MMP-9及TIMP-1在碱烧伤小鼠角膜中的表达

目的探讨角膜烧伤后基质金属蛋白酶9(MMP9)及其组织型抑制剂(tissueinhibitorofmetallopoteinase1,TIMP1)在小鼠角膜中的表达及意义。方法采用1mol·L-1氢氧化钠溶液烧伤昆明小鼠角膜,建立角膜碱烧伤动物模型;用免疫组织化学染色方法和计算机图像分析系统检测小鼠角膜烧伤后不同时间点MMP9及TIMP1在角膜中的分布及其积分吸光度(A)值。结果小鼠角膜碱烧伤后第2d炎性细胞增多,第7d炎症达到高峰,21d后基本消失。小鼠角膜上皮层、基底膜、以及基质层中大量炎性细胞和新生血管内皮细胞均有MMP及TIMP1表达。角膜中MMP9在第2d出现表达,第7d达高峰,以后逐渐降低;TIMP1开始表达不明显,第7d出现表达,14d达高峰,以后逐渐降低。结论小鼠碱烧伤模型炎症早期MMP9活性增高,继而TIMP1分泌增多,MMP9活性受抑,炎症减轻。提示MMP9可能是参与碱烧伤角膜溃疡形成、角膜融解及纤维化的重要调控因子,而TIMP1则在炎症的抑制过程中发挥了重要作用。     

碱烧伤小鼠行羊膜移植后MMP及TIMP表达的变化

目的:通过检测羊膜移植对小鼠角膜碱烧伤后不同时间点基质金属蛋白酶(metalloproteinases,MMP-2,8,9)及金属蛋白酶组织抑制剂(tissue inhibitor of metalloproteinases,TIMP-1,2)的表达,探讨羊膜移植在碱烧伤病程中所起的作用。方法:将40只Balb/c小鼠随机分为实验组和对照组,采用1mol/L氢氧化钠溶液烧伤小鼠角膜;实验组小鼠右眼行羊膜移植加睑裂缝合术,对照组仅行睑裂缝合术。分别在羊膜移植后的第0,2,7,14d处死小鼠,应用Western blot检测不同时间点MMP-2,8,9及TIMP-1,2的表达,增强化学发光法(enhanced chemiluminescent,ECL)对结果进行分析。结果:对照组角膜中MMP-2,8,9在第2d出现表达,第14d达到峰值,且表达主要位于基质层及上皮下的炎性细胞中。碱烧伤后第2d TIMP-1仅微弱表达,第7d可见表达增加,第14d到达峰值。TIMP-2第2d即可见表达增加,后持续增强。实验组各时间点MMP-2,8,9表达均低于对照组(P<0.01),TIMP-1,2的表达均高于对照组(P<0.01)。结论:行羊膜移植可通过抑制MMP的表达,促进TIMP表达,从而抑制和延迟碱烧伤后角膜炎性浸润及溃疡的发生和发展,对碱烧伤后角膜的重塑起着重要作用。     

不同浓度重组Canstatin蛋白对碱烧伤后角膜MMP-2及TIMP-2表达的影响

目的：探讨不同浓度重组Canstatin蛋白对碱烧伤后小鼠角膜基质金属蛋白酶－2（ matrix metalloproteinase－2,MMP－2）及其组织抑制剂－2（ tissue inhibitor of metalloproteinase－2, TIMP－2）表达的影响及其调节作用。方法：BALB／c小鼠60只随机分为实验组A、实验B及对照组C,每组20只。采用1mol／L氢氧化钠溶液烧伤小鼠右眼角膜,建立炎症性角膜碱烧伤动物模型,分别予以A组、B 组重组 Canstatin 蛋白3μg／mL、5μg／mL 点右眼,4次／d,对照组C组予以生理眼水点右眼。在碱烧伤后第1、3、7、14d以形态学分析评价角膜上皮损伤面积及新生血管生长的情况,并于碱烧伤后第1、3、7、14 d 应用Western－blot检测角膜MMP－2和TIMP－2的表达,增强化学发光法（ ECL）对结果进行分析。结果：形态学分析显示,A组和B组小鼠在碱烧伤后第3d起各时间点角膜上皮缺损面积均小于对照组（P＜0．01）,角膜新生血管均得到抑制,CNV面积明显小于对照组（ P＜0．01）。 Western－blot结果显示,碱烧伤后各时间点MMP－2的表达,A组和B组均明显低于对照组（P＜0．01）,TIMP－2的表达高于对照组（P＜0．01）,且A组和B组间MMP－2的表达在第14d比较差异有统计学意义（P＜0．05）,TIMP－2的表达在第7d及第14d比较差异有统计学意义（P＜0．05）。结论：重组Canstatin蛋白可通过抑制角膜细胞及浸润的炎性细胞产生MMP－2,促进TIMP－2表达,从而抑制和延迟碱烧伤后角膜融解的发生和发展,对碱烧伤后角膜的重塑起着重要作用。     

