小分子干扰RNA逆转胃癌SGC7901/VCR细胞mdr1介导的多药耐药

目的研究小分子干扰RNA（siRNA）逆转胃癌多药耐药细胞亚系SGC7901／VCR mdr1介导的多药耐药效应。方法根据mdr1cDNA已知序列，设计并体外转录2条含21个核苷酸的siRNA（mdr1si2631和mdr1si3071），转染SGC7901／VCR细胞，用RT-PCR检测mdr1基因mRNA的表达，免疫组织化学检测P-gp的表达，流式细胞仪检测阿霉素在细胞内的蓄积，MTT法检测细胞对阿霉素的敏感性。结果siRNA转染SGC7901／VCR细胞48h后，mdr1基因mRNA和P-gp的表达水平下降，细胞内阿霉素积累量增加，对阿霉素敏感性的相对逆转率各达79．59％及59．98％。结论siRNA可逆转SGC7901／VCR细胞mdr1介导的多药耐药。     

转染肿瘤坏死因子-α及MDR1反义RNA逆转乳腺癌多药耐药的研究

目的：转染肿瘤坏死因子-α(TNF-α)cDNA和多药耐药基因(MDR1)的反义RNA到乳腺癌耐药细胞株MCF-7/ADR中进行表达，并观察它们在乳腺癌耐药逆转中的作用。 方法：应用RT-PCR和DNA重组技术构建反义绿色荧光蛋白pEGFP-MDR1融合蛋白表达载体和红色荧光蛋白pDsRed2-TNF-α融合蛋白表达载体，分别和同时导入乳腺癌耐药细胞株MCF-7/ADR中进行表达，检测转染前后细胞的生长曲线、细胞凋亡程度、MDR1-mRNA和P糖蛋白（P-gp）表达情况及对ADR敏感性的变化。 结果：转染后的细胞生长明显减慢，凋亡率显著增加，MDR1-mRNA和P糖蛋白（P-gp）表达明显降低，对ADR的耐药性明显下降，敏感性增加。 结论：联合运用不同的逆转耐药机制，将TNF-α cDNA及MDR1反义RNA分别或同时导入乳腺癌耐药细胞中，能有效达到逆转耐药的目的。     

索拉非尼对耐药肝癌细胞株BEL-7402／FU逆转作用的研究

目的:研究索拉非尼对肝癌耐药细胞系BEL-7402/FU多药耐药性的逆转作用及可能机制.方法:采用流式细胞术检测罗丹明123(Rho123)的表达,免疫组化法观察细胞膜上P-gp的表达,荧光定量PCR法检测多药耐药基因mdr1 mRNA水平的变化,Western blot法检测mdr1基因蛋白产物P-gp表达水平的变化.结果:经4 μmol/L索拉非尼处理后,增加了BEL-7402/FU对Rho123的蓄积并减缓其外排作用,使细胞表面P-gp的表达明显下降,mdr1 mRNA较用药前下降了35.4%,并可明显抑制mdr1基因蛋白产物P-gp的表达水平,比BEL-7402/FU细胞减少14.3%.结论:索拉非尼可以抑制mdr1基因蛋白产物P-gp的表达,增加细胞内化疗药物的浓度,从而逆转了肝癌细胞的多药耐药性.     

转染肿瘤坏死因子-α及MDR1反义RNA逆转乳腺癌多药耐药的研究

目的:转染肿瘤坏死因子-α(TNF-α)cDNA和多药耐药基因(MDR1)的反义RNA到乳腺癌耐药细胞株MCF-7/ADR中进行表达,并观察它们在乳腺癌耐药逆转中的作用.方法:应用RT-PCR和DNA重组技术构建反义绿色荧光蛋白pEGFP-MDR1融合蛋白表达载体和红色荧光蛋白pDsRed2-TNF-α融合蛋白表达载体,分别和同时导入乳腺癌耐药细胞株MCF-7/ADR中进行表达,检测转染前后细胞的生长曲线、细胞凋亡程度、MDR1-mRNA和P糖蛋白(P-gp)表达情况及对ADR敏感性的变化.结果:转染后的细胞生长明显减慢,凋亡率显著增加,MDR1-mRNA和P糖蛋白(P-gp)表达明显降低,对ADR的耐药性明显下降,敏感性增加.结论:联合运用不同的逆转耐药机制,将TNF-αcDNA及MDR1反义RNA分别或同时导入乳腺癌耐药细胞中,能有效达到逆转耐药的目的.     

