α1,3半乳糖基转移酶基因721C>T突变导致B_w亚型

目的　研究红细胞ABO血型系统Bw亚型的分子基础。方法　通过标准血型血清学方法明确鉴定2个家庭3例Bw亚型,PCR扩增Bw 亚型ABO糖基转移酶基因的增强子、启动子和第1～7外显子及侧翼内含子序列,PCR产物经割胶纯化后直接测序。同时将第6和7外显子克隆到pc DNA3.1(- )质粒,转化DH5α后进行序列分析。采用序列特异性引物-聚合酶链反应方法证实测序所发现的突变。结果　直接测序发现3例Bw亚型的基因型为B/ O杂合,其中糖基转移酶基因的第2 6 1位G杂合缺失,第72 1位C/ T杂合。克隆证实一条染色体上为正常的O等位基因,另一条染色体上B等位基因(α1,3半乳糖基转移酶基因)存在第72 1位C>T突变,导致多肽链Arg2 4 1Trp替换。序列特异性引物-聚合酶链反应检测14 0份随机样本未发现此突变。结论　α1,3半乳糖基转移酶基因第7外显子72 1C>T突变可能是Bw亚型分子遗传基础之一。     

一个Bw亚型家系的血型分子机制及临床输血分析

目的 对1个Bw亚型血型家系的分子机制进行研究,并探讨该亚型的临床输血情况.方法 对1名ABO血型正反定型不符的无偿献血者及其家人的血型进行血清学鉴定,并应用聚合酶链反应-序列特异性引物法、ABO基因直接测序、TA克隆单倍型分析及相关软件对该突变引起的酶结构及功能变化进行分析等方法,同时对该献血者以往3次所献的血样的临床输血情况进行回顾.结果 在该家系中发现了3例较为罕见的Bw亚型.该亚型是由于ABO基因第7外显子存在721C/T杂合,导致R241W氨基酸改变所致.临床回顾提示3次输血均未发现明显异常.结论 ABO基因721C＞T突变是导致Bw亚型的分子遗传基础之一,该亚型在临床输血中的意义尚需进一步探讨.     

一个中国汉族ABO血型B亚型家系中发现新的B等位基因

目的　研究中国汉族人群ABO血型中B亚型的分子遗传背景,发现并鉴定ABO新等位基因。方法　随机选择10个正常的B型志愿捐血者样本作对照,对6例血型血清学鉴定为B亚型的样本,采用序列特异性引物-聚合酶链反应方法、ABO基因第6及第7外显子PCR产物直接测序,进行基因定型;并对B等位基因的第6外显子、第6内含子及第7外显子进行基因克隆和单倍体测序分析。结果　2例血清学为Bx、BW的B亚型样本中,发现一个新的B等位基因。该等位基因与B1 0 1 等位基因相比,差异仅在第7外显子nt6 95位T>C突变。进一步对其中一个Bx 血型的个体进行家系调查,结果该家系的11人中,7人带有该新B等位基因。而其余的4例B亚型样本及10例对照样本,ABO基因的第6、7外显子未发现新的点突变。结论　首次发现6 95 T>C变异的新B等位基因,该等位基因nt6 95位由T转变为C,2 32位氨基酸由亮氨酸转变为脯氨酸,可导致糖基转移酶活性的降低,表明ABO基因的第2 32位氨基酸对决定糖基转移酶活性至关重要。     

一种ABx变异型相关的B糖基转移酶基因新突变研究

目的 研究1例ABO血型系统ABx变异型的分子遗传背景.方法 用血型血清学技术鉴定1例ABO血型疑难样本的红细胞表型和唾液血型分泌物质,并用聚合酶链反应分别扩增先证者ABO基因全编码区共7个外显子及侧翼内含子序列,扩增产物经双酶切纯化后直接进行双向测序分析.进一步对存在突变位点的第6～7外显子扩增产物经进行TA克隆和单倍体序列分析.结果 先证者红细胞ABO抗原表达为A强B弱,结合其它血清学特征,鉴定其血型为罕见的ABx变异型.ABO基因全编码区测序发现9处核苷酸杂合位点,分别为第6外显子的297A/G杂合,第7外显子的467C/T、526C/G、657C/T、703G/A、796C/A、803G/C、808T/A、930G/A杂合.单倍体序列分析发现,其中一个等位基因为常见的A102,另一个等位基因除808T＞A突变外,其它变异位点与B101等位基因一致.808T＞A突变可导致B糖基转移酶第270位苯丙氨酸转变为异亮氨酸.结论 B糖基转移酶基因808T＞A突变可能引起酶活性减弱,并进而导致产生Bx变异型.     

