基于cDNA芯片的梨品种S基因型鉴定及新S-RNase基因进化分析

梨品种S基因型鉴定对梨栽培中授粉品种选择和遗传育种都具有重要意义。本研究利用梨S-RNase基因荧光标记的特异引物PCR扩增获得梨品种荧光标记的cDNA特异产物;进一步完善梨S-RNase基因cDNA芯片,以被检测梨品种cDNA特异序列与梨S-RNase基因cDNA芯片杂交检测不同梨品种S基因型,并发现新的S-RNase基因。结果表明:利用梨S-RNase基因cDNA芯片鉴定了泸定王皮梨、兴山24号、弥渡百合等35个未知S基因型梨品种,确定了各品种的S基因型。结合PCRRFLP及DNA克隆和测序等技术,发现了7个新的S-RNase基因资源,获得了新S-RNase基因序列。序列分析表明各新S-RNase基因均具有S-RNase基因特异区域序列的典型特征;进化分析显示7个新S-RNase基因主要属于蔷薇科苹果亚科S-RNase类群,且存在种间和属间比种内和属内进化关系更近的现象。7个新的S基因分别命名为:PpS_(53)(Pyrus pyrifolia S53)、PpS_(54)、PpS_(55)、PpS_(56)、PpS_(57)、PpS_(58)和PpS_(59),GenBank登录号分别为:KX581753、KX581754、KX581755、KX581756、KX581757、KX581751和KX581752。     

梨自交不亲和基因cDNA芯片杂交条件优化及应用

[目的]优化梨自交不亲和基因(S-RNase或S基因)c DNA芯片杂交条件,利用芯片检测梨品种S基因型。[方法]提取梨品种雌蕊RNA,Cy3标记引物RT-PCR获得S基因荧光标记特异c DNA序列。设置不同杂交条件,用已知S基因型品种荧光标记的PCR产物在不同条件下分别与芯片杂交,杂交信号分析芯片杂交效果。用芯片优化杂交体系鉴定梨品种未知S基因型,DNA测序验证芯片鉴定结果。[结果]芯片杂交最佳条件:杂交温度42℃,杂交时间8~9 h,PCR纯化产物终浓度为200 ng·μl-1。优化杂交条件下芯片鉴定晚咸丰、秀水、丽江马占梨1、湘菊、木通梨、甘甜、弥渡小红梨、丽江大中古、金晶和弥渡火把等梨品种S基因型分别为:Pp S15Pp S52、Pp S4Pp S5、Pb S22Pp S37、Pp S1Pp S2、Pp S1Pp S3、Pp S13Pp S15、Pp S12Pb S42、Pb S21Pb S22、Pp S3Pp S60和Pp S5Pp S5。DNA测序验证各品种所含S基因与芯片鉴定结果一致。[结论]梨自交不亲和基因c DNA芯片优化杂交条件后可准确鉴定梨品种所含已鉴定的S基因资源。     

梨自交不亲和基因cDNA芯片杂交条件优化及应用北大核心

[目的]优化梨自交不亲和基因(S-RNase或S基因)c DNA芯片杂交条件,利用芯片检测梨品种S基因型。[方法]提取梨品种雌蕊RNA,Cy3标记引物RT-PCR获得S基因荧光标记特异c DNA序列。设置不同杂交条件,用已知S基因型品种荧光标记的PCR产物在不同条件下分别与芯片杂交,杂交信号分析芯片杂交效果。用芯片优化杂交体系鉴定梨品种未知S基因型,DNA测序验证芯片鉴定结果。[结果]芯片杂交最佳条件:杂交温度42℃,杂交时间8~9 h,PCR纯化产物终浓度为200 ng·μl-1。优化杂交条件下芯片鉴定晚咸丰、秀水、丽江马占梨1、湘菊、木通梨、甘甜、弥渡小红梨、丽江大中古、金晶和弥渡火把等梨品种S基因型分别为:Pp S15Pp S52、Pp S4Pp S5、Pb S22Pp S37、Pp S1Pp S2、Pp S1Pp S3、Pp S13Pp S15、Pp S12Pb S42、Pb S21Pb S22、Pp S3Pp S60和Pp S5Pp S5。DNA测序验证各品种所含S基因与芯片鉴定结果一致。[结论]梨自交不亲和基因c DNA芯片优化杂交条件后可准确鉴定梨品种所含已鉴定的S基因资源。     

