副伤寒沙门菌的快速和特异的检测方法,用于沙门菌属内的分型鉴定。方法根据GenBank公布的伤寒和甲、乙、丙型副伤寒沙门菌的保守序列设计引物和改良分子信标探针,建立多重PCR检测方法和实时荧光PCR检测方法。结果采用所建立的多重PCR方法可分别检测到伤寒的3条特异性条带、甲型副伤寒沙门菌的2条特异性条带和丙型副伤寒沙门菌的1条特异性条带,但是乙型副伤寒沙门菌未出现特异性条带。建立的实时荧光PCR方法可以快速、特异、灵敏地检测出伤寒和甲、乙、丙型副伤寒沙门菌,纯DNA和菌液的最低检出限分别可达10 fg/reaction和20 CFU/reaction;对77株细菌的检测正确率达100%。结论建立的实时荧光PCR检测方法比多重PCR方法更能快速、特异、灵敏地检测伤寒和甲、乙、丙型副伤寒沙门菌。