胰岛素对血管平滑肌细胞4E结合蛋白1和核糖体蛋白S6激酶磷酸化的刺激作用

目的研究胰岛素对血管平滑肌细胞(VSMC)蛋白质合成翻译过程的两个调节子,4E-结合蛋白1(4E-BP1)和核糖体蛋白S6激酶,磷酸化的调节作用及其生物学意义。方法培养大鼠胸主动脉VSMC。用3H-亮氨酸和3H-TdR掺入法分别测定蛋白质合成和DNA合成;免疫印迹法检测4E-BP1和核糖体蛋白S6激酶的磷酸化。结果与对照相比,100nmol/L胰岛素显著增加了VSMC的3H-亮氨酸和3H-TdR掺入。同样浓度的胰岛素作用于VSMC,可以诱导4E-BP1和核糖体蛋白S6激酶发生磷酸化。二者的磷酸化分别于胰岛素刺激后,30min和10min达高峰。结论胰岛素可以刺激VSMC的4E-BP1和核糖体蛋白S6激酶发生磷酸化,这可能是胰岛素发挥促进VSMC生长作用的机制。     

PD098059及N-乙酰半胱氨酸在缓激肽引起血管平滑肌细胞增殖反应中的调节作用

目的 :研究丝裂原活化蛋白激酶 （MAPK ）信号途径在缓激肽 （BK）介导的大鼠血管平滑肌细胞 （VSMC）增殖中的作用。方法 :通过 3H -胸苷 （3H- Td R）掺入率与 SMC3H-亮氨酸掺入率分别反映 VSMC的 DNA代谢与蛋白质合成代谢速率 ;并通过给予 PD0 980 5 9及 N-乙酰半胱氨酸预处理 ,观察其对细胞增殖的影响。结果 :1BK（10 nm ol/L ）处理 30 min,VSMC3H-胸苷掺入率和 3H-亮氨酸掺入率均明显增高 ;2 BK增高 3H -胸苷掺入的作用可明显被PD0 980 5 9所抑制 ,对 3H -亮氨酸掺入的作用可部分被 PD0 980 5 9所抑制 ;3BK增高 3H -胸苷掺入和 3H -亮氨酸掺入的作用均可部分被 N-乙酰所抑制 ,完全被 N-乙酰 +PD0 980 5 9所抑制。结论 :细胞外信号调节激酶 （ERKs）激活在缓激肽介导的 VSMC增殖中具有重要作用 ,并可通过 ERKs信号途径的特异性抑制剂影响血管平滑肌细胞的增殖效应。     

CD40-CD40配体对大鼠主动脉平滑肌细胞增殖及迁移影响

目的:观察CD40-CD40配体(CD40-CD40L)相互作用对体外培养的大鼠主动脉平滑肌细胞(VSMC)增殖及迁移的影响。方法:应用组织贴块法进行SD大鼠主动脉VSMC原代培养,以3H-胸腺嘧啶脱氧核苷(3H-TdR)、3H-亮氨酸(3H-Leu)掺入法分别测定VSMC增殖,VSMC的迁移采用琼脂糖凝胶刮取法,用倒置显微镜观察。结果:CD40-CD40L相互作用能明显促进VSMC3H-TdR、3H-Leu向细胞的掺入率,两者具有时间、剂量依赖性,CD40-CD40L相互作用随CD40L浓度的增加及刺激时间延长(30h内),能明显增加VSMC迁移率,抗-CD40单克隆抗体能明显抑制上述效应。结论:CD40-CD40L相互作用能明显促进主动脉VSMC增殖和迁移。     

运动干预对大鼠骨骼肌mTOR与P70^S6K磷酸化的影响

运动干预增加大鼠骨骼肌核糖体蛋白S6激酶(P70S6K)及哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)的磷酸化水平,改善P70S6KmRNA表达,降低血液胰岛素浓度(P均<0.05).提示运动干预可能通过增加mTOR与P70S6K活性,提高骨骼肌对胰岛素的敏感性.     

雷帕霉素阻断血管紧张素Ⅱ刺激血管内皮细胞增生的信号传导机制

目的：研究Rapamycin(Rapa)阻断血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)刺激血管内皮细胞增生信号传导机制。方法：不同浓度AngⅡ刺激人脐静脉内皮细胞(E(2V304)，并用Rapa进行干预，采用^3H-胸腺嘧啶核苷掺入法和^3H-亮氨酸掺入法测定细胞DNA和蛋白质合成，流式细胞术检测细胞周期变化，免疫印迹(Westelm blot)检测细胞信号蛋白P70s6k，ERK2及细胞周期蛋白Cyclin D1、Cyclin A、和Cyclin B1表达的变化。结果：AngⅡ刺激细胞24h。细胞DNA和蛋白质合成均增加，并呈剂量依赖效应。AngⅡ 10^-6M组与对照组比较P70s6k，ERK2表达分别上调108．7％，54．7％，Rapa完全阻断P70s6k和Cyclin D1的活化，而不影响ERK2的表达。结论：Rapa通过阻断P13K-p70S6K信号通路抑制AngⅡ诱导的血管内皮细胞增生，抑制细胞周期蛋白Cyclin D1的表达，阻止细胞G0／G1→S期。     

