二甲基亚砜在人红细胞冻干前负载海藻糖过程中的作用

目的研究人红细胞冻干保存前负载海藻糖过程中二甲基亚砜(DMSO)的作用,优化红细胞负载缓冲液配方。方法实验组以浓缩红细胞25份(10ml/份)负载海藻糖,负载缓冲液中添加DMSO;对照组25份负载海藻糖,负载缓冲液中未添加DMSO。37℃条件下孵育8h后,分别检测两组红细胞胞内海藻糖负载量、胞外游离血红蛋白水平、ATP含量、红细胞变形性,并利用流式细胞术检测负载后红细胞膜的完整性。结果实验组与对照组红细胞的胞内海藻糖负载量分别为(57.033±4.883)mmol/L,(49.184±4.858)mmol/L(P<0.05);胞外游离血红蛋白浓度分别为(4.131±0.473)g/L,(5.410±0.501)g/L(P<0.05);ATP浓度分别为(3.874±0.426)μmol/g Hb,(3.358±0.306)μmol/g Hb(P<0.05);红细胞变形指数分别为0.330±0.0211,0.277±0.0232(P<0.01);红细胞胞膜PS表达率分别为(5.04±0.495)%,(8.69±0.862)%(P<0.01)。结论DMSO在红细胞负载海藻糖过程中可有效增加胞内海藻糖负载量,并显著改善负载缓冲液对红细胞胞膜的高渗损伤,更好地发挥海藻糖对红细胞的保护作用。     

冻干前人红细胞对海藻糖的负载影响因素研究

目的研究影响海藻糖负载多种因素,探讨人红细胞对负载海藻糖的影响因素及规律性。方法根据红细胞海藻糖的负载量衡量,利用硫酸-蒽酮法检测红细胞在不同胞外海藻糖浓度、不同孵育时间、不同孵育温度的条件下对海藻糖的摄取量,并检测红细胞溶血程度。结果红细胞内海藻糖在负载液中的浓度<1000 mmol/L、负载时间<9 h、负载温度<37℃条件下,海藻糖的摄取量呈正相关。在负载液中浓度为0、200、400、600、800、1000mmol/L时,红细胞内海藻糖浓度分别为0、10.03、14.5、41.7、55.3和71.6 mmol/L;在温度为37℃时红细胞在浓度为1 000 mmol/L负载液中分别孵育0、1、3、5、7、9 h,胞内海藻糖浓度分别为0、5.73、6.11、55.7、和61.2 mmol/L。对温度、时间和胞外海藻糖浓度的统计分析显示,温度对负载后胞内海藻糖浓度的影响最大(P<0.01)。结论37℃、采用新鲜红细胞在海藻糖浓度为800 mmol/L的负载缓冲液中孵育7 h能有效摄取海藻糖,使之达到对红细胞起到冻干保护作用的胞内海藻糖理论浓度。     

红细胞冻干保存前对海藻糖的负载

目的探寻红细胞负载海藻糖的有效方法,评价负载海藻糖对红细胞各项理化指标的影响。方法设实验组(负载海藻糖红细胞)和对照组(未负载海藻糖红细胞),使用硫酸-蒽酮法测定胞内海藻糖含量,检测负载后红细胞各项理化指标,通过流式细胞术检测负载后红细胞膜的完整性。结果在37℃条件下,红细胞对海藻糖的摄取随胞外海藻糖浓度的增加而增多,当海藻糖浓度为800mmol/L,水浴7h,红细胞负载海藻糖可达到有效浓度;且2组红细胞各项理化指标比较差异无统计学意义(P>0.05);流式结果显示红细胞在高渗环境中负载海藻糖后,细胞膜结合很少量Annexin-V-FITC,并且破损细胞能被有效清除。结论红细胞37℃孵育7h,胞外海藻糖浓度为800mmol/L,能有效摄取海藻糖,且保持红细胞的理化稳定性和膜结构完整性。     