中国梨品种S基因型鉴定的初步研究

采用PCR技术和聚丙烯酰胺凝胶电泳法对6个中国梨品种的s基因型进行了鉴定研究,并与已知S基因型的日本梨品种进行了比较。研究结果表明,供试的6个中国梨品种S基因型均不相同,‘西子绿’、‘金花’和‘金水酥’各包含了S1～S7以外的新的S基因,为这些品种田间授粉品种的选配提供了参考。     

确定梨自交不亲和基因型研究的技术进展

综述了运用杂交授粉试验和分子生物学方法等技术确定梨品种自交不亲和基因型研究的技术进展,分析了这些技术在确定梨品种自交不亲和基因型方面的优点和不足之处,并初步探讨了研究前景。因为HV区氨基酸的不同,不同S基因型也有所差异。因此,除了在分子生物学的水平上进行研究外,其他方法如mRNA、蛋白质和杂交授粉等水平上的研究在确定S基因型上也同样重要。     

白梨和砂梨S基因型确定及S34新基因的分离

梨是配子体型自交不亲和植物, 确定不同品种的S基因型是科学杂交授粉及提高梨产量和品质的基础。本文根据砂梨S1-9等位基因一级结构特征, 设计特异引物PF和PR, 以白梨(Pyrus bretschneideri)品种鹅梨(Pyrus bretschneideri ‘El i’) 和砂梨(Pyrus pyrifolia)品种博多青(Pyrus pyri folia ‘Hakataao’) 的叶片基因组DNA为模板, 通过 PCR-RFLP系统检测、克隆测 序以及生物信息学分析, 分离鉴定了它们的片段大小相似的2条S等位基因, 从中获得1条新的S基因, 命名为S34-RNase基因, 并确定了这2个梨品种的S基因型, 分别为鹅梨S13S34和博多青S22S34。     

白梨和砂梨S基因型确定及S34新基因的分离

梨是配子体型自交不亲和植物,确定不同品种的S基因型是科学杂交授粉及提高梨产量和品质的基础。本文根据砂梨S1-9等位基因一级结构特征,设计特异引物PF和PR,以白梨（Pyrus bretschneideri）种鹅梨（Pyrus bretschneideri‘Eli’）和砂梨（Pyrus pyrifolia）品种博多青（Pyrus pyrifolia‘Hakataao’）的叶片基因组DNA为模板,通过PCR·RFLP系统检测、克隆测序以及生物信息学分析,分离鉴定了它们的片段大小相似的2条S等位基因,从中获得1条新的S基因,命名为S34-RNase基因,并确定了这2个梨品种的S基因型,分别为鹅梨S13S34和博多青S22S34。     

能否设计病原体毒力基因来防治疾病?

植物病原体会使农民的生活发生困难,但植物育种工作者能鉴定并将抗病基因引入所需作物栽培品种。这种方法是至今可以利用的一种重要的疾病防治方法。不过,正同植物有抗性基因一样,病原体有毒性基因,可以鉴定出这些基因,且改变这些基因可影响宿主一病原体相互作用的结果。     