ABO基因278C>T突变导致Bw12一例

目的 对1例ABO疑难血型样本进行血清型和基因型鉴定.方法 用血清学方法对标本进行ABO血清型检测,根据血清型结果,选取ABO基因亚型检测试剂盒,用聚合酶链反应-序列特异性引物法进行基因亚型鉴定,用直接测序法对ABO基因的第6、7外显子进行序列测定.结果 血清学结果显示,该样本的红细胞上具有高凝集强度的A抗原和中等凝集强度的B抗原,样本血浆中含有弱凝集强度的抗-B抗体,初步判定为ABw型;B亚型基因分型试剂的结果显示,该样本ABO基因为ABw12型;直接测序结果显示,该标本ABO基因第6外显子序列为278CT、297GA,第7外显子序列为467CT、526CG、657CT、703GA、796CA、803GC、930GA杂合,即在基因型A102/B101的基础上,该序列nt278位发生了C＞T杂合突变,经与血型抗原基因变异资料库的数据比对,确定突变的等位基因为Bw12,基因型为A102/Bw12.结论 中国人群中发现A102/Bw12基因型.     

α1,3半乳糖基转移酶新等位基因278C＞T的鉴定

目的研究中国汉族人群ABO血型系统中Bw变异型的分子遗传背景，发现并鉴定一个新的ABO等位基因。方法血型血清学方法鉴定1例ABO血型疑难样本，应用聚合酶链反应、逆转录-聚合酶链反应和DNA序列分析等方法对先证者ABO基因转录调控序列和全编码序列进行突变筛选和检测。结果血清学和家系调查鉴定该样本为Bw表型，对gDNA和cDNA研究发现该样本存在第6外显子278C／T杂合，单倍体分析发现一种新的Bw等位基因，该等位基因与B101相比，差异仅在第6外显子的278C〉T错义突变，导致多肽链P93L替换，该突变点位于以前报道的Bw等位基因功能域之外。结论在中国人群中发现一种新的导致Bw变异型的ABO等位基因。     

一个类孟买血型家系的α1,2岩藻糖基转移酶基因突变分析

目的 研究1个中国人类孟买型血型家系的分子遗传背景.方法 以血型血清学方法鉴定先证者及其家系的红细胞ABO和H表型,应用聚合酶链反应扩增类孟买表型家系的ABO基因第6、7外显子和α1,2岩藻糖基转移酶基因(α-1,2-fucosyltransferase,FUT1)编码区,PCR产物直接测序分析,并通过克隆测序法对存在FUT1基因复合杂合的样本进行单倍体序列分析.结果 通过血清学技术在9个家系成员中鉴定了3个类孟买型,直接测序发现先证者FUT1基因存在35C/T、235G/C和682A/G复合杂合.单倍体序列分析表明先证者的FUT1基因型为h235c/h35T+628G.其中h235C等位基因引起α1,2岩藻糖基转移酶G79R替换,h35+628G等位基因引起α1,2岩藻糖基转移酶A12V和M228V替换.结论 在中国人群中发现一种新的类孟买表型相关的FUT1基因突变235G>C.     

ABO亚型ABw07一家系的分子生物学研究

目的 研究一个ABO亚型ABw07家系的分子机制.方法 用单克隆抗体检测先证者红细胞ABO血型抗原.标准A、B、O红细胞检测先证者血清中的ABO抗体,采用聚合酶链反应技术扩增先证者ABO基因的第6和7外显子序列,PCR产物经酶切后直接测序分析.同时PCR产物经TOPO TA克隆到质粒载体中获得单链,对所得克隆进行ABO基因双向测序分析.家系调查采集先证者父母和姐姐的标本进行血型血清学实验和ABO基因第6和7外显子直接测序分析.结果 先证者红细胞有A、B抗原,同时血清中存在抗B抗体.直接测序分析发现第261位无缺失,第297位A/G、467C/T、526C/G、657C/T、703G/A、796C/A、803G/C、930G/A、1055C/A、1096A/G杂合,可推断为A102Bw07基因型.克隆测序得到两个等位基因A102和Bw07.与B101相比,Bw07第1055位G→A,导致1个氨基酸改变:第352位氨基酸精氨酸变成谷氨酰胺.家系调查显示先证者Bw07基因从母亲遗传所得,母亲血液标本ABO血型血清学特性和测序分析结果与先证者完全一致.结论 α-1,3-半乳糖基转移酶基因(B基因)第1055位G→A突变导致产生Bw07表型,其血清中可含有抗B抗体.     