苯甲醇对红细胞冻干前海藻糖负载红细胞影响研究

为研究苯甲醇对海藻糖负载红细胞的影响,在4℃条件下将红细胞孵育在浓度分别为10、30、50、100mmol/L的苯甲醇-海藻糖溶液中24小时,用氰化血红蛋白试剂盒测定海藻糖负载红细胞的溶血率,用硫酸-蒽酮法检测红细胞内海藻糖浓度水平。结果表明：在100mmol/L苯甲醇-海藻糖溶液组,其红细胞内海藻糖浓度为72±12.98mmol/L,与其它各组相比,有显著统计学差异（p=0.000）;溶血率为17.99±3.75%,与其它各组相比,有显著统计学差异（p=0.000）。结论：苯甲醇可提高海藻糖负载红细胞的负载率,随着苯甲醇浓度的升高红细胞海藻糖负载率也提高,100mmol/L的苯甲醇浓度为可用浓度。     

海藻糖负载对人红细胞冷冻干燥保存影响的实验研究

目的初步探讨红细胞冻干长期保存的有效方法,并比较冻干前海藻糖的负载与否对红细胞冻干保存效果的影响。方法实验设实验组(负载海藻糖冻干-复水后红细胞):37℃,红细胞负载海藻糖7h后,采用主要成分为含有15%聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和150mmol/L,海藻糖的缓冲液作为保护液,在设定的降温程序下冻干保存红细胞;对照组:未负载海藻糖冻干-复水后红细胞。冻干结束后用37℃的再水化液快速水化,检测2组的各项理化指标。结果实验组红细胞冻干再水化后RBC和Hb回收率要高于对照组(P<0.05);ATP酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢镁(G-6-PD)活性水平显著差异有统计学意义(P<0.05))。结论胞内海藻糖对红细胞冻干具有明显的保护作用,红细胞在37℃孵育7h的条件负载海藻糖后冻干-复水后能保持细胞的理化稳定性。     

大鼠皮肤的冷冻干燥保存

背景:细胞干燥保存的研究报道较多,组织器官是否适用于干燥保存,尚缺乏证据.目的:用海藻糖作为干燥保护剂,优化海藻糖载入大鼠皮肤的条件,探索皮肤干燥保存的可行性.设计、时间及地点:观察性实验,于2007-11/2008-11在西北大学生命科学学院组织工程实验室完成.材料:体质量150 g左右成年SD大鼠.海藻糖由Sigma公司提供.方法:通过控制海藻糖浓度(50,300,500,800,1 000 mmol/L)、负载时间(0.5,4,7,9 h)和温度[4℃、4～37℃(相转变)和37℃],优化海藻糖导入大鼠皮肤的条件.将负载海藻糖的皮肤置于含100 g/L二甲基亚砜的DMEM冷冻液中孵育,程序冷冻仪以1℃/min的速率降温至-80℃后移入冷冻干燥机中进行冻干.将冻干皮肤水化复苏后分别用双醋酸羧基荧光素(CFDA)、四甲基偶氮唑盐(MTT)检测皮肤活性,并以新鲜和甲醛固定皮肤的吸光度值作为阳性和阴性对照.以苏木精-伊红染色和观察皮肤组织结构,并进行自体移植.主要观察指标:海藻糖在不同加载浓度、孵育温度和时间载入大鼠皮肤的情况.冻干皮肤水化后的形态学、组织学变化及其自体移植后存活情况.结果:海藻糖浓度小于800 mmol/L,皮肤的海藻糖载入量随海藻糖浓度的升高而明显增(P<0.05),浓度大于800 mmol/L,海藻糖载入量差异不显著.孵育温度为37℃组和相转变组皮肤海藻糖载入量明显高于4℃组(P<0.05),相转变组与37℃组差异无统计学意义.皮肤孵育4,7,9 h的海藻糖载入量明显高于孵育0.5 h的载入量(P<0.05),孵育时间为4,7,9 h之间的海藻糖载入量差异不显著,但孵育7 h后皮肤的海藻糖载入量不再增加.实验以海藻糖浓度为800 mmol/L,孵育温度为37℃,孵育时间为7 h为优化的负载条件处理大鼠皮肤.冻干皮肤玻璃化状态良好,呈半透明状.水化后能够恢复到新鲜皮肤的大小和色泽,组织结构和细胞形态与新鲜皮肤组织无差别.冷冻干燥皮肤的活性明显高于甲醛固定的大鼠皮肤(P<0.05).冻干保存的皮肤水化后移植回自体大鼠,可存活长达13 d.结论:海藻糖可作为干燥保护剂进行大鼠皮肤冷冻干燥保存,海藻糖浓度为800 mmol/L,孵育温度为37℃,孵育时间为7 h是海藻糖载入大鼠皮肤的最佳条件.     

