ABC转运蛋白BcAtm1参与灰葡萄孢分生孢子萌发及对寄主植物的侵染

 灰葡萄孢 (Botrytis cinerea)引起的灰霉病可在200多种植物上发生,每年造成全世界高达近千亿美元的损失。Atm1是一种在真核生物中进化保守的线粒体内膜ABC转运蛋白,主要通过向细胞质转运Fe/S簇参与维持细胞的正常生命活动,但Atm1在病原菌致病过程中的作用至今仍不清楚。本研究筛选到一株灰葡萄孢ATM1被T-DNA标记的致病缺陷突变体,并在野生型中对该基因实施了敲除。表型分析发现,突变体ΔBcatm1的分生孢子萌发缓慢且不同步,培养4 h的萌发率只有10%(野生型超过90%),直到12 h,萌发率才接近90%;突变体菌丝生长速度减慢,只能达到野生型水平的67%;菜豆成熟叶片离体接种实验显示,突变体ΔBcatm1基本丧失了致病能力,侵入寄主后只能在接种点附近引发微小的病斑,病斑面积只能达到野生型的10%左右。将完整的BcATM1基因重新导入突变体ΔBcatm1可以完全或部分恢复上述异常表型。本研究结果表明BcATM1是一个关键的致病相关基因,参与了灰葡萄孢分生孢子的萌发、菌丝生长及侵染寄主等过程。     

一个编码富含丝氨酸蛋白的基因影响大丽轮枝菌的微菌核形成、产孢及致病力

 大丽轮枝菌是一种可在广泛的寄主范围内引发黄萎病的土传植物病原真菌,主要以微菌核的形式在土壤中存活多年,因此鉴定与微菌核形成及致病力相关的基因对防治该病害至关重要。本课题组从前期构建的棉花黄萎病菌T-DNA插入突变体库中筛选到一个微菌核明显减少的突变体,致病力测定结果表明,该突变体致病力明显下降。以棉花黄萎病菌野生型菌株V592的基因组DNA为模板,从棉花黄萎病菌中克隆到被T-DNA插入突变的基因(VdSRP1)编码区全长为415 bp,包含一个外显子,编码一个富含丝氨酸蛋白,与任何已知的注释基因没有显著的序列相似性。为了明确VdSRP1基因在大丽轮枝菌中的功能,利用同源重组的原理及农杆菌介导的遗传转化方法获得了VdSRP1基因的2个敲除体菌株,与棉花黄萎病菌野生型菌株V592相比,VdSRP1基因敲除突变体的微菌核形成明显减少,产孢量及孢子萌发率下降,对棉花的毒力也显著下降。对野生型菌株V592及VdSRP1敲除突变体的转录分析表明,VdSRP1调控一系列与微菌核形成、孢子形成及致病力相关基因的表达。这些结果表明,VdSRP1基因影响大丽轮枝菌的致病力、微菌核形成、产孢及孢子萌发。     

灰葡萄孢BcPDR1基因与PKA编码基因的关系研究

 为明确灰葡萄孢BcPDR1基因与病菌cAMP信号途径中PKA编码基因BcPKA1、BcPKA2、BcPKAR之间的关系,利用Real-time PCR技术分析了BcPDR1基因突变对PKA编码基因BcPKA1、BcPKA2、BcPKAR表达的影响,以及PKA编码基因突变对BcPDR1基因表达的影响。结果发现,BcPDR1基因突变体中BcPKA1、BcPKA2、BcPKAR的表达水平均显著高于野生型和回复菌株,BcPKA1、BcPKA2、BcPKAR基因的RNAi突变体中BcPDR1基因表达水平显著低于野生型。我们分别构建了PKA编码基因BcPKA1、BcPKA2、BcPKAR在敲除突变体ΔBcpdr1中过表达的菌株ΔBcpdr1/BcPKA1-OE、ΔBcpdr1/BcPKA2-OE、ΔBcpdr1/BcPKAR-OE;对过表达菌株的表型和致病力进行分析发现,过表达菌株的菌落形态、菌核形成、菌丝形态、生长速率、产孢量和致病力均与突变体ΔBcpdr1表现显著的差异,而更接近野生型BC22的表型和致病力。结果表明,灰葡萄孢BcPDR1基因与PKA亚基基因BcPKA1、BcPKA2和BcPKAR的表达水平密切相关,BcPDR1基因负调控这3个基因的表达,而这3个基因对BcPDR1基因表达有正调控作用。本研究为进一步阐明灰葡萄孢BcPDR1基因调控病菌生长发育和致病力的分子机制奠定了基础。     