梨DREB基因家族全基因组鉴定及分析

本研究为鉴定梨DREB基因,分析其生理特性和结构,并研究DREB蛋白的相互作用以及在不同逆境中的表达差异,通过生物信息学方法,对梨DREB转录因子进行了鉴定与分析。如利用本地BLAST、Pfam等搜索、鉴定DREB蛋白;采用Protparam、Signal P、SPOMA、MEME数据库、DNAMAN、MEGA6.0等对蛋白进行结构特性和进化关系分析;基于String数据库对DREB蛋白进行功能互作分析;并运用拟南芥Illumia RNA-Seq数据进行同源表达分析。从梨全基因组中鉴定了60个DREB基因,通过与拟南芥DREB基因聚类分析,共分为6个亚组(A1~A6)。编码的氨基酸残基数在99~496个之间,平均含有250个氨基酸残基,整体呈弱酸性。系统分析了Pbr DREBs蛋白的保守基序和基因结构,发现这些Pbr DREBs蛋白都含有一个典型的AP2/ERF结构域,这个结构域含有55个左右的氨基酸残基,大部分以YRG保守元件开始,到RAYD保守元件终止。对Pbr DREBs蛋白之间的功能联系网络进行了系统的研究,发现DREB转录因子在梨的生长发育过程及其多种逆境反应的信号转导中发挥着重要作用,且在逆境调控中各亚组成员之间也可能存在交叉作用,其中,A1亚组即CBF转录因子在蛋白质相互调控中起重要作用。并利用同源拟南芥RNASeq数据对Pbr DREBs蛋白进行了低温、干旱等非生物胁迫下的同源分析,表明DREB蛋白在多种胁迫中都起到了重要作用。初步鉴定出的梨60个DREB基因在功能、结构、特性等方面与拟南芥及其它已报道的物种DREB基因相似,并在低温、干旱等逆境中起到重要作用。     

应用ISSR指纹图谱鉴定上饶早梨3个主栽品种及其不同继代次数试管苗

为鉴定上饶早梨3个主栽品种("花厅六月雪","花厅黄皮消"和"田墩六月雪")的亲缘关系以及其不同继代次数试管苗的遗传变异,本研究应用筛选出的9条ISSR引物对上饶早梨3个主栽品种20份样本进行分子标记分析。结果显示,9条引物共获得47条清晰可辨条带,其中多态性条带24条,平均多态性比率为51.06%,平均每对引物扩增出4.7条带,其中2.4条具有多态性。其中,引物CW32438多态性最高,为100.00%,引物CW32466多态性最低,只有20.00%。20个样品的GS值范围为0.617 3~1.000 0,平均值为0.806 6,变幅为0.382 7。UPGMA法聚类分析结果表明,在GS值为0.817 7处,可将上饶早梨主栽品种分为两类,"花厅六月雪"和"花厅黄皮消"为第Ⅰ类,"田墩六月雪"为第Ⅱ类。根据引物扩增位点的特异性,挑选了5条核心引物,并依据其扩增模式图进行编码组合,构建了上饶早梨3个主栽品种的DNA分子指纹图谱。利用这些指纹图谱的差异,可鉴定上饶早梨主栽品种的归属地。上饶早梨3个主栽品种继代8~13次的试管苗虽然存在一定程度的变异,但这种遗传差异无显著性,说明通过带芽茎段对上饶早梨3个主栽品种进行离体快繁可保证其遗传稳定性。     

生物工程育种的新方法——基因枪

基因枪作为一种将外源基因射入植物细胞的工具,在生物工程育种中正在引起广泛的重视。科学家们认为,可以采用这种方法向发展中国家很快地提供廉价、抗虫的基因工程水稻。美国威斯康星大学的科学家们已经使用这种技术首次改变了某些印度水稻品种的基因组成。他们希望在不久的将来得到广谱抗虫、抗病,甚至抗 Tungro 病毒的水稻新品种。这种病毒在东南亚、印度和中国能引起水稻毁灭性的病害。此     

马铃薯WOX基因家族的鉴定及在离体再生和非生物胁迫中的表达分析

【目的】WUSCHE-相关同源盒（WUSCHEL-related homeobox, WOX）基因家族是植物特有的转录因子家族,在植物生长发育、干细胞分化调控、逆境胁迫响应等过程中扮演重要角色。开展马铃薯WOX基因家族鉴定与功能研究,将为马铃薯遗传改良提供优良基因资源与理论依据。【方法】基于拟南芥、番茄、烟草和水稻WOX蛋白序列,利用HMMER 3.0和BLASTP鉴定马铃薯WOX基因家族成员,使用MCScanX软件分析WOX基因家族成员在马铃薯种内及种间的共线性,并采用邻接法构建系统发育进化树。利用ExPASy、GSDS等软件分析马铃薯WOX基因家族成员理化性质、基因结构、蛋白motif、启动子区域转录因子结合位点。基于PGSC数据库中马铃薯转录组数据,分析StWOXs在不同组织和非生物胁迫下的表达模式;以可能参与离体再生过程的StWOX5作为候选基因,利用实时荧光定量PCR技术分析该基因在具有不同离体再生能力的4个马铃薯品种（系）再生过程中的表达情况。【结果】鉴定得到11个马铃薯WOX基因家族成员,分布在5条染色体上,分为WUS、中间和古老共3个进化分支,不同分支中StWOXs基因...     