核糖体蛋白S6激酶1基因沉默对高糖刺激下肝细胞固醇调节元件结合蛋白1 c表达的影响

目的 探讨核糖体蛋白S6激酶1(S6K1)基因沉默后对高糖刺激下小鼠肝细胞固醇调节元件结合蛋白1c(SREBP1c)表达的影响.方法 将构建的S6K1shRNA重组基因腺病毒(S6K1Ax)注射进db/db小鼠尾静脉,以注射含pU6启动子的腺病毒(pU6Ax)空载体的db/db小鼠作对照组,HE染色观察肝脏病理改变并检测肝脏甘油三酯含量变化.S6K1Ax转染小鼠肝细胞AML12细胞,转染pU6Ax的作为对照组,分别用高糖、高胰岛素,高糖高胰岛素刺激,逆转录聚合酶链式反应分析肝细胞在各种条件刺激后mSREBP1c等的表达,Western blot检测db/db小鼠肝脏及AML12细胞S6K1的蛋白表达.结果 db/db糖尿病小鼠注射S6K1Ax后1周,肝脏S6K1蛋白表达被抑制,对照组与实验组肝脏甘油三酯含量分别为(0.65±0.02)mmol/L和(0.56±0.01)mmol/L,t=4.312,P<0.01,差异有统计学意义.HE染色显示实验组肝细胞胞质含脂肪滴减少,空泡细胞数量减少,脂肪肝得到改善.AML12肝细胞mSREBP1c表达实验组为0.03±0.01,对照组为0.06±0.01,t=5.624,P<0.01,差异有统计学意义.与基础状态相比,给以胰岛素刺激后实验组和对照组mSREBP1c表达均增加,实验组上升至0.06±0.02,t=8.452,P<0.01,对照组上升至0.08±0.02,t=3.591,P<0.05.高糖刺激对实验组和对照组mSREBP1c表达均无明显影响.与高胰岛素刺激组相比,高糖高胰岛素刺激后实验组和对照组mSREBP1c表达均无明显差异.结论 S6K1通过影响脂代谢的关键调控基因mSREBP1c表达参与了脂肪的合成,推测S6K1在脂肪肝的形成中发挥了重要作用.     

核糖体蛋白S6激酶1基因沉默对小鼠非酒精性脂肪性肝病的影响

目的 探讨核糖体蛋白S6激酶1基因沉默对db/db小鼠非酒精性脂肪性肝病的影响及其作用机制.方法 根据随机数字表将12只体质量44.5～48.2 g的9周龄雄性db/db小鼠随机分至对照组（n=6）和实验组（n=6）.实验组db/db小鼠尾静脉注射制备的核糖体蛋白S6激酶1短发夹RNA重组基因腺病毒,对照组db/db小鼠尾静脉注射含U6启动子空载体腺病毒.在注射病毒后第6天处死小鼠获取肝脏,提取肝脏蛋白,利用Western blot法观察其中胰岛素受体底物1、胰岛素受体底物2、蛋白激酶B及其丝氨酸473蛋白的表达;提取肝脏总RNA用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应法检测比较2组参与肝脏脂肪酸合成基因mRNA的表达.处死2组小鼠前1 d禁食16 h后经尾静脉取血,采用比色法检测游离脂肪酸、甘油三酯、总胆固醇水平.组间数据比较采用t检验.结果 db/db小鼠注射病毒后6 d,苏木素-伊红染色显示实验组肝细胞胞质含脂肪滴较对照组减少,脂肪肝得到改善.Western blot检测显示实验组核糖体蛋白S6激酶1蛋白表达被抑制,与对照组相比差异有统计学意义（分别为0.12±0.01和0.87±0.06,t=5.36,P＜0.05）;实验组胰岛素受体底物1、胰岛素受体底物2、蛋白激酶B丝氨酸473的蛋白表达均较对照组增强（均P＜0.05）.和对照组相比,实验组参与脂肪酸合成的基因固醇调节元件结合蛋白1c（分别为2.33±0.29和1.34±0.39,t=3.46,P＜0.01）、脂肪酸合成酶（分别为7.8±1.2和3.4±0.4,t=4.67,P＜0.01）、硬脂酰辅酶A去饱和酶1（764±116和535±54,t=6.12,P＜0.01）mRNA表达均明显下降.血清生化测定结果显示和对照组相比实验组脂肪酸下降（t=2.64,P＜0.05）,胆固醇水平降低（t=4.25,P＜0.01）,甘油三酯组间比较差异无统计学意义（P＞0.05）.结论在营养过剩的条件下,肝脏核糖体蛋白S6激酶1过度激活,可能通过负反馈引起肝脏胰岛素信号传导下降、上调脂代谢关键调控基因固醇调节元件结合蛋白1c表达而参与了肝脏胰岛素抵抗和脂肪肝的发生.     