一个编码富含丝氨酸蛋白的基因影响大丽轮枝菌的微菌核形成、产孢及致病力

 大丽轮枝菌是一种可在广泛的寄主范围内引发黄萎病的土传植物病原真菌,主要以微菌核的形式在土壤中存活多年,因此鉴定与微菌核形成及致病力相关的基因对防治该病害至关重要。本课题组从前期构建的棉花黄萎病菌T-DNA插入突变体库中筛选到一个微菌核明显减少的突变体,致病力测定结果表明,该突变体致病力明显下降。以棉花黄萎病菌野生型菌株V592的基因组DNA为模板,从棉花黄萎病菌中克隆到被T-DNA插入突变的基因(VdSRP1)编码区全长为415 bp,包含一个外显子,编码一个富含丝氨酸蛋白,与任何已知的注释基因没有显著的序列相似性。为了明确VdSRP1基因在大丽轮枝菌中的功能,利用同源重组的原理及农杆菌介导的遗传转化方法获得了VdSRP1基因的2个敲除体菌株,与棉花黄萎病菌野生型菌株V592相比,VdSRP1基因敲除突变体的微菌核形成明显减少,产孢量及孢子萌发率下降,对棉花的毒力也显著下降。对野生型菌株V592及VdSRP1敲除突变体的转录分析表明,VdSRP1调控一系列与微菌核形成、孢子形成及致病力相关基因的表达。这些结果表明,VdSRP1基因影响大丽轮枝菌的致病力、微菌核形成、产孢及孢子萌发。     

禾谷镰刀菌脂质转运蛋白Vps13的功能分析

 Vps13蛋白家族是真核生物中高度保守的一类脂质转运蛋白,其在丝状真菌中的功能尚不清楚。小麦赤霉病主要由禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)引起,是小麦最重要病害之一。禾谷镰刀菌含有酿酒酵母VPS13的一个同源基因FgVPS13。通过同源重组的方法获得禾谷镰刀菌FgVPS13敲除突变体。研究表明,FgVPS13敲除突变体出现生长、产孢和有性生殖的缺陷。FgVPS13敲除突变体在小麦胚芽鞘和麦穗上的致病力下降,产生的脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol, DON)毒素含量也明显降低。而且,FgVPS13抑制线粒体自噬。总之,FgVPS13参与调控禾谷镰刀菌菌丝生长、无性和有性生殖、致病力和线粒体自噬。     

核转运蛋白SsKapM涉及调控甘蔗鞭孢堆黑粉菌的菌丝生长

 核转运蛋白是真核生物中负责大分子物质进出核孔的重要载体,承担着维持正常生命活动的任务。本研究通过序列同源比对鉴定了甘蔗鞭孢堆黑粉菌核转运蛋白编码基因,根据注释命名为SsKapM。使用同源重组方法对SsKapM进行敲除后,发现ΔSsKapM突变体担孢子的生长速率、适宜的生长温度、有性配合/菌丝生长等方面均发生改变。研究中还发现SsKapM缺失会导致双核菌丝体对高浓度磷酸盐敏感性下降。同时,通过转录组数据分析探究SsKapM的功能机制。结果表明SsKapM调控热激反应、磷酸盐信号与转运通路等基因的表达。这一发现将为甘蔗鞭孢堆黑粉菌的防治提供新的思路。     

N-(2,4,5-三氯苯基)-2-氧代环己烷基磺酰胺对灰葡萄孢的抑制作用

研究了新型环烷基磺酰胺类化合物N-(2,4,5-三氯苯基)-2-氧代环己烷基磺酰胺(简称化合物108)对灰葡萄孢菌丝生长、孢子形成和萌发以及菌核产生等不同生育阶段的抑制作用及其对菌丝致病力和形态结构的影响。结果表明:化合物108对灰葡萄孢菌丝生长和孢子形成及孢子萌发具有明显的抑制作用,其EC50值分别为6.90、4.70和4.11μg/mL;菌核形成受到明显抑制,当药剂质量浓度达20μg/mL时,无菌核产生。经化合物108处理后的灰葡萄孢菌丝致病力下降,40μg/mL处理的菌丝致病力显著低于对照。超微结构观察结果表明,化合物108能导致灰葡萄孢菌丝萎缩、塌陷和变形,菌体细胞壁增厚、皱缩及分层。     