转染抗mdr-1核酶基因逆转肿瘤细胞耐药性的研究

目的　研究转染抗mdr 1核酶基因能否实现对乳腺癌细胞多药耐药 (MDR)的持久逆转。方法　构建增强型绿色荧光蛋白 (EGFP)为报告基因的核酶表达质粒并转染耐阿霉素的人乳腺癌细胞株MCF 7/ADR和敏感株MCF 7,激光共聚焦显微镜观察EGFP的表达 ,流式细胞术检测细胞转染率和P 糖蛋白含量 ,逆转录 (RT) 聚合酶链反应 (PCR)检测细胞的mdr1mRNA ,罗丹明 12 3(Rh12 3)外排实验检测细胞的P 糖蛋白转运功能。加入阿霉素 4 8h后 ,常规MTT法检测细胞存活率。结果　转染抗mdr 1核酶质粒RZ196和RZ179后 ,两组实验细胞的mdr 1指数由 2 2 0分别降为 0 76和 1 4 0 ,P 糖蛋白表达率由 5 5 0 %降为 4 6 %和 18 2 % ,Rh12 3荧光强度由 2 2 0 %升为 4 6 2 %和 70 1% ,细胞存活率由 75 %降为 2 8%和 4 3%。并且核酶质粒可在细胞内稳定表达 ,转染RZ196、RZ179的实验细胞经G4 18筛选完成 2个月后 ,细胞质中仍可见明显的EGFP表达 ,细胞的mdr 1指数分别为 0 81、4 17,P 糖蛋白表达率分别为 5 2 %、19 5 % ,Rh12 3荧光强度分别为 5 1 4 %、71 6 % ,与刚完成筛选时的差异无显著性 (P >0 0 5 )。结论　转染抗mdr 1核酶质粒RZ196和RZ179均可持久逆转肿瘤细胞MDR ,其中RZ196的逆转效果更好     

靶向MDR1基因的RNAi稳定逆转结肠癌细胞的多药耐药性

目的： 探讨靶向多药耐药蛋白-1 (MDR1)基因的RNA干扰（RNAi）对结肠癌细胞MDR1/P-gp依赖的多药耐药性的稳定逆转作用。方法：分别构建含编码#4029 MDR1 siRNA和#4123 MDR1 siRNA的质粒载体,并转染COLO 320DM结肠癌多药耐药细胞,采用G418筛选克隆细胞,经实时定量RT-PCR及Western blotting鉴定阳性克隆细胞。MTT法检测细胞活力并计算各抗肿瘤药的IC50。流式细胞术检测细胞周期并计算PI/AI值。流式细胞仪测定细胞内adriamycin药物累积浓度。结果：阳性克隆细胞（clone #4029和clone #4123）的MDR1 mRNA和P-gp的表达均被抑制。COLO 320DM结肠癌亲本细胞adriamycin及vincristine的IC50分别为9.616 μmol/L和0.358 μmol/L,而clone #4029的IC50分别降至1.094 μmol/L和0.023 μmol/L（P<0.01）,clone #4123的IC50分别降至0.780 μmol/L和0.035 μmol/L（P<0.01）。COLO 320DM结肠癌亲本细胞用adriamycin及vincristine处理后其PI/AI值分别为5.68及9.59,而clone #4029的PI/AI值分别降至2.74及3.59（P<0.01）,clone #4123的PI/AI值分别降至2.75及3.24（P<0.01）。COLO 320DM结肠癌亲本细胞用10 μmol/L adriamycin处理后细胞内adriamycin累积浓度为27.92,而clone #4029及clone #4123细胞内adriamycin累积浓度分别增加至187.24和215.57（P<0.01）。结论：稳定转染含编码MDR1 siRNA的质粒载体能稳定逆转结肠癌细胞MDR1/P-gp依赖的多药耐药性。     