α-1,3- N-乙酰半乳糖胺基转移酶基因新变异的家系研究

目的通过对一例ABO亚型家系血清学和基因序列分析,研究该家系中α-1,3-N-乙酰半乳糖胺基转移酶基因新变异位点的特征。方法收集先证者及其3名家系成员血液标本,血清学方法进行ABO表型检测,荧光PCR进行ABO血型基因分型。通过对先证者ABO基因全编码区直接测序及第6、7外显子克隆测序方法进行基因序列及单体型分析。结果先证者血型为AxB亚型,ABO血型基因分型为A/B。克隆测序结果显示A新等位基因在ABO*A1.02序列基础上存在第7外显子c.797_798 insT变异。家系调查发现,先证者及其姐姐新变异均遗传自其父亲。c.797_798insT新变异序列已注册基因数据库(MK125137)。结论α-1,3-N-乙酰半乳糖胺基转移酶基因第7外显子c.797_798insT新变异为可遗传变异,可导致A抗原表达减弱。     

一例ABO新等位基因B112的分子生物学研究及其家系分析

目的 研究1例新的ABO亚型B112的分子机制,并对其家系进行分析.方法 应用单克隆抗体检测先证者红细胞ABO血型抗原,标准A、B、O红细胞检测先证者血清中的ABO抗体.采用聚合酶链反应(po1ymerase chain reaction,PCR)技术扩增先证者ABO基因的第5至7外显子序列,PCR产物经双酶切后直接测序分析第6和7外显子.同时采用基因组单链抽提技术分离先证者的两条单倍型,对分离的单倍型扩增后进行ABO基因测序分析.家系调查采集先证者父母的标本进行ABO血清学实验和ABO基因第6和7外显子测序分析.结果 先证者血清学表型符合B表型特性,直接测序分析显示第6和7外显子有261G/缺失、297A/G、526C/G、559C/T、657C/T、703G/A、796C/A、803G/C、930G/A杂合,推断基因型为BO.基因组单链抽提技术将先证者B和O基因分离后,测序得到两个等位基因为O01和B112.与B101相比,B112第559位C→T导致第187位精氨酸变成半胱氨酸.家系调查显示先证者B112基因从母亲遗传所得,母亲标本ABO血型血清学特性和测序分析结果与先证者完全一致.结论 发现1例559C＞T突变的ABO亚型新等位基因B112,其B抗原表达正常,提示α-1,3-半乳糖基转移酶第187位精氨酸变成半胱氨酸并不影响B转移酶的活性.     

一例ABO血型Aw33亚型新等位基因的分子生物学鉴定

目的研究1例ABO血型A亚型的分子生物学机制。方法患者ABO血型正反定型采用卡式法和试管法分别进行鉴定。利用PCR序列特异性引物检测该患者所含ABO基因。PCR扩增该患者ABO基因1~7外显子的全部编码序列并进行测序分析,通过克隆测序进行ABO基因单倍型分析。结果患者红细胞与抗A呈现弱凝集,与抗B不凝集,其血清与Ac凝集1+,与Bc呈现4+凝集,血清学特性可定义为Aw亚型。ABO基因测序分析显示患者存在c.106G>T、c.188G>A、c.189C>T、c.220C>T、c.297A>G、c.467C>T、c.543G>C、c.646T>A、c.681G>A、c.771C>T、c.829G>A杂合变异和c.261delG缺失。结合克隆测序结果,推测患者ABO基因型为ABO*Aw.33.new/O.01.02;与ABO*A1.01相比存在c.467C>T和c.543G>C变异,与ABO*A1.02相比存在c.543G>C变异,该新等位基因序列已提交GenBank,序列号为MK302122。结论发现1例Aw33亚型新的等位基因,其GTA转移酶基因存在c.467C>T和c.543G>C变异。     

一例ABO血型重组等位基因的分子特性

目的分析一例ABO血型重组等位基因的分子特性。方法ABO表型鉴定采用试管法。ABO基因和FUT1基因编码区序列检测采用PCR测序法。利用等位基因特异性引物扩增测序技术鉴别先证者ABO等位基因。先证者及其母亲ABO基因全长序列测定采用二代测序方法。结果先证者红细胞与抗H不凝集,FUT1基因为c.551_552del AG纯合,判定先证者为类孟买型。先证者ABO基因双链测序结果为c.261G/del、467C>T、c.526C>G、c.657C>T、c.703G>A、c.796C>A、c.803G>C、c.930G>A杂合。单链测序结果显示先证者有一个ABO*A1.02等位基因,另一个为ABO*O.01.01和ABO*B.01重组形成的等位基因。二代测序数据显示可能重组的位置在核苷酸c.375-269到c.526之间,家系分析显示先证者重组等位基因遗传自母亲。结论ABO血型等位基因存在重组现象。发现了1例ABO*O.01.01和ABO*B.01重组形成的新等位基因。     

