组织块法培养成年兔肌腱细胞

背景:体外分离培养肌腱细胞,熟悉其生物学特性是研究肌腱愈合机制、改善肌腱愈合内环境的前提和基础。目的:采用组织块法体外培养成年兔肌腱细胞,观察其细胞形态、生长增殖情况以及Ⅰ型、Ⅲ型胶原蛋白的表达。方法:无菌条件下取成年新西兰白兔双侧后肢趾屈肌腱,手术显微镜下剥离、去除肌腱外膜组织,剪成组织小块,0.25%胰蛋白酶和0.1%胶原酶Ⅰ消化10～15min,离心去上清,将组织小块转移到培养瓶中,贴壁后加入1mL培养液,待细胞游出贴壁生长时,再加培养液继续培养,每3d换液1次,当细胞长到80%～90%融合时按1:3传代。结果与结论:一般10d左右细胞会从组织块游出贴壁生长,此时细胞多呈星形或不规则形,随着时间延长细胞逐渐增多,呈梭形的成纤维细胞样。传代细胞刚接种时圆形,4～6h开始贴壁并伸展为梭形,排列逐渐规则成群。从传代细胞的生长曲线可看出,前4d细胞生长较慢,为潜伏期,第5天后进入快速增殖期,7d以后进入平台期。免疫荧光法证实Ⅰ型胶原染色阳性,而Ⅲ型胶原染色呈阴性。结果表明采用组织块法可在体外成功培养成年兔肌腱细胞。     

本期特稿：组织构建中的细胞培养

5 组织块培养法和酶消化法分离髌韧带细胞的比较 沈晓涛（暨南大学，再生医学教育部重点实验室，再生医学香港中文大学暨南大学联合实验室，科技部及广东省科技厅国际科技合作基地，生物医学工程系广东省广州市510632）     

髌韧带断裂修复与重建治疗体会

目的探讨髌韧带断裂手术修复方法.方法对收治的12例新鲜性和陈旧性髌韧带断裂患者采用手术治疗并进行分析.结果12例患者均采用钢丝减张一期手术完成修复与重建,随访6月至1年,功能恢复良好.结论髌韧带断裂可在钢丝减张下一期完成修复与重建,新鲜性断裂需尽早直接对端缝合,若碎裂、缺损或陈旧性断裂需行半腱肌腱、髂胫束条重建.无需术前行髌骨牵引,手术操作简单,效果满意.     

体外培养人黄韧带细胞系的建立及细胞学特性分析

目的为研究黄韧带骨化致椎管狭窄的机制打下基础.方法通过体外组织块培养的方法,建立起正常、退化和骨化黄韧带的细胞系共18株,对细胞的生长特点进行了初步分析.结果培养的黄韧带细胞可以在体外增殖和传代,细胞呈现多种形态,以梭形为主,特别是退变和骨化患者的韧带细胞可形成钙化结节.结论首次成功的培养出黄韧带细胞,为深入研究黄韧带骨化的相关机制提供一种有力的手段.     