反义寡聚脱氧核苷酸抑制卵巢癌细胞株SKOV3／mdr1中MDR1基因的表达

多药耐药基因（MDR1）编码的P－糖蛋白(Pgp,P-170)是导致卵巢癌化疗失败的重要因素之一。本研究将针对MDR1基因的硫代反义寡聚脱氧核苷酸导入卵巢癌耐药细胞株SKOV3/mdr1,观察其对该细胞株P170表达的影响。反义寡聚脱氧核苷酸（MDR1－AS）通过阳离子脂质体介导或单纯转染的方式导入SKOV3／mdr1 细胞,将正义寡聚脱氧核苷酸（MDR1－S)同样导入细胞为对照。经以脂质体介导的1．6μmol/L MDR1-AS转染后,Pgp阳性的细胞百分数从100％降至48．7％,经过16和10μmol／L两个浓度的单纯MDR1－AS转染后,Pgp阳性细胞的百分数也从100％分别降至52．6％和86．7％。同时,利用RT－PCR检测了MDR1mRNA水平的变化,以β-actin作为内对照,发现MDR1mRNA水平在MDR1－AS转染后降至内对照的60％左右,而用MDR1－S转染的细胞与SKOV3／mdr1细胞比无明显变化。所以导入MDR1基因硫代反义寡聚脱氧核苷酸可以部分抑制SKOV3／mdr1细胞中MDR1基因的表达。     

川芎嗪与环孢菌素A联合应用对转基因多药耐药细胞K562/MDR的逆转作用

目的研究中药川芎嗪(TMP)与环孢菌素A(CsA)联合应用对转基因多药耐药细胞K562/MDR的耐药性逆转作用及可能机制。方法应用非细胞毒性剂量的TMP和CsA单独及联合作用于K562/S和K562/MDR细胞,MTT法检测细胞对阿霉素(ADM)的药敏性,计算耐药倍数及逆转倍数。利用罗丹明123(Rh123)进行蓄积与排出试验,免疫组化检测P-gp的表达,RT-PCR方法检测MDR1基因的表达。结果与K562/S细胞相比,K562/MDR细胞的耐药倍数为19.2倍;TMP及CsA可显著降低ADM对K562/MDR细胞的IC50(P0.01),逆转倍数分别为4.9倍及9.2倍,两者联合应用,逆转倍数为15.4倍。TMP及CsA单独应用均能降低K562/MDR细胞P-gp的表达,联合应用使K562/MDR细胞P-gp的表达率明显低于单独应用(P0.01);TMP和CsA单独及联合应用,MDR1基因表达均有不同程度的下调。结论 TMP和CsA联合逆转K562/MDR细胞的多药耐药性具有协同作用,其机制可能与下调MDR1基因表达和降低P-gp水平有关     

阻断MDR1基因表达逆转结肠癌LoVo/5-Fu敏感性的研究

目的探讨沉默多药耐药基因MDR1逆转大肠癌耐药细胞株LoVo/5-Fu细胞对5-Fu的耐药性。方法实验分为3组,转染组(干扰质粒转染人大肠癌耐药细胞株LoVo/5-Fu细胞)、对照质粒组(转染无关质粒)和未转染对照组。构建靶向MDR1的短发夹RNA(shRNA-MDR1)重组质粒后,转染LoVo/5-Fu细胞,实时荧光定量PCR检测靶细胞MDR1基因表达抑制效果,MTT法检测LoVo/5-Fu细胞对5-Fu的敏感性,流式细胞仪检测细胞周期及细胞凋亡情况。平板克隆形成试验检测细胞克隆形成能力,免疫印迹法检测caspase-3及P-gp蛋白表达。结果与未转染组相比,转染组细胞MDR1 mRNA表达明显下调(P<0.05);细胞对5-Fu的IC50及RI显著降低(P<0.05),敏感性的相对逆转率为71.2%;细胞克隆形成率明显下降;G1期细胞数增加8.59%,S期的细胞数减少8.9%,G2/M期细胞数减少3.5%;细胞凋亡率增加9.2%(P值均<0.01)。caspase-3表达增高,P-gp蛋白降低。结论 shRNAMDR1可抑制大肠癌耐药细胞LoVo/5-Fu中MDR1的表达,从而改善了大肠癌耐药细胞对5-Fu的敏感性。     