Bw11亚型家系表现ABO等位基因竞争现象的研究

目的分析携带ABO*BW.11等位基因的家系成员ABO血清学和分子生物学特征。方法应用血清学方法检测先证者及其家系成员共9人的ABO血型表型。采用PCR方法扩增ABO基因第6、7外显子并对扩增产物直接测序,同时克隆测序先证者及其父亲的标本。结果血清学检测初步判断先证者及其弟弟为AB亚型,先证者的父亲及其两女儿为B亚型。克隆测序发现先证者ABO等位基因第7外显子在B101的基础上第695位碱基发生T>C变异,表明为ABO*BW.11等位基因。先证者的父亲、弟弟及其两个女儿均携带该变异等位基因。A基因与BW.11以及BW.11与O基因同时遗传时竞争现象存在明显差异。结论ABO基因c.695T>C变异可能会导致Bw11亚型存在等位基因竞争现象。分子生物学方法结合血清学方法有助于精准鉴定ABO疑难血型。     

一例α1,4半乳糖基转移酶基因一碱基缺失导致p表型

目的　研究 α1,4半乳糖基转移酶基因决定 p表型的分子基础。　方法　在标准血清学鉴定红细胞表型的基础上 ,PCR扩增 p表型个体 α1,4半乳糖基转移酶基因的第 3外显子编码区序列 ,PCR产物经割胶纯化后直接进行测序分析。结果　p表型个体 α1,4半乳糖基转移酶基因第 3外显子第 30 0或30 1位核苷酸 G缺失 (TCGG→ TCG) ,导致阅读框架在第 10 1位氨基酸发生移码 ,在第 113位氨基酸处提前形成终止密码。先证者父母为杂合缺失携带者。　结论　发现了 α1,4半乳糖基转移酶基因第 3外显子第 30 0或 30 1位处 G缺失突变 ,该突变可能是 p表型的分子机理之一。     

一例Bw亚型的糖基转移酶等位基因鉴定及蛋白结构分析

目的对1例Bw亚型个体进行分子遗传学及蛋白结构分析。方法采用血清学技术进行红细胞表面抗原和血清中抗体的测定,并用PCR-基于序列的分型(PCR-sequence-based typing,PCR-SBT)方法进行ABO基因的全编码区序列和第1内含子区红系特异性调控元件的分析。进一步对存在突变位点的第5~7外显子扩增片段进行T-A克隆分离单倍体和序列验证分析。应用Pymol软件对突变蛋白进行3D结构的模拟,分析氨基酸残基的变化对蛋白结构稳定性的影响。结果该样本血清学表现为B抗原减弱,血清中含有抗-B抗体。ABO基因全编码区测序初步确定其基因型为ABO*B.01/ABO*O.01.01伴有c.734C/T的杂合突变。第1内含子红系特异性调控元件区碱基序列无异常。通过单倍体克隆分离,确定突变位点c.734T位于ABO*B.01等位基因链,另一个等位基因为ABO*O.01.01。该突变将B糖基转移酶活性中心245位Thr置换为Ile。蛋白3D结构的模拟分析发现氨基酸置换后,与之结合的残基未发生改变而连接的氢键距离发生变化,同时增加了与远距离水分子之间的连接。结论B糖基转移酶基因c.734C>T突变导致酶活性中心氨基酸置换,影响了突变B糖基转移酶蛋白稳定性,引起酶活性减弱,从而产生了Bw变异型。     

一例多位点突变导致的罕见B(A)型的血清学及分子遗传学研究

目的探讨1例ABO血型血清学正、反定型不符的血样标本的分子遗传学基础。方法采用试管法对此例血样进行ABO血型正、反定型,应用直接测序及单倍型测序的方法确定其基因型。结果此例样本血型血清学结果显示,其正定型为AwB型,反定型为B型;直接测序及单倍型测序最终结果显示,其中一条等位基因为O01,另一条等位基因与A101标准序列相比,存在c.297A>G、c.657C>T、c.796C>A、c.803G>C及c.930G>A碱基突变。结论经基因测序证实,此例血清学定型困难的样本基因型为O01/B(A)new型,此突变类型的B(A)型既往未见报道。