成人成骨细胞骨髓培养法与组织块培养法的对比

目的:观察成人成骨细胞在两种不同培养方法下的增殖、分化、成骨能力以及细胞形态学方面的差异,探讨成人成骨细胞培养的更为便捷有效的方法。方法:实验于2006-03/10在南京大学附属鼓楼医院科研部完成。①实验分组:分为两组。一组取前后交叉韧带断裂患者关节镜下重建术修整髌韧带时残留的松质骨块;另一组抽取同一患者骨髓进行成骨细胞原代培养,患者均知情同意。②实验方法:在相同的培养条件下,对松质骨块及骨髓分别用组织植块培养及骨髓培养法进行成骨细胞原代培养。③实验评估:倒置相差显微镜观察记录原代成骨细胞的形态学变化,改良钙钴法染色计算两组碱性磷酸酶染色阳性细胞数及其百分比;分别在第2,3,4,5,6天以四甲基偶氮唑盐比色法绘制细胞增殖曲线,磷酸对硝基苯酯二钠盐法测定碱性磷酸酶含量并检测成骨细胞的增殖、分化活性;以VonKossa染色比较成骨细胞成骨能力。结果:①细胞形态学观察结果:倒置相差显微镜观察证实成骨细胞组织块培养法与骨髓培养法培养出的成骨细胞在形态上无明显差异。②碱性磷酸酶染色后阳性细胞的表达:组织块培养法成骨细胞纯度为(90±6)%,高于骨髓培养法(68±10)%。③成骨细胞增殖、分化活性的测定:四甲基偶氮唑盐比色法培养第3天后可见细胞增殖趋势发生明显变化,组织块法的增殖优于骨髓培养法;碱性磷酸酶检测表明在细胞分化方面,骨髓培养法优于组织块培养法。④成骨细胞的成骨能力:VonKossa钙结节染色证实骨髓培养法与组织块培养法形成的钙结节数量分别为(8±6)个/视野及(12±3)个/视野,无显著差异。结论:骨髓培养法与组织块培养法各有优点与不足,需根据具体实验要求确定相应的培养方法。     

第一鳃弓外胚间充质细胞体外培养模型的构建

背景:在牙颌面的发育形成过程中,第一鳃弓作为过渡结构,发挥着不可替代的重要作用.目前,国内外对于第一鳃弓外胚间充质细胞的研究资料相对较少.目的:分离培养小鼠第一鳃弓外胚间充质细胞.方法:显微解剖E9.5胎鼠第一鳃弓,采用组织块法和酶消化法对其进行原代培养,通过细胞形态观察、细胞生长曲线描记、计算细胞倍增时间和特异性标记物检测对其细胞生物学特性进行研究.结果与结论:组织块法原代培养细胞的时间7～10 d,上皮细胞成分较多,酶消化法原代培养细胞时间两三天,上皮细胞成分较少,两组细胞传代后细胞形态、细胞生长曲线、群体倍增时间无明显差异.特异性标记物CD57/HNK1、波形丝蛋白免疫细胞化学染色呈均一表达.提示采用酶消化法可以在短时间内获得数量充足、纯度较高、满足实验要求的细胞.     

生物型人工韧带的制备及体外检测

背景:目前临床上修复膝关节叉韧带断裂的材料有自体膑腱(BTB)、自体半腱肌和股薄肌,以及同种异体组织移植等,但这些方法都存在一定的局限性.因此,人们研制人工韧带希望能够代替自体和异体移植.目的:探讨以猪肌腱韧带为原料经新的组织处理技术构建生物型人工韧带的可行性.设计:新型生物材料试验.单位:中山大学附属第三医院骨科.材料:肌腱韧带的来源成年猪由中山大学动物中心提供,雌雄不拘.S-520型扫描电镜为日本日立公司产品;LWK-10B微控电子拉力试验机为广州实验设备厂产品.方法:实验于2004-01/2005-06在中山大学动物中心完成.以猪肌腱韧带为原料应用环氧化物作为交联剂加上专门的除抗原技术及蛋白修饰技术制作生物型人工韧带.将来源于6周龄山羊的骨髓基质细胞体外培养后,移植于人工韧带支架中培养3周,应用扫描电镜观察人工韧带形态结构及细胞相容性;应用力学测试分析生物型人工韧带的生物力学特点.主要观察指标:人工韧带形态结构、细胞相容性的生物力学特点.结果: ①人工韧带的形态结构:生物型人工韧带的外观与正常肌腱外观相似.组织学检查显示韧带为无细胞的胶原纤维.电镜检查显示韧带为走向一致的发状纤维样物紧密平行排列,表面有棉絮样物附着,未见细胞.②人工韧带细胞相容性:扫描电镜观察,异种骨髓基质细胞于支架中培养3周后,细胞呈球形黏附在韧带材料表面及孔隙侧壁,并可见细胞分泌的基质沉积于细胞周围,但基质分泌量较少.③力学测试结果:人工韧带直径约5 mm,最大拉力为927.19 N,抗拉强度47.22 N/mm,速度100 mm/min,而正常山羊的ACL直径约5 mm,最大拉力为807.50 N,抗拉强度41.13 N/mm. 结论:应用新的组织处理技术研制的生物型人工韧带有效地去除了猪肌腱异种蛋白的免疫原性,具有良好的生物力学特性和细胞相容性;有望成为生物性人工韧带的理想产品.     