Multifunctional QD-based co-delivery of siRNA and doxorubicin to HeLa cells for reversal of multidrug resistance and real-time tracking

Co-delivery of siRNA and chemotherapeutic agents has been developed to combat multidrug resistance in cancer therapy. Recently, we developed a series of quantum dots (QDs) functionalized by β-cyclodextrin (β-CD) coupled to amino acids, some of which can be used to facilitate the delivery of siRNA. In this study, two CdSe/ZnSe QDs modified with β-CD coupled to L-Arg or L-His were used to simultaneously deliver doxorubicin (Dox) and siRNA targeting the MDR1 gene to reverse the multidrug resistance of HeLa cells. In this co-delivery system, Dox was firstly encapsulated into the hydrophobic cavities of β-CD, resulting in bypass of P-glycoprotein (P-gp)-mediated drug efflux. After complex formation of the mdr1 siRNA with Dox-loaded QDs via electrostatic interaction, significant down-regulation of mdr1 mRNA levels and P-gp expression was achieved as shown by RT-PCR and Western blotting experiments, respectively. The number of apoptotic HeLa cells after treatment with the complexes substantially exceeded the number of apoptotic cells induced by free Dox only. The intrinsic fluorescence of the QDs provided an approach to track the system by laser confocal microscopy. These multifunctional QDs are promising vehicles for the co-delivery of nucleic acids and chemotherapeutics and for real-time tracking of treatment.     

CD3AK、LAK对KB、KBv200细胞株耐药逆转前后的杀伤作用

目的　探讨免疫活性细胞对肿瘤细胞的杀伤活性与mdr1的关系。方法　利用特异性切割mdr1的ribozyme为工具 ,以表达mdr1的耐药细胞株KBv2 0 0 为靶细胞 ,采用脂质体转染技术 ,将含ribozyme的质粒pHβApr 1neo/ 5mR3及空载体pHβApr 1neo导入KBv2 0 0 及其亲本KB细胞内 ,运用North ernblotting、免疫组化方法观察ribozyme对mdr1mRNA及P 170的影响 ,采用MTT法检测了CD3AK、LAK对KB、KBv2 0 0 细胞株耐药逆转前后杀伤活性的变化。结果　含ribozyme的质粒pHβApr 1neo/ 5mR3及空载体pHβApr 1neo可以在KB、KBv2 0 0 细胞中稳定表达 ,ribozyme可以特异性地切割mdr1,导致KBv2 0 0 / 5mR3的mdr1mRNA含量下降 ,P 170表达减低 ,LAK和CD3AK对KBv2 0 0 的杀伤活性较对KB的强 ,MDR逆转后杀伤活性降至敏感株水平 ,LAK和CD3AK对KB/ 5mR3、KB/vec、KBv2 0 0 /vec的杀伤活性也较KB及KBv2 0 0 / 5mR3强。结论　mdr1 ribozyme在细胞内具有一定的逆转肿瘤多药抗性的生物学效应 ,LAK和CD3AK对MDR肿瘤细胞的杀伤活性与P糖蛋白表达相关     