大鼠角膜新生血管模型中基质金属蛋白酶-2及其抑制物的表达

目的 探讨大鼠角膜碱烧伤后基质金属蛋白酶－2（MMP－2）及其组织型抑制剂（TIMP－2）在角膜中的表达和意义。方法 采用碱烧伤大鼠角膜建立角膜新生血管动物模型；应用免疫组织化学技术检测MMP－2及TIMP－2在角膜新生血管模型不同阶段的表达和变化。结果 实验鼠于伤后3－天开始形成大量新生血管，可见炎性细胞浸润，伤后14－21天新生血管和炎性细胞均明显减少。免疫组化显示MMP－2于伤后1天表达开始升高，3天达最高，以后逐渐下降。而TIMP－2则于早期变化不明显，7天表达开始升高，14天达高峰。结论 大鼠角膜新生血管形成早期MMP－2活性增高，继而TIMP－2分泌增多，MMP－2活性受抑，基底膜降解受阻，新生血管延伸停滞。     

羊膜移植治疗急性角膜碱烧伤的实验研究--基质金属蛋白酶及其抑制剂表达的测定

目的 探讨新鲜羊膜移植术在早期角膜碱烧伤治疗中的作用机制。方法36只新西兰大白兔制作角膜碱烧伤模型，分为新鲜羊膜移植组、保存羊膜移植组和对照组。术后每日观察新生血管生长情况，并于术后7天、14天应用计算机图像分析系统对角膜表达基质金属蛋白酶(MMPs)和基质金属蛋白酶抑制剂-1(TIMP-1)进行半定量测定。结果术后新鲜羊膜移植组角膜新生血管发展缓慢，MMFs角膜表达降低而TIMP-1表达升高。结论羊膜移植可通过提高角膜表达基质金属蛋白酶抑制剂-1的水平来抑制基质金属蛋白酶的活性，从而在早期角膜碱烧伤的治疗中起抑制角膜溃疡和新生血管形成的作用，且这一作用新鲜羊膜要明显优于保存羊膜。     

羊膜移植对大鼠角膜碱烧伤后基质金属蛋白酶的影响

目的探讨羊膜移植对大鼠角膜中度碱烧伤后角膜上皮细胞和基质成纤维细胞中基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)变化的影响。方法将12只SD大鼠随机分成2组，每组6只，分别作为碱烧伤后1d组和14d组。在2组中，所有大鼠角膜建立中度碱烧伤模型，左眼行羊膜移植，右眼作为对照。应用免疫组化法，分别观察碱烧伤后1d和14d实验组与对照组中MMP-9和MMP-2表达的变化。结果碱烧伤后1d，实验组与对照组中，角膜上皮细胞内的MMP-9和MMP-2的表达与正常角膜上皮细胞内的MMP-9和MMP-2的表达相比明显升高，但两组间的表达差异无显著性；而2组成纤维细胞内的MMP-9和MMP-2的表达与正常成纤维细胞内的MMP-9和MMP-2的表达相比明显升高，两组间的表达差异无显著性。碱烧伤后14d，2组中角膜上皮细胞内的MMP-9和MMP-2的表达与碱烧伤后1d情况相似，两组间的表达差异无显著性；2组成纤维细胞内的MMP-9和MMP-2的表达与碱烧伤后1d组相比明显升高，并且实验组中的MMP-9和MMP-2的表达与对照组相比也有明显升高。结论碱烧伤后大鼠角膜上皮细胞和基质成纤维细胞中的MMP-9和MMP-2的表达都有升高。羊膜移植能增强MMP-9和MMP-2在成纤维细胞中的表达，提示羊膜在加快角膜碱烧伤后的重塑中起一定作用。     