FocVel2基因对黄瓜枯萎病菌丝生长及毒力的影响

 由尖孢镰孢菌黄瓜专化型引起的黄瓜枯萎病是世界黄瓜生产上的一种毁灭性病害。本研究鉴定了尖孢镰孢菌黄瓜专化型丝绒蛋白的一个同源基因FocVel2,利用基因敲除和互补的方法研究该基因的功能。敲除突变体菌株ΔFocVel2出现明显的表型变化,包括菌落生长速率降低和产孢量降低,并且敲除突变株对黄瓜幼苗毒力明显减弱,回补突变体菌株能够恢复敲除突变体ΔFocVel2的所有缺陷。总之,研究结果发现丝绒蛋白基因FocVel2在菌体无性繁殖以及侵染过程中起到重要作用。     

FocVel2基因对黄瓜枯萎病菌丝生长及毒力的影响

 由尖孢镰孢菌黄瓜专化型引起的黄瓜枯萎病是世界黄瓜生产上的一种毁灭性病害。本研究鉴定了尖孢镰孢菌黄瓜专化型丝绒蛋白的一个同源基因FocVel2,利用基因敲除和互补的方法研究该基因的功能。敲除突变体菌株ΔFocVel2出现明显的表型变化,包括菌落生长速率降低和产孢量降低,并且敲除突变株对黄瓜幼苗毒力明显减弱,回补突变体菌株能够恢复敲除突变体ΔFocVel2的所有缺陷。总之,研究结果发现丝绒蛋白基因FocVel2在菌体无性繁殖以及侵染过程中起到重要作用。     

草莓多主棒孢霉小柱孢酮脱水酶基因CcSCD1的功能研究

 多主棒孢霉(Corynespora cassiicola)是世界范围内重要的植物病原真菌,其引起的草莓棒孢霉叶斑病对草莓产业的健康发展具有潜在威胁。小柱孢酮脱水酶(scytalone dehydratase,SCD)是真菌多聚二羟萘类(DHN)黑色素生物合成途径中的关键酶,在植物病原菌致病过程中发挥重要作用。本研究通过同源重组的方法获得了草莓多主棒孢霉小柱孢酮脱水酶基因(CcSCD1)的敲除突变体,并进行了回补和RT-PCR验证。与野生型相比,敲除突变体△CcSCD1-2表现为菌落无色素沉积、菌丝稀疏、产孢量显著下降、分生孢子无色较小以及致病力明显减弱。结果表明,CcSCD1参与调控多主棒孢霉的黑色素生物合成、营养生长、分生孢子产量及致病力。     

MrXrn1基因参与调控罗伯茨绿僵菌的产孢和致病

本研究以罗伯茨绿僵菌为研究对象,针对5'-3'核糖核酸外切酶基因（MrXrn1,MAA_09154,5'-3'exoribonuclease 1）,利用农杆菌介导的同源重组方法进行基因敲除。对获得的MrXrn1基因敲除株（ΔMrXrn1）与野生型进行表型分析结果发现,与野生型相比,ΔMrXrn1的营养生长无明显变化,而产孢能力显著下降,其中产孢量降低了75.75%;以大蜡螟为试虫的体壁侵染毒力分析显示ΔMrXrn1的毒力显著减少,也即半致死时间（LT₅₀：9.16 d）显著长于野生型的（5.96 d）,但注射接种情况下不同菌株的毒力无差异;进一步的研究表明ΔMrXrn1的附着孢形成率降低了43.58%。这些结果说明MrXrn1基因对绿僵菌的产孢及毒力起着重要的调控作用。本研究为进一步有效提高真菌杀虫剂的生防效果提供了基础。     

生长调节剂对球孢白僵菌产孢和分生孢子性能的影响

球孢白僵菌在农林害虫生物防治中发挥着重要的作用,发酵周期和产孢量是其发酵工艺中的主要评价指标。本试验研究了生长调节剂对球孢白僵菌JG-17菌株产孢的促进作用。结果表明,通过外源法在菌落表层施用微量乙烯利,可以明显提高菌株JG-17的产孢量,以对8日菌龄表层施用100 ng/cm²乙烯利处理最佳,产孢量为未处理对照的6.28倍。经乙烯利处理后形成的分生孢子,其耐热性、抗紫外线能力和对靶标害虫的杀虫活性与未处理对照没有显著性差异。在白僵菌培养过程中科学施用乙烯利,可有效提高白僵菌的产孢效率,研究为真菌生物农药工业化生产的效率提升提供了新的思路。     