CD44+CD24-/low乳腺癌干细胞活性与多药耐药的相关性

BACKGROUND:Tumor stem cells are found to be involved in the recurrence, metastasis and drug resistance of the tumor. OBJECTIVE:To explore the relationship between cell activity and multidrug resistance of CD44⁺CD24^-/low breast cancer stem cells. METHODS: CD44⁺CD24^-/low breast cancer stem cells sorted from multidrug resistant breast cancer cell line MCF-7/ADR were detected as percentage using flow cytometry. P-gp fluorescence intensity of the cell membrane and MDR mRNA expression in sorted cells and MCF-7/ADR were detected using flow cytometry and RT-PCR, respectively. RESULTS AND CONCLUSION:After sorting by flow cytometry, the proportion of CD44⁺CD24^-/low breast cancer stem cells was more than 90%, indicating that the sorted cells could meet the needs of the subsequent experiment. CD44⁺CD24^-/low cell subsets exhibited stronger ability to form microspheres than non- CD44⁺CD24^-/low cell subsets. The P-gp fluorescence intensity and MDR mRNA expression of CD44⁺CD24^-/low cells were significantly higher than those of MFC-7/ADR cell line (P < 0.05). These experimental findings suggest that CD44⁺CD24^-/low breast cancer stem cells sorted from MCF-7/ADR cell lines have a strong ability to form cell microspheres in vitro, and significantly raise the level of P-gp protein and MDR mRNA expression, which may be one of the causes of multidrug resistance.     

FG020318对视网膜母细胞瘤细胞系SO-Rb50多药耐药的逆转作用

目的： 研究2-［4-（2-嘧啶-2-乙烯基）-苯基］-4，5-双丙稀酰胺-（4，N,N-二乙胺苯基）-1（H）-咪唑(FG020318)对视网膜母细胞瘤耐药细胞株SO-Rb50/VCR的逆转作用。方法： 通过体外浓度递增法诱导建立耐长春新碱细胞株SO-Rb50/VCR，采用MTT药敏试验及流式细胞术测定细胞内罗丹明123浓度的方法研究FG020318和环孢霉素A对耐药株多药耐药的逆转作用。结果： FG020318（2.5 μmol/L）即可明显降低SO-Rb50/VCR的半数致死有效浓度（IC50）值和增加多药耐药(MDR)细胞内罗丹明123的浓度，且上述作用随浓度的增加而增强。在相同浓度时，FG020318对SO-Rb50/VCR的逆转倍数要高于环孢霉素。结论： 一种新的肿瘤耐药逆转剂 FG020318可部分逆转耐药细胞株SO-Rb50/VCR的耐药性，可能是一种很有希望的逆转MDR的新药。     

SFRP5基因甲基化通过激活Wnt/β-catenin通路调节白血病细胞MDR1/P-gp的表达

 目的:研究分泌型卷曲相关蛋白5（SFRP5）基因甲基化对耐药白血病细胞多药耐药蛋白1/P-糖蛋白（MDR1/P-gp）表达的调节及其可能的信号通路。方法:采用甲基化特异性PCR（MSP）检测白血病患者及白血病细胞系中SFRP5基因启动子区甲基化状态。采用Western blotting检测非磷酸化β-catenin（NP-β-catenin）在SFRP5基因甲基化白血病患者及细胞系中表达。使用去甲基化试剂5-氮杂-2′-脱氧胞嘧啶（DAC）恢复SFRP5表达,采用RT-PCR和real-time PCR检测处理前后MDR1 mRNA表达,采用Western blotting检测P-gp表达。结果:5/12例白血病患者标本及4种白血病细胞系存在SFRP5基因完全甲基化。在5例患者标本中,有3例（L2、L7和L8）NP-β-catenin水平高于其它标本,在4种白血病细胞系中,KG1a中NP-β-catenin水平高于另外3个细胞系。存在NP-β-catenin高水平表达的3例患者（L2、L7和L8）中检出MDR1 mRNA及P-gp表达。在4种细胞系中,KG1a存在MDR1 mRNA及P-gp表达。使用去甲基化试剂DAC处理L2、L7、L8患者标本和KG1a细胞,恢复SFRP5表达,L2、L7、L8和KG1a中MDR1 mRNA水平均显著下降（P<0.01）,P-gp表达水平亦被下调。结论: SFRP5基因甲基化可导致Wnt/β-catenin信号通路被激活,活化的β-catenin激活下游靶基因MDR1转录,编码的药物外排泵P-gp表达增加,促进白血病多药耐药的形成。