基于秀丽隐杆线虫的化学品毒性评估技术研究进展

将模式生物毒性预筛与传统啮齿类动物实验相结合是今后国际化学品毒性筛检和安全性评估领域的发展方向.应用模式生物秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)进行化学品急性毒性评估的指标分为致死性指标和亚致死性指标,其中,致死性指标包括半数致死浓度和半数致死时间,亚致死性指标包括生长、发育、繁殖及运动、行为等指标.基于转基因线虫的生物标志物指标提高了检测灵敏度,近年来发展了使用微流控芯片及复杂目标参数分析和分选系统等的高通量、快速化学品毒性评估技术.该文对上述研究进展作一综述.     

壬基酚对秀丽隐杆线虫的生殖毒性

目的研究壬基酚(nonylphenol,NP)对秀丽隐杆线虫的生殖毒性。方法将秀丽隐杆线虫暴露于终浓度分别为含0(溶剂对照)、0.01、0.1、1、10、100mg/LNP的培养基24 h,并设空白对照。检测NP对线虫的半数致死浓度(LC50)、后代数目、世代时间和精子发生相关基因spe-10、spe-15、folt-1、fer-1 mRNA的表达水平。结果 NP对线虫的LC50远高于100 mg/L。与溶剂对照组比较,各浓度NP暴露组秀丽隐杆线虫世代时间延长,差异均有统计学意义(P0.05);而后代数目无明显改变;且随着NP暴露浓度的升高,秀丽隐杆线虫世代时间呈延长趋势,后代数目呈下降趋势。与溶剂对照组比较,仅1、100 mg/L NP暴露组秀丽隐杆线虫spe-10 mRNA的表达水平降低,差异均有统计学意义(P0.05);而各浓度NP暴露组秀丽隐杆线虫spe-15、folt-1、fer-1 mRNA的表达水平均无明显改变;且随着NP暴露浓度的升高,秀丽隐杆线虫spe-10、folt-1、fer-1 mRNA的表达水平呈下降趋势。结论 NP抑制线虫精子发生相关基因spe-10的表达,对后代数目和世代时间影响较小,本实验结果表明运用线虫模型评价NP的生殖毒性,其基因表达的改变先于表型指标。     

新型饮用水氯化消毒副产物二氯苯醌对秀丽隐杆线虫的毒性

目的 研究饮用水氯化消毒副产物二氯苯醌对秀丽隐杆线虫的毒性作用.方法 以秀丽隐杆线虫为模式生物,分别进行二氯苯醌的急性致死作用实验[0(溶剂对照)～5 000 μmol/L暴露24、48 h]、发育毒性实验[0(溶剂对照)～1 000μmol/L暴露60 h]、生殖毒性实验[0(溶剂对照)～50 μmol/[].检测秀丽隐杆线虫的24、48 h死亡率、体长和产卵数目.结果 与溶剂对照组比较,31.25～1 000 μmol/L二氯苯醌暴露组秀丽隐杆线虫体长均较小,各浓度二氯苯醌暴露组秀丽隐杆线虫的24、48 h死亡率均较高,6.25～50 μmol/L二氯苯醌暴露组秀丽隐杆线虫产卵数目均较少,差异均有统计学意义(P＜0.05,P＜0.01);且随着二氯苯醌暴露浓度的升高,秀丽隐杆线虫体长呈缩短趋势,24、48 h的死亡率均呈上升趋势,产卵数目呈下降趋势.二氯苯醌对秀丽隐杆线虫24 h的LC50为660.34 μmol/L,95％C1为498.93～887.09 μmol/L;48 h的LC50为458.88 μmol/L,95％CI为324.04～624.00 μmol/L.结论 新型饮用水氯化消毒副产物二氯苯醌对秀丽隐杆线虫的生长发育以及生殖系统都有不良影响.     