梨萜类合成酶基因家族生物信息学与表达模式分析

萜类合成酶(Terpene synthases,TPS)是萜类化合物合成过程中的关键酶。基于梨(Pyrus bretschneideri)全基因组数据库,采用生物信息学和分子生物学方法,对梨TPS基因家族进行鉴定和亚家族分类,研究梨TPS基因的结构及编码蛋白质性质和表达模式。共鉴定获得33个萜类合成酶基因家族成员,聚类为5个亚家族,其中,TPS-a亚家族成员数量最多,包含4-7个外显子;主要定位于细胞质,少数分布在线粒体、叶绿体和内质网等;梨TPS蛋白均为亲水性蛋白,α-螺旋和无规卷曲是其二级结构主要组成元件,β-折叠和延伸链散布其中;TPS-a中保守基序个数相对较多,TPS-e/f相对较少;各亚族内蛋白质在三级结构上高度相似。除PbrTPS24外,其余9个TPS基因在根、茎、幼叶和幼芽中均有表达,并且不同的基因在不同部位高表达,PbrTPS存在组织特异性表达。     

梨小食心虫生物钟基因Gmper和Gmtim的鉴定及其对羽化节律的影响

【目的】本研究旨在探究梨小食心虫Grapholita molesta生物钟基因Gmper和Gmtim的分子特性与表达模式,分析其对羽化节律的调控作用,为梨小食心虫的防控提供潜在新靶标。【方法】根据梨小食心虫转录组数据,采用PCR技术克隆生物钟基因Gmper和Gmtim的cDNA全长;利用RT-qPCR测定这两个基因在梨小食心虫成虫头、胸、腹和足中的表达量,及其在蛹头部中的日表达模式;应用siRNA进行RNAi技术分析Gmper和Gmtim在梨小食心虫羽化节律中的作用。【结果】克隆获得梨小食心虫Gmper基因(GenBank登录号:MN862636)和Gmtim基因(GenBank登录号:MN862637)全长cDNA。Gmper基因开放阅读框长2 862 bp,编码953个氨基酸,序列中含2个PAS结构域和1个PAC结构域;Gmtim开放阅读框长3 048 bp,编码1 015个氨基酸。Gmper和Gmtim在雌雄成虫头部中的表达水平均高于其他组织中的;蛹期头部两基因在暗期的表达水平显著高于光期的。RNAi下调这两个基因的表达均导致梨小食心虫羽化时间更加分散以及羽化高峰期的羽化成虫数量显著降低。【结论】梨小食心虫生物钟基因Gmper和Gmtim具有组织和昼夜表达差异性,两基因对梨小食心虫羽化节律的调控有重要作用。研究结果为开发基于发育行为节律调控的梨小食心虫监测和防控方法提供了新线索。     

梨种质资源对黑星病抗性评价

采用人工接种黑星病菌的方法,对国家果树种质兴城梨资源圃保存的197份梨种质资源进行了抗病性鉴定,结果表明:不同梨种类发病率差异很大,其中白梨和砂梨最易感病,秋子梨和种间杂交选育品种较易感病,新疆梨较抗病,西洋梨最抗病;对病情指数在各梨种类分布进行了分析;在白梨、砂梨、秋子等各系统分别筛选出黄鸡腿、甩梨、酸梨、锦香等一批抗病资源;对田间自然感病与人工接种感病结果进行了比较。     