细胞内钙信号的变化调节血管平滑肌细胞增殖

目的探讨细胞内钙信号的变化对大鼠血管平滑肌细胞(VSMC)增殖作用的影响及其对细胞内信号转导机制的变化.方法以培养的大鼠VSMC为模型,用雷尼丁(RY)刺激VSMC内贮Ca2+释放入胞浆,用3H-亮氨酸及3H-胸腺嘧啶掺入量作为反应VSMC增殖的指标,加入不同的细胞内信号转导阻断剂,观察对RY效应的影响.结果与对照组相比,RY浓度依赖性地促进细胞内游离钙浓度的增高,差异显著(P＜0.05或0.01).RY刺激组蛋白核酸合成速率明显增高,与对照组相比差异显著(P＜0.01);尼卡地平(Nicardipine),蛋白激酶C抑制剂(H7),钙调素激酶(CaM-PK)抑制剂(W7)和丝裂素活化蛋白激酶(MAPK)抑制剂(PD98059)能明显抑制RY介导的VSMC蛋白核酸合成速率增高,与RY刺激组相比差异显著(P＜0.01).结论细胞内钙信号的变化明显促进VSMC增殖,但其效应可能通过Ca2+、PKC、MAPK来介导.钙离子拮抗剂可抑制血管平滑肌细胞增殖.     

TGFα与bFGF联结皂草毒素蛋白对增殖平滑肌细胞和内皮细胞的特异性细胞毒作用

目的:为比较生物导向药物转化生长因子-皂草毒素蛋白(TGFα-SAP)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)-SAP对增殖平滑肌细胞特异性细胞毒性作用。方法:用SPDP化学联结的方法合成了导向药物TGFα-SAP和bFGF-SAP,以3H-亮氨酸渗入法观察了TGFα-SAP及bFGF-SAP对平滑肌细胞(SMCs)和内皮细胞(ECs)蛋白质合成的影响,并以MTS法和3H-胸腺嘧啶核苷(TdR)渗入法比较TGFα-SAP及bFGF-SAP对SMCs和ECs的增殖和DNA合成的抑制作用。结果:10-9mol/L的TGFα-SAP可明显抑制SMCs增殖,SMCs细胞增殖抑制率达到77.5%,而相同浓度bFGF-SAP的抑制率仅46.1%;并且TGFα-SAP也比bFGF-SAP更明显抑制了培养SMCs的蛋白质合成。与空白对照组比较,3H-亮氨酸掺入量降低了47.3%;该浓度的TGFα-SAP和bF-GF-SAP对ECs却未显示出明显的细胞毒性作用。10-9mol/L的TGFα-SAP明显抑制了SMCs的DNA合成,使3H-TdR掺入量较对照组降低了29.5%,但同样浓度的bFGF-SAP仅使3H-TdR掺入量较空白对照组降低了9.86%。在10-7mol/L浓度下的TGFα-SAP未显示出明显对ECs的细胞毒性作用,而bFGF-SAP具有明显降低ECs的3H-TdR掺入量。结论:TGFα-SAP通过表皮生长因子受体介导具有明显增强的细胞毒性作用,其对增殖SMCs的细胞毒性作用较bFGF-SAP更为敏感,而在10-7mol/L浓度下,bFGF-SAP比TGFα-SAP对ECs显示出更明显的细胞毒性作用。本实验为TGFα-SAP在经皮冠脉成形术后再狭窄临床防治中的应用前景提供进一步实验依据。     

心钠素及内皮素对心肌细胞肥大及心脏成纤维细胞增殖的影响

目的观察心钠素(ANP)、内皮素-1(ET-1)对心肌细胞肥大和心脏成纤维细胞增殖的调节作用.方法采用体外乳鼠心肌细胞和心脏成纤维细胞培养,一定浓度的 ET-1、ANP单独或联合作用细胞24 h,以3H-胸腺嘧啶脱氧核苷(3H-TdR)、3H-亮氨酸(3H-Leu)掺入法测定细胞DNA、蛋白合成,Bradford法测细胞总蛋白含量,RT-PCR法测心肌细胞心钠素ANP mRNA的表达,评价ET-1、ANP对心肌细胞和成纤维细胞的作用.结果对于心肌细胞,ET-1显著促进3H-TdR、3H-Leu掺入,总蛋白含量增加,呈剂量依赖性,ANP mRNA表达明显增加;对于心脏成纤维细胞,ET-1促进3H-TdR、3H-Leu掺入,总蛋白含量增加,以上作用可被ANP明显抑制.结论ET-1促进ANP分泌的同时也促进心肌细胞肥大和心脏成纤维细胞增殖,ANP反之抑制ET-1的促心肌肥厚作用.