羊膜移植对实验性单疱病毒角膜炎中MMP-9及TIMP-1表达的影响

目的探讨羊膜移植对单疱病毒性角膜炎中基质金属蛋白酶(MMP-9)及其抑制剂(TIMP-1)在小鼠角膜中的表达影响及意义。方法将40只Balb/c小鼠随机分为实验组和对照组,将5μL含有100×103pfuHSV-1病毒的DMEM滴于2组小鼠右眼划伤角膜表面建立单疱病毒性角膜炎模型,对实验组小鼠右眼角膜行羊膜移植术;对照组不行羊膜移植。在羊膜移植术后0、2d、7d、14d处死动物,用免疫组织化学染色方法和计算机图像分析系统检测2组小鼠MMP-9及TIMP-1在角膜中的分布及其平均光度值。结果羊膜移植组临床评分显示各时间点角膜上皮病变、角膜混浊和新生血管明显低于对照组。免疫组织化学染色对照组角膜中MMP-9在第2d出现表达,第14d达高峰。TIMl-1开始表达不明显,第7d出现表达,14d达高峰。羊膜移植组各时间点MMP-9表达低于对照组,而TIMP-1表达高于对照组。结论羊膜移植术可通过调节基质金属蛋白酶及其抑制剂的表达平衡,从而抑制和延迟HSV感染后单纯疱疹病毒性角膜炎的发生和发展。     

羊膜移植对兔角膜碱烧伤早期MMP-2和TIMP-2表达的影响

目的研究羊膜移植在兔角膜碱烧伤早期治疗中的作用机制。方法对60只新西兰白兔随机分为碱烧伤组、羊膜移植组及正常对照组,实验组建立角膜碱烧伤模型,羊膜移植组于烧伤后30min实施羊膜移植手术。术后14、30、60d,观察分析角膜病理组织学改变;并应用计算机图像分析系统对角膜组织中基质金属蛋白酶-2（Matrix metalloproteinase-2,MMP-2）和基质金属蛋白酶组织抑制剂-2（Tissue inhibitors of metalloproteinase-2,TIMP-2）的表达进行半定量测定。结果羊膜移植组角膜浸润及角膜基质坏死溃疡程度均较同期碱烧伤组为轻,角膜MMP-2的表达显著降低（P〈0.05）,而TIMP-2表达显著升高（P〉0.05）。结论羊膜移植可提高角膜TIMP-2表达的水平并抑制MMP-2的活性,从而在角膜碱烧伤的早期治疗中起到抑制角膜炎症和溃疡的作用。     

羊膜移植对实验性HSK中基质金属蛋白酶表达的影响

目的研究羊膜移植（AMT）对单纯疱疹性角膜炎（HSK）中基质金属蛋白酶（MMP-2，-9）表达的影响。方法40只BALB／c小鼠角膜感染Ⅰ型单纯疱疹病毒（HSV-1），实验组角膜行AMT。术后第0、2、7、14d取出角膜。常规病理切片、免疫组化染色和计算机图像分析检测角膜中MMP-2及-9的表达及平均光度值的变化。结果对照组20只鼠眼中17只发生HSK；AMT组仅有9只眼发生，差异有显著统计学意义（P〈0．01）。AMT组角膜上皮、基质病变程度及新生血管发生率明显低于对照组（P〈0．05）。免疫组化及图像分析显示对照组角膜细胞和浸润炎性细胞中表达的MMP-2及-9在第2d增加，14d时达高峰。AMT组各时间点MMP-2及-9表达低于对照组，差异有显著统计学意义（P〈0．05）。结论羊膜移植可能通过抑制角膜细胞及浸润的炎症细胞产生MMPs，从而抑制HSK的发生和发展。     

基质金属蛋白酶在实验性单纯疱疹性角膜炎中的分布表达

目的 明确角膜感染Ⅰ型单纯疱疹病毒(HSV—1)后基质金属蛋白酶(MMPs)及其组织抑制剂(TIMPs)在角膜中的分布。方法 HSV—1(KOS株)接种于BALB／c小鼠角膜上。分别收集正常眼球及感染后第2、7、14及28d的感染眼球行石蜡包埋，并应用抗MMP—2、—8、—9及TIMP—1、—2的抗体免疫染色角膜切片。结果 感染后第2d，MMP—2、—9及TIMP—1、—2的表达比未感染眼增加且表达主要位于浅表基质层及上皮下的炎性细胞中。感染后第14d及28d可见坏死性角膜炎及角膜溃疡形成，角膜基质中及浸润的炎性细胞中尤其是溃疡处可见MMP—2、—9及TIMP—1、—2表达显著增加。溃疡区域可见大量MMP—8阳性染色的中性粒细胞。结论 HSV—1角膜感染后由角膜细胞及浸润的炎性细胞分泌产生的MMPs对于上皮性角膜炎及溃疡形成过程可能起重要作用。     