砷对秀丽隐杆线虫糖代谢的影响

目的观察慢性砷暴露对秀丽隐杆线虫糖代谢的影响,并探讨其作用机制。方法将同步化后的线虫分别暴露于含0(对照)、5、50μmol/L亚砷酸钠的M9缓冲液中72 h。采用高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)法进行代谢组学检测,运用偏最小二乘判别分析(PLS-DA)分析比较砷暴露组和对照组线虫代谢产物的差异,并筛选出有意义的差异代谢物,利用京都基因与基因组百科全书(KEGG)查找其影响的相关代谢通路。测定线虫体内葡萄糖水平及糖酵解、糖原合成和分解、糖异生途径相关基因的表达情况。结果 PLS-DA分析显示,暴露组与对照组线虫代谢特征存在差异,砷暴露组中葡萄糖-6-磷酸表达量降低,差异具有统计学意义(P0.05)。50μmol/L亚砷酸钠暴露组线虫体内葡萄糖的含量高于对照组,差异有统计学意义(P0.05);且随着亚砷酸钠暴露浓度的升高,线虫体内葡萄糖水平呈上升趋势。与对照组相比,各浓度亚砷酸钠暴露组线虫体内糖酵解途径相关基因己糖激酶(hxk-2)、6-磷酸果糖激酶(pfk-1.1)和丙酮酸激酶(pyk-1)mRNA的表达水平均降低,差异有统计学意义(P0.05);且随着亚砷酸钠暴露浓度的升高,线虫体内hxk-2、pfk-1.1mRNA的表达水平均呈下降趋势。与对照组相比,各浓度亚砷酸钠暴露组线虫体内糖原合成相关基因糖原合酶(gsy-1)mRNA的表达水平均降低,而糖原分解相关基因糖原磷酸化酶(pygl-1)mRNA的表达水平均升高,差异均有统计学意义(P0.05);且随着亚砷酸钠暴露浓度的升高,线虫体内gsy-1 mRNA的表达水平呈下降趋势,而pyg1-1 mRNA的表达水平呈上升趋势。与对照组相比,各浓度亚砷酸钠暴露组线虫体内糖异生途径相关基因磷酸烯醇式丙酮酸激酶(pck-1)mRNA表达水平降低,而50μmol/L亚砷酸钠暴露组线虫体内果糖二磷酸酶-1(fbp-1)mRNA的表达水平升高,差异均有统计学意义(P0.05);且随着亚砷酸钠暴露浓度的升高,线虫体内pck-1 mRNA的表达水平均呈下降趋势。结论慢性砷暴露可通过影响糖代谢相关酶的表达导致线虫糖代谢紊乱。     

秀丽隐杆线虫神经毒理学研究进展

秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans,简称C.elegans或线虫)是神经毒理学及神经退行性疾病研究的适宜模型.C.elegans的神经系统有6 393个化学突触,890个电连接,1 410个神经肌肉连接,有302个神经元,分成118类.C.elegans的主要神经递质系统(胆碱能、γ-氨基丁酸能、谷氨酸能、多巴胺能、5-羟色胺能)和遗传传递网络(从神经递质代谢到囊泡循环和突触传递)在系统发生上都高度保守,使得在C.elegans中的科研发现可以外推到脊椎动物.通过激光束破坏某个神经元或突触、使用药物或其他外部刺激可以设计实验来明确特定神经元功能.如抑制型氨基丁酸能和兴奋型乙酰胆碱能运动功能通过定量正弦波运动(身体扭曲幅度和频率)和觅食行为来确定;谷氨酸能神经元的运动和机械感受功能通过咽泵运动速率和对触摸的反应来评估.通过转基因、突变体筛选等方法,人们已成功制备C.elegans的人类神经系统退行性疾病模型[1].现就C.elegans的神经毒理学研究进展综述如下.     

二氯苯醌对秀丽隐杆线虫胚胎细胞DNA的损伤作用

目的研究新型饮用水氯化消毒副产物二氯苯醌对秀丽隐杆线虫胚胎细胞的DNA损伤作用。方法提取秀丽隐杆线虫的胚胎细胞,分别暴露于0(溶剂对照)、0.781 25、3.125、12.5、50、200、800μmol/L含二氯苯醌的L-15液体培养基染毒1 h,并设阳性对照(含300μmol/L过氧化氢的L-15液体培养基染毒15 min)。采用单细胞凝胶电泳技术测定DNA损伤情况。结果 3.125~800μmol/L二氯苯醌暴露组彗星实验Olive尾矩值均高于溶剂对照组,差异有统计学意义(P0.05,P0.01);且随着二氯苯醌暴露浓度的升高,秀丽隐杆线虫胚胎细胞Olive尾矩呈上升趋势。结论二氯苯醌对秀丽隐杆线虫胚胎细胞的DNA具有损伤作用。     