人血小板冻干前海藻糖负载技术的优化

本研究以建立血小板负载海藻糖基本技术为基础，进一步优化海藻糖负载技术，包括负载温度、负载时间、海藻糖负载浓度和负载溶液。通过比较缓冲液和血浆负载效果，比较生理温度（37℃）和相变温度（16℃）下血小板胞内海藻糖浓度与负载时间曲线、血小板平均体积（MPV）与负载时间、海藻糖负载浓度的曲线、计算海藻糖的负载率，优选负载率较高的负载溶液、负载温度、负载时间和海藻糖浓度等血小板海藻糖负载技术参数。结果表明：37℃血浆负载率高于缓冲液负载率，且血浆负载4小时，在37℃海藻糖负载率可高达19.51％，明显高于16℃的负载率6、16％；血小板MPV在16℃比在37℃明显增大43、2％，随海藻糖负载时间（1—4小时）延长和负载浓度（0—100mmol／L）增加未见明显改变；血小板MPV在37℃与海藻糖负载时间和负载浓度呈正相关性，且海藻糖负载时间与负载浓度存在协同效应，海藻糖负载浓度高于50mmol／L，MPV随浓度（0—100mmol／L）、负载时间（1—4小时）增加而增大。结论：在原血浆中负载海藻糖、温度37℃、时间4小时、浓度低于50mmot／L可以作为优化后血小板海藻糖负载技术基本参数，负载浓度需根据冻干保存需要进行调整。     

人血小板冻干前负载海藻糖技术的研究

为研究人血小板冻干前负载海藻糖技术与方法，筛选出最佳负载海藻糖实验条件并进一步研究血小板在温度37℃条件下、氪载海藻糖4小时后的平均体积、体外激活程度和聚集反应性的变化，绘制血小板胞内海藻糖负载效率及浓度随温度、时间、胞外海藻糖浓度变化曲线，筛选合适的负载条件，分别以凝血酶、ADP、胶原、瑞斯托霉素4种物质作为血小板激活诱导剂，用血小板聚集仪分别检测血小板负载海藻糖前后的聚集反应性，用流式细胞仪检测分析血小板负载海藻糖前后其膜表面糖蛋白分子CD62p、PAC-1的表达率，加可逆性激活抑制剂PGE-1、腺苷后血小板激活被抑制的程度。结果表明：海藻糖负载效率与孵育时间（2小时后）、温度（30-40℃）呈良好线性关系，在37℃条件下经4小时孵育后负载效率可达60％，载入到胞内海藻糖浓度随胞外海藻糖浓度（〈50mmol／L）的升高而递增；同负载前相比较，血小板平均体积（MPV）、血小板对4种激活诱导剂的最大聚集率均无显著性差别（P〉0.01），经4小时负载海藻糖后血小板膜表面CD62p表达率升高，但联合添加可逆性激活抑制剂PGE-1、腺苷后CD62p表达率显著下降。结论：37℃、4小时、胞外海藻糖浓度小于50mmol／L为合适负载条件，添加可逆性血小板激活抑制剂后．冻干前负载海藻糖过程对血小板的体外激活和聚集活性没有显著影响．     

海藻糖负载红细胞及其冻干保存研究

为了研究海藻糖负载红细胞方法的可行性及红细胞内海藻糖对冻干红细胞的影响,利用红细胞膜在37℃时细胞膜上部分脂质由固态变为液态、流动性增大和膜通透性增加的性质,将红细胞置于高浓度海藻糖负载液中孵育7小时,并以磷酸缓冲盐溶液中孵育的红细胞作为对照,对红细胞的海藻糖负载率、形态学、渗透脆性、变形性、ATP含量及2,3-DPG含量进行评价。结果表明:负载后红细胞内海藻糖含量为36.56±7.95mmol/L,实验组红细胞溶血率为(15.663±3.848)%,对照组红细胞溶血率为(5.03±1.85)%,差异显著(P<0.05);实验组红细胞变形指数是0.0289±0.00738,对照组红细胞变形指数是0.1200±0.0121,差异显著(P<0.05);负载后实验组红细胞内ATP含量为2.67±0.54μmol/gHb,对照组红细胞内ATP含量为5.22±1.10μmol/gHb(P>0.05),实验组红细胞渗透脆性降低,明显低于对照组。尽管负载组的红细胞大小不一,形态各异,但在透射电镜下绝大多数红细胞膜完整,胞内血红蛋白密度均匀,而对照组有近一半的细胞膜不完整并有漏孔,胞内血红蛋白密度变浅。实验组与对照组中2,3-DPG含量均为零。实验组红细胞冻干再水化后,血红蛋白回收率46.44±4.14%,对照组血红蛋白回收率8.33±2.34%,差异显著(P<0.001)。结论:海藻糖负载的红细胞功能符合输注标准,负载方法可行,负载入细胞内的海藻糖能够保持细胞膜的完整性,大大提高了冻干红细胞的回收率,为红细胞的冷冻干燥成功迈出了第一步。     