PXN-pY31、PXN-pY118在小鼠角膜新生血管形成中的表达变化

目的　探讨Paxillin（PXN）-pY³¹、PXN-pY¹¹⁸在小鼠角膜碱烧伤后角膜新生血管形成过程中的表达变化。方法　取健康6~8周龄雄性C57BL6小鼠36只,均右眼建立角膜碱烧伤模型为实验组,左眼不作任何处理为对照组,观察碱烧伤后1 d、3 d、5 d、7 d、10 d、14 d 角膜新生血管情况,并行免疫组织化学染色;Western blot 检测实验组碱烧伤后1 d、3 d、5 d、7 d时PXN-pY³¹、PXN-pY¹¹⁸在角膜中的表达变化。结果　对照组角膜无新生血管生成,PXN-pY³¹、PXN-pY¹¹⁸在角膜中未见表达。实验组角膜新生血管长度、钟点数及面积随着碱烧伤后时间的延长均呈曲线样改变。免疫组织化学染色检测结果显示,实验组角膜中PXN-pY³¹、PXN-pY¹¹⁸的表达均较对照组增强,其动态过程与角膜新生血管的发展进程一致。Western blot检测结果示,实验组碱烧伤后3 d PXN-pY³¹,PXN-pY¹¹⁸的表达显著升高;碱烧伤后5 d,PXN-pY³¹、PXN-pY¹¹⁸的表达达到高峰;碱烧伤后7 d,PXN-pY³¹、PXN-pY¹¹⁸表达开始下降。碱烧伤后3 d、5 d、7 d时PXN-pY³¹、PXN-pY¹¹⁸的表达与碱烧伤后1 d相比,差异均有统计学意义（均为P<0.05）。结论　PXN-pY³¹、PXN-pY¹¹⁸在角膜损伤的病理机制中发挥作用,其表达变化与角膜新生血管的生长情况相关。     

水通道蛋白1在大鼠角膜碱烧伤新生血管形成中的表达

目的检测大鼠角膜碱烧伤后新生血管形成过程中水通道蛋白1（AQP1）的表达变化,探讨其在角膜新生血管（CNV）形成中的作用。方法碱烧伤诱导CNV模型,将25只sD大鼠按处死的时间点不同分成5组,每组5只。每日裂隙灯下观察CNV的生长情况,并采用免疫组织化学法和RT-PCR法检测AQP1及VEGF在大鼠CNV形成中的表达。结果在正常大鼠角膜组织中,AQP1和VEGF不表达或弱表达。碱烧伤后1d,AQP1表达开始增强,第7天表达最强,14d下降,21d时仍有弱表达。RT—PCR检测显示碱烧伤后AQP1表达增强,在伤后第7天表达最明显,21d后呈弱表达（t1d=3．491,t4d=10．690,t7d=12．936,t14d=10．767,t21d=8．594,P〈0．05）。免疫组织化学检测结果表明,VEGF与AQP1的表达分布相似,强度较弱,统计学分析表明二者的表达水平呈正相关（r=0．834,P〈0．05）。结论AQP1在碱烧伤后角膜巾的表达水平与新生血管的形成明显相关。     

GM6001对碱烧伤角膜组织中基质金属蛋白酶表达及活性的影响

目的 检测正常和碱烧伤后不同时间角膜组织中明胶酶(MMP-2，MMP-9)和胶原酶(MMP-1)的表达，探讨在角膜融解发生中的作用．方法 兔角膜碱烧伤20眼，分为对照组和GM600l治疗组，于伤后12、24、48、72h，1、2周和1个月取材，酶谱法检测角膜组织中明胶酶MMP-2、MMP-9的表达，Western blot检测胶原酶MMP-1的表达。结果 在正常兔角膜中，仅检测到微弱的明胶酶原MMP-2，碱烧伤后1周后开始明显升高，至烧伤后1个月维持较高水平，并在2周时出现MMP-2活性酶的表达，并持续至烧伤后1个月。明胶酶MMP-9在正常角膜组织中检测不到，但烧伤后24h开始表达，于烧伤后1周达到最高，然后逐渐下降，至伤后1个月已检测不到。胶原酶MMP-1在正常组织中检测为阴性，从伤后24h开始升高，1个月内无下降。GM6001治疗组角膜组织MMP-2、MMP-9及MMP-1的表达均明显低于对照组。结论 基质金属蛋白酶参与碱烧伤角膜组织的融解，GM6001可抑制MMPs的活性，进而抑制角膜融解的发生。     