禾谷镰刀菌蛋白激酶FgSid1的功能研究

 实验室前期已经对禾谷镰刀菌中116个蛋白激酶进行了鉴定,发现FgSID1基因(FGSG_07344)敲除突变体在有性生殖过程中存在严重缺陷,但其在禾谷镰刀菌中的具体功能却未被详细报道。本研究通过表型分析和亚细胞定位等实验明确了FgSid1在营养生长、有性发育和致病性等方面的功能。本研究发现FgSID1基因敲除突变体菌落生长速度显著变慢,分生孢子隔膜数量减少且产孢量下降;在有性生殖阶段,FgSID1基因敲除突变体的子囊壳形态和大小均正常,但子囊畸形且子囊孢子形成有缺陷;此外,FgSID1基因敲除突变体只能侵染接种小花,而无法扩展到穗轴及临近的小穗,且接种点的小麦籽粒DON毒素含量显著下降;研究还发现FgSID1基因敲除突变体的分生孢子、营养菌丝和子囊孢子的分隔中均含有多个细胞核;本研究又通过亚细胞定位实验发现FgSid1定位于微管组织中心。因此,蛋白激酶FgSid1可能通过参与禾谷镰刀菌无性和有性阶段的细胞分裂影响禾谷镰刀菌的营养生长、分生孢子和子囊孢子的发育以及侵染能力。     

苹果斑点落叶病菌对戊唑醇敏感基线建立及抗性突变体适合度

本研究测定了苹果斑点落叶病菌对戊唑醇的敏感性,并建立了敏感基线;在此基础上,室内筛选获得了9株抗戊唑醇突变体,对其适合度进行了测定,为指导戊唑醇防治苹果斑点落叶病提供理论依据。在山西省5个地市未使用过戊唑醇及同类药剂的果园中采集分离得到64株苹果斑点落叶病菌,敏感性测定结果表明,其EC50值在0.768 7~2.673 8μg·mL~(-1)之间,平均值为1.622 4±0.558 2μg·mL~(-1),呈连续性单峰曲线,可作为苹果斑点落叶病菌对戊唑醇的相对敏感基线。通过紫外线(UV)诱导获得低抗突变体6株,药剂驯化获得中抗突变体3株。2株中抗突变体抗药性可稳定遗传;低抗突变体在无药剂胁迫时,药剂敏感性上升。抗性突变体适合度测定结果显示,突变体菌丝生长速率、产孢量、孢子萌发率及分生孢子竞争力均低于敏感菌株。突变体在无药情况下致病力比敏感菌株弱。     

FpStuA参与假禾谷镰孢的产孢和致病性

 假禾谷镰孢是一种土传真菌,其引起的小麦茎基腐病已成为威胁我国小麦生产的重要病害。APSES蛋白是真菌中保守存在的一类转录因子,参与多种细胞生理过程。本研究,我们在假禾谷镰孢中鉴定到StuA同源蛋白FpStuA。qRT-PCR分析发现FpStuA在假禾谷镰孢分生孢子和侵染阶段诱导表达。通过PEG介导的原生质体转化方法获得3个FpStuA基因缺失的突变体。与假禾谷镰孢野生型菌株相比,Δfpstua突变体的生长速度明显减慢,气生菌丝减少;分生孢子的产生比野生型减少70%,且Δfpstua突变体分生孢子变短、分隔减少;Δfpstua突变体对大麦叶片、小麦胚芽鞘和小麦根的致病性均显著降低,脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)合成明显减少。综上结果,转录因子FpStuA对假禾谷镰孢的生长、产孢和致病性都非常重要。     

哈茨木霉C2H2型转录因子Tha09974功能研究

哈茨木霉Th33菌株能拮抗多种植物病原真菌,具有重要的研究和应用价值。实验室前期研究了哈茨木霉Th33 Gα蛋白基因Thga1的功能,发现Thga1敲除突变株的分生孢子梗和分生孢子量显著减少。对该敲除株和Th33进行转录组测序,发现共有29个转录因子发生显著差异表达。本文选取差异表达量最大的C2H2型转录因子基因Tha09974进行功能研究。构建了Tha09974敲除突变株Δ9974及其回复突变株R9974,对野生菌Th33、Δ9974和R9974分别进行了生长、产孢及拮抗特性检测。结果显示,与野生菌Th33相比,Δ9974的菌落生长速度没有显著差异,菌丝生物量降低了51.5%,产孢量降低了73.6%;Δ9974较野生菌Th33对番茄灰霉病菌Botrytis cinerea Pers.和黄瓜枯萎病菌Fusarium oxysporum f.sp.cucumerinum的生长抑制率分别降低了41.67%和45.15%。R9974和Th33的生长速度、生物量、产孢量及对番茄灰霉病菌的抑制率没有显著差异,对黄瓜枯萎病菌的抑制率低于野生菌Th33,但高于Δ9974。以上结果说明,Tha09974能够正调控Th33的生长、产孢和对病原菌的拮抗能力,并受到Thga1的正调控。本研究为进一步揭示木霉菌的产孢调控机制奠定了基础。