山楂提取物延缓秀丽隐杆线虫衰老作用的研究

目的以秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans,C.elegans)为对象研究山楂提取物(haworth fruit extract,HFE)延缓衰老作用及其可能的作用机制。方法将秀丽隐杆线虫饲喂于含有不同浓度(0、25、50、100μg/ml)山楂提取物的NGM培养基,用计数法统计线虫的平均、最高寿命及繁殖能力,用荧光法观察脂褐素的自发荧光强度,DCFDA探针法检测ROS水平,试剂盒法测定SOD活力,用PCR法检测抗氧化相关基因mRNA表达量。结果饲喂HFE后,线虫表寿命明显延长,繁殖能力显著下降。线虫的脂褐素自发荧光明显减弱,并且与HFE浓度呈剂量依赖效应。线虫的体内ROS水平也显著减少,50、100μg/ml组线虫体内SOD活力显著提高,let-60、cat-1、daf-16、cdc-42、sir-2.1 mRNA的表达水平显著上调,daf-2 mRNA表达水平显著下调。结论山楂提取物可有效延缓衰老,其机制主要涉及提高线虫抗氧化防御系统功能、调控体内内源性抗氧化基因mRNA的表达水平。     

秀丽隐杆线虫作为研究病原细菌致病机制的新模型

秀丽隐杆线虫以其背景资料丰富、便于操作和观察、廉价等特点,成为用来尝试研究病原细菌的新模型。目前已经将秀丽隐杆线虫作为模式生物,应用于铜绿假单胞菌、粪肠球菌、金黄色葡萄球菌、痢疾杆菌、绿脓杆菌、耶尔森菌、李斯特菌、沙门菌、类鼻疽假单胞菌、化脓性链球菌、鼠伤寒沙门菌、苏云金芽孢杆菌、粘质沙雷菌、隐球菌、细小棒状杆菌等多种病原菌,来研究病原菌的毒力因子、致病机制、与宿主相互作用、生物膜形成、耐药等各个方面。秀丽隐杆线虫以细菌为食,使其以病原菌为食后生存曲线的变化作为判断病原菌致病性的具体方法。     

纳米二氧化钛毒性线虫模式生物评价

目的 利用模式生物—秀丽隐杆线虫探讨二氧化钛(TiO₂)纳米颗粒的毒性作用,为建立线虫作为毒理学评价模型提供试验依据。方法 采用5,35,300 nm等3种粒径的二氧化钛对秀丽隐杆线虫以0.1,1.0,10.0 μg/L等3个浓度染毒24 h,应用世代时间、后代数目、头部摆动频率和身体弯曲频率及体长等生殖、运动和发育的相关指标对纳米二氧化钛毒性作用进行综合评价。结果 与对照组比较,暴露于5 nm TiO₂的线虫在中高浓度暴露组均出现生殖、运动和发育等多系统的异常(P<0.05);而暴露于35 nm TiO₂的线虫仅在高浓度暴露组出现生殖、运动等指标的异常(P<0.05);暴露于300 nmTiO₂时高浓度暴露组的线虫出现身体弯曲频率降低(P<0.05),其他浓度组未出现差异有统计学意义的改变。结论 纳米TiO₂暴露可影响秀丽隐杆线虫运动、生殖和发育等多种系统,并与粒径和暴露浓度有关。     