碱烧伤小鼠角膜组织中SDF-1／CXCR4的表达及意义

目的探讨基质细胞衍生因子-1（SDF-1）和CXCR4在小鼠角膜碱烧伤新生血管形成中的作用。方法应用在角膜中央放置NaOH滤纸片的方法构建C57／BL小鼠角膜碱烧伤角膜新生血管动物模型,通过免疫组织化学、RT—PCR、Western blot法检测碱烧伤后不同时间点角膜组织中SDF-1和CXCR4 mRNA及蛋白的表达情况。结果免疫组织化学检测显示,正常小鼠角膜基质层无明显SDF-1的阳性表达,CXCR4仅在角膜上皮层呈弱阳性表达。RT—PCR检测显示,与正常对照组相比,碱烧伤后各时间点SDF-1和CXCR4 mRNA表达均明显升高（P〈0．05）;Western blot检测显示SDF-1和CXCR4蛋白的表达也可见相似的变化趋势（P〈0．05）。SDF-1和CXCR4在角膜中的表达于第7天达高峰,第14天开始下降,但仍高于正常。结论SDF-1／CXCR4在碱烧伤后小鼠角膜组织中的表达增加,在角膜碱烧伤的炎症和新生血管的形成和发展过程中可能发挥重要作用。     

骨髓间充质干细胞移植对兔碱烧伤角膜新生血管形成的抑制作用

目的　观察角膜碱烧伤兔行骨髓间充质干细胞（ｂｏｎｅｍａｒｒｏｗｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓ,ＢＭＳＣ）移植后不同时间受损角膜新生血管（ｃｏｒｎｅａｌｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ,ＣＮＶ）发生情况,探讨ＢＭＳＣ移植后对碱烧伤ＣＮＶ的抑制作用。方法　取日本大白兔２４只,随机分为实验组和对照组各１２只,实验组进行烧伤后ＢＭＳＣ移植,体外分离培养得到ＢＭＳＣ,制备中度角膜碱烧伤模型,随后行ＢＭＳＣ移植。对照组不进行移植。分别于移植后３ｄ、１４ｄ、２８ｄ观察ＣＮＶ生长状态、计算ＣＮＶ面积、采用ＲＴ-ＰＣＲ检测角膜中基质金属蛋白酶-２（ＭＭＰ-２）和肿瘤坏死因子α（ＴＮＦ-α）的表达情况。结果　ＢＭＳＣ贴壁生长,呈长梭形,ＣＤ９０呈现高表达（表达率９７．９４％）,ＣＤ３１低表达（表达率０．１５％）。ＢＭＳＣ移植后２８ｄ时实验组角膜较对照组明显透亮,新生血管面积显著减小（Ｐ＜０．０５）。ＢＭＳＣ移植后１４ｄ、２８ｄ,实验组ＭＭＰ-２基因条带的灰度值均低于对照组（均为Ｐ＜０．０５）,实验组ＭＭＰ-２ｍＲＮＡ表达低于对照组且１４ｄ时差异最明显（Ｐ＜０．０１）。ＢＭＳＣ移植后３ｄ,实验组ＴＮＦ-α基因条带灰度值较对照组低,实验组ＴＮＦ-αｍＲＮＡ的表达明显受到抑制,且两组间差异有统计学意义（Ｐ＜０．０５）;１４ｄ时,实验组ＴＮＦ-α基因表达仍低于对照组（Ｐ＜０．０５）,２８ｄ时实验组与对照组ＴＮＦ-αｍＲＮＡ表达量相当,差异无统计学意义（Ｐ＞０．０５）。结论　ＢＭＳＣ通过抑制ＭＭＰ-２的表达,减少细胞外基质的溶解,抑制ＣＮＶ的形成;通过降低炎性细胞因子ＴＮＦ-α的表达,减轻局部炎症反应,从而抑制ＣＮＶ的生长。