人红细胞负载海藻糖后冻干保存过程的初步研究

目的 探讨红细胞冻干长期保存的有效方法，并评价复水后红细胞各项理化指标的变化。方法 设对照组（常规条件下保存的红细胞）和实验组（负载海藻糖冻干-复水后红细胞），在37℃条件下，红细胞负载海藻糖7h后，采用主要成分为含15％聚乙烯吡咯烷酮（PVP）和150mmol／L海藻糖的缓冲液作为保护液，在设定的降温程序下进行红细胞的冻干保存。冻干后置37℃的再水化液快速水化，检测各项理化指标。结果 红细胞冻干再水化后红细胞和血红蛋白回收率均在80％以上，且各项理化指标与常规保存的对照红细胞间差异无显著性（P〉O．05）。结论 红细胞在37℃孵育7h的条件下负载每藻糖后进行冻干，复水后能保持细胞的理化稳定性和结构形态的完整性，为进一步研究长期冻干保存红细胞奠定了基础。     

人红细胞对糖类摄取的规律性研究

人红细胞冰冻干燥保存在临床应用中具有重要意义.一些糖类,特别是海藻糖,能提高一些低等生物或细胞对干燥环境的耐受性,但如何将糖类导入细胞内又是一个挑战.本研究探讨人红细胞对糖类摄取的规律性.于不同温度（4、25和37℃）、不同浓度（0、0.2、0.4、0.6、0.8、1 mol/L）及不同培育时间（1、3、5、7、9小时）条件下检测了红细胞对海藻糖和葡萄糖的吸收率及游离血红蛋白量,并测定了红细胞变性指数.结果表明：随着温度的上升和细胞外糖浓度的增加,红细胞的糖吸收率也随之上升,细胞内的海藻糖和葡萄糖浓度分别可以达到30 mmnol/L和40 mmol/L以上.但孵育时间对海藻糖和葡萄糖的吸收率影响不同,随着时间的延长,细胞内海藻糖浓度呈先升高而后降低的趋势,而葡萄糖吸收率则呈稳定上升的趋势.但是糖吸收过程对红细胞的游离血红蛋白和变形性产生不利的影响,尤其是海藻糖,这主要来源于渗透压伤害.结论：红细胞的糖吸收率与孵育温度、外源糖浓度和孵育时间的关系密切,而且在一定条件下的糖吸收效率也较高,但此过程对红细胞有一定的伤害,这可能会影响糖类在红细胞冰冻干燥保存研究中的应用前景.今后的研究工作应集中于如何处理细胞伤害和糖吸收效率的关系.     

细胞内外海藻糖对红细胞冰冻干燥保存的影响

目的研究细胞内海藻糖对红细胞冻干保存后血红蛋白回收率及ATP水平影响。在一定条件下负载红细胞,细胞内海藻糖浓度保持恒定,研究细胞外不同浓度的海藻糖对红细胞冰冻干燥保存的影响。方法将浓缩红细胞在37℃,浓度为800 mmol的海藻糖溶液中孵育7 h,制成海藻糖负载的浓缩红细胞,对照组为PBS负载浓缩红细胞,行冻干保存,测定Hb回收率及细胞内ATP水平。将PBS液、浓度为50 mmol、200 mmol、400 mmol的海藻糖溶液与海藻糖负载浓缩红细胞按1∶1比例混匀,行冻干保存及再水化,用氰化血红蛋白试剂盒测定Hb