叶酸代谢基因缺失对ALS线虫运动能力影响

目的 了解5-甲酰四氢叶酸环连接酶（ Y106G6E.4）、蛋氨酸合成酶（ R03D7.1）和四氢叶酸脱氢酶（Dao-3）基因突变对肌萎缩侧索硬化症（ALS）秀丽隐杆线虫运动能力的影响。方法 通过与N2株系杂交获得单拷贝G85R:YFP雄虫,分别与VC2322（Y106G6E.4）、RB755（R03D7.1）和VC1197（Dao-3）突变株系回交,单线虫PCR法鉴定后代三突变基因纯合性,荧光鉴定超氧化物歧化酶Sod1（G85R）基因纯合的双突变体,光镜下观察双突变体在NGM平板上的爬行距离及在M9培养液中的摆动次数。结果 成功构建了G85R/VC2322、G85R/RB755和G85R/VC1197 三个双突变体,经PCR和荧光鉴定表明其相应的基因型均为纯合型;与ALS模型线虫比较,双突变体线虫G85R/VC2322、G85R/RB755和G85R/VC1197每分钟摆动次数[（14.6±2.39）、（17.4±2.23）、（10.2±1.64）]和相对爬行距离[（22.25±3.59）、（23.25±3.30）、（21.5±2.07）]均减小,且差异均有统计学意义（均P<0.05）。结论 体内叶酸代谢相关基因改变将进一步损伤ALS线虫的运动能力,为深入探讨叶酸代谢途径在ALS发生发展中的作用奠定基础。     

Holothuria scabra extracts exhibit anti-Parkinson potential in C. elegans: A model for anti-Parkinson testing

Objectives: Parkinson's disease (PD) is associated with aggregation of α-synuclein and selective death of dopaminergic (DA) neurons in the substantia nigra, thereby leading to cognitive and motor impairments. Nowadays, the drugs commonly used for PD treatment, such as levodopa, provide only symptomatic relief. Therefore, seeking new drugs against PD, especially from plants and marine organisms, is one of the major research areas to be explored. This study aimed to investigate the anti-Parkinson activity of the extracts from the sea cucumber, Holothuria scabra, by using Caenorhabditis elegans as a model.

Methods: H. scabra was solvent-extracted and subdivided into six fractions including whole body-ethyl acetate (WBEA), body wall-ethyl acetate (BWEA), viscera-ethyl acetate (VIEA), whole body-butanol (WBBU), body wall-butanol (BWBU), and viscera-butanol (VIBU). The extracts were tested in C. elegans BZ555 strain expressing the green fluorescent protein (GFP) specifically in the DA neurons and NL5901 strain expressing human α-synuclein in the muscle cells.

Results: WBEA, BWEA, and WBBU fractions of H. scabra extracts at 500?µg/ml significantly attenuated DA neuron-degeneration induced by selective cathecholamine neurotoxin 6-hydroxydopamine (6-OHDA) in the BZ555 strain. Moreover, the extracts also reduced α-synuclein aggregation and restored lipid content in NL5901, as well as improved food-sensing behavior and prolonged lifespan in the 6-OHDA-treated wild-type strain.

Discussion: The study indicated that the H. scabra extracts have anti-Parkinson potential in the C. elegans model. These findings encourage further investigations on using the H. scabra extract, as well as its active constituent compounds, as a possible preventive and/or therapeutic intervention against PD.     

断肠草提取物对小鼠的急性毒杀研究

目的探讨断肠草提取物对小鼠的毒力作用。方法灌胃法。结果断肠草提取物对小鼠具有很强的毒杀作用。一次性注射0.5 ml、浓度为0.003、0.004、0.005 g/ml的断肠草提取物时,小鼠在30 min内的死亡率分别为8.33%、41.67%、100%。同时,断肠草提取物对小鼠的毒杀作用迅速。当浓度为0.005 g/ml时,小鼠在20 min内全部死亡,平均致死时间为12.8 min;浓度为0.004 g/ml时,试鼠在28 min内死亡了5只,剩余的2 d内未见死亡;浓度为0.003 g/ml,试鼠在16 min时死亡1只,剩余的2 d内仍未见死亡。中毒小鼠均表现出活动迟缓,步伐不稳,身体抽搐,肤色变黑等一些症状。结论断肠草提取物对小鼠毒杀作用显著,所需剂量少,致死时间短,为开发植物性灭鼠剂提供了技术参考。     

汞的毒性效应及作用机制研究进展

汞是人体非必需元素,它可以多种物理和化学形态广泛存在于自然界中。通过不同途径进入人体的汞及其化合物能够引起以神经系统和肾脏为主的多系统损害。目前,随着汞在生产和生活中的广泛应用,人们对其引起的健康危害日益关注。为了更好的了解汞及今后更加深入的进行研究,本文对汞的毒性效应及作用机制做一概述。     