‘黄花’梨及其芽变‘绿黄花’梨HHT基因克隆与表达分析

该试验以砂梨品种‘黄花’梨（果皮褐色）及其芽变‘绿黄花’梨（果皮绿色）盛花后第8周的果皮为试材,利用常规PCR和巢式PCR技术克隆了ω 羟基棕榈酸O 阿魏酰转移酶（ω hydroxypalmitate O feruloyl transferase, HHT）基因cDNA的全长,命名为 PpyHHT（登录号为KX131155）。序列分析结果表明,该基因开放阅读框（ORF）为1 335 bp,编码444个氨基酸。生物信息学分析显示,推定的PpyHHT蛋白质相对分子质量为49.91 kD,等电点是4.75,与白梨相似性高达98%,亲缘关系最近。实时荧光定量PCR（qRT PCR）表达分析显示,2种梨果皮中 PpyHHT基因在盛花后6~9周的4个转色关键期表达量不断变化,在‘黄花’梨果皮中的表达量明显高于‘绿黄花’梨。推测 PpyHHT基因可能参与砂梨果实褐色/绿色性状的形成。     

ITS2序列在植物DNA条形码鉴定中的应用(综述)

DNA条形码技术的迅速发展极大地推动了植物的鉴定工作,随着鉴定工作的不断进行和新序列的不断发现,利用ITS2序列进行鉴定已成为目前较为广泛使用的鉴定技术。本文根据ITS2序列的特点和性质,介绍ITS2序列鉴定的一般过程,并分析其特点和存在问题,以期为植物鉴定方面的研究提供参考。     

菌物DNA条形码技术原理与操作

DNA条形码技术是通过对1个较短目的基因的DNA序列进行分析从而进行物种鉴定的方法,它通过对1个或多个相关基因进行大范围的扫描,进而鉴定未知物种或者发现新种。当传统的分类学受到阻碍时,这种技术可以发挥其优势。相对于其他生物,菌物的生活史独特而复杂,这就使得对其进行的形态学鉴定要受到菌物自身生长发育时期的限制。国内外科学家对寻找适合于大多数菌物的标准DNA条码进行过探索,但还没有找到满足全部特征的基因片段。文中对DNA条形码技术的概念、原理依据、操作步骤和优缺点方面进行了介绍,并对DNA条形码技术在我国菌物研究方面的应用前景进行了展望。     

畜禽生产性状主效基因定位技术与方法研究进展

鉴定畜禽重要生产性状形成的关键遗传因子,揭示其产生的分子遗传机制,对动物新品种的培育及特色遗传资源的开发利用具有重要意义。高通量分析技术诞生前,标记数量性状位点(quantitative trait loci,QTL)连锁分析和候选基因分析法作为鉴定畜禽生产性状QTL和主效基因主要方法,但由于其技术局限性,性状因果基因鉴定的效率并不高。人类基因组计划(human genome project, HGP)开启了以大数据为特征的生命科学研究的序幕,在HGP完成后的20余年间,快速发展的高通量分析技术使人们研究生物学问题的思路和方法发生了巨大改变。本综述就近年来被广泛用于畜禽重要性状的候选基因定位的方法与技术进行了较全面的综述,以期为同行提供参考。     

砀山酥梨TCP基因家族全基因组鉴定与分析

TCP蛋白是植物特有的转录因子家族之一,在植物生长和发育等多个过程起到重要作用。本研究利用生物信息学方法对砀山酥梨TCP基因家族成员、染色体定位、进化分析、亚组分类、保守域结构和保守元件进行了相关分析。结果显示,梨TCP基因家族含有34个成员;进化分析表明,根据进化树拓扑结构将其分为两类:ClassⅠ和ClassⅡ,其中ClassⅡ可被分为CYC/TB1和CIN两个小组。结构域分析表明,梨TCP基因家族TCP结构域高度保守;保守元件分析表明,梨TCP基因家族包含5个保守元件:元件1是TCP保守域;元件2为R结构域,元件3、4和5为功能尚未鉴定的结构域,所有梨TCP蛋白都含有元件1,ClassⅡ组中CYC/TB1小组包含特异元件2。以上结果将为今后揭示梨TCP基因的功能提供重要的理论基础。