改良酶消化联合植块法培养兔骨膜成骨细胞

背景:骨膜成骨细胞具有很强的增殖能力和分化成骨潜能,而且取材方便,但以往常规培养方法时间较长,如伺能够缩短培养时间,是骨膜源性成骨细胞成为理想种子细胞的关键之一.目的:应用改良酶消化法培养兔骨膜原代成骨细胞,观察其在喷砂钛片上的黏附及增殖情况.方法:切取雄性日本大耳白兔胫骨近端前内侧面骨膜0.5～1.0 cm~2:①常规方法:以0.25%胰蛋白酶在37℃消化30 min后,用0.1%Ⅰ型胶原酶在37℃消化30 min,不断振荡,弃掉胰蛋白酶后植入培养瓶,干涸培养2 h,加入含体积分数15%胎牛血清的DMEM完全培养基培养.②改良方法:将Ⅰ型胶原酶消化时间由30 min改为1 h.碱性磷酸酶染色、钙结节染色鉴定成骨细胞.将原代培养成骨细胞与喷砂钛片联合培养,采用扫描电镜、MTT法检测不同时间点成骨细胞在喷砂处理钛片上的黏附及增殖情况.结果与结论:培养第5天,改良法培养的骨膜成骨细胞从组织块周围爬出,第25天细胞汇聚成单层,细胞呈三角形或多角形;传代培养1个月后,可见细胞成复层生长,并有黑色钙结节生成,具有典型的成骨细胞形态特征,碱性磷酸酶染色、钙结节染色呈阳性.常规法培养的细胞爬满单层时间推迟12 d左右.在喷砂处理的钛片表面上成骨细胞立体感强,有伪足伸出,伪足嵌入小的孔洞内,细胞表面有基质分泌.两种方法培养的成骨细胞在钛片表面的黏附及增殖差异无显著性意义.提示改良消化法可明显缩短成骨细胞培养时间,对成骨细胞的黏附及增殖能力无影响.     

人增生性瘢痕成纤维细胞的改良培养和鉴定

目的:探讨并建立一种简便易行、培养周期短的成纤维细胞改良培养方法.方法:采用组织块贴壁结合胰蛋白酶消化法体外分离培养人增生性瘢痕成纤维细胞.倒置相差显微镜下观察培养的成纤维细胞形态,进行细胞鉴定,作生长曲线观察细胞增殖能力.结果:采用组织块贴壁结合胰蛋白酶消化法体外分离人增生性瘢痕成纤维细胞,细胞培养周期短.分离培养的成纤维细胞波形蛋白呈阳性表达.传代培养的成纤维细胞增殖能力强.结论:采用组织块贴壁结合胰蛋白酶消化法体外分离培养法可以较快、较好地获得稳定培养的增生性瘢痕成纤维细胞,为其形成机制及防治研究提供实验基础.     

小鼠睾丸间质细胞体外原代培养方法的建立

背景:组织块培养睾丸生殖细胞对污染不容易控制,胰蛋白酶消化接种培养睾丸生殖细胞可能损伤细胞.目的:建立一种切实可行的小鼠睾丸间质细胞体外原代培养方法.方法:小鼠睾丸间质细胞的分离采用胶原酶消化法,纯化采用Percoll 等密度梯度离心法,活率鉴定采用锥虫蓝拒染法,纯度鉴定采用3.-羟基固醇脱氢酶染色方法.结果与结论:小鼠睾丸间质细胞纯度达可达90%以上;体外培养的细胞形态完整、增殖速度快、贴壁生长状态良好.说明实验成功建立了小鼠睾丸间质细胞的体外原代培养模型.