基于秀丽线虫发育时期敏感性差异进行的环境暴露安全性评价研究进展

目前,模型动物秀丽线虫已经广泛应用于环境安全评价和环境毒理研究。本文系统综述基于致死率、生殖、运动行为、神经元存活与发育、神经突触活性、肠道自发荧光、应激反应等评价终点进行的秀丽线虫各个发育时期对于环境暴露敏感性差异的研究进展,并总结现有的3种用于分析秀丽线虫各个发育时期对于环境暴露敏感性的方法,进而讨论基于秀丽线虫发育时期的敏感性差异进行环境暴露安全性评价研究中尚存在的问题以及可能的解决策略。     

阿维菌素对几种淡水水生动物的急性毒性作用

目的 探讨阿维菌素对几种水生动物的急性毒性作用,为制订阿维菌素对淡水水生动物安全浓度的阈值提供参考依据.方法 采用换液法对蚤状潘、异育银鲫鱼种(鱼苗)、食蚊鱼、鲢鱼苗、青虾、幼蟹、圆田螺进行急性毒性实验,蚤状溞染毒48 h,其余水生动物染毒96 h.将每种实验动物495尾(只)随机分为11个组,分别为9个浓度组、1个空白对照组和1个乙醇(助溶剂)组,每组15尾(只)实验动物.平行3次.观察并记录动物死亡数,并计算24、48、72和96h的半数致死浓度(median-lethal concentration,LC_(50))和安全浓度(safety concentration,SC).结果 实验期间,蚤状溞、异育银鲫鱼种(鱼苗)、食蚊鱼、鲢鱼苗、青虾、幼蟹、圆田螺的死亡率均随处理时间的延长和阿维菌素浓度的增大而升高.阿维菌素对蚤状溞48 h的LC_(50)和安全浓度分别为0.000 37和0.000 037 mg/L,对异育银鲫鱼苗和鱼种、食蚊鱼、鲢鱼苗、青虾、幼蟹、圆田螺96 h的LC_(50)分别为0.018、0.06、0.08、0.02、0.52、0.25、0.57 mg,L,安全浓度分别为0.001 8、0.006、0.008、0.002、0.052、0.025、0.057 mg/L.阿维菌素对7种淡水水生动物的毒性依次为:蚤状溞＞异育银鲫鱼苗＞鲢鱼苗＞异育银鲫鱼种＞食蚊鱼＞幼蟹＞青虾＞圆田螺.结论 阿维菌素对水生动物具有较强的毒性.     

疑似有毒饮料的应急检测

目的对疑似有毒饮料样品进行消毒剂有效化学成分排查后,进行应急毒性检测和评价。方法采用啮齿类动物小鼠急性经口毒性试验、秀丽隐杆线虫急性毒性试验、细胞毒性试验(中性红法)对受试样品进行毒性检测评价,采用化学成分定性排查方法对受试样品进行消毒剂有效化学成分排查。结果疑似有毒饮料样品小鼠急性经口毒性试验,经口灌胃给予40 ml/kg BW后受试动物均出现不同程度的中毒表现,3 d内2/5的小鼠出现死亡;秀丽隐杆线虫毒性试验,在0 mg/ml、1.00 mg/ml、2.15 mg/ml、4.64 mg/ml、10.00 mg/ml浓度下染毒24 h后,线虫出现死亡,LC50为3.4 mg/ml,具有毒性;受试物的CHL哺乳动物细胞毒性试验结果为3级,为中度毒性;化学成分定性排查显示疑似有毒饮料中含次氯酸钠。结论疑似有毒饮料样品的急性毒性检测结果显示受试小鼠出现不同程度的中毒表现及死亡;秀丽隐杆线虫毒性试验结果为有线虫毒性;CHL细胞毒试验结果为有细胞毒性。通过对疑似有毒饮料样品的一般性状及消毒剂有效化学成分排查,明确了疑似有毒饮料样品中含次氯酸钠,由于84消毒液等消毒剂的有效成分是次氯酸钠,故初步判断样品中可能混有84消毒液或次氯酸钠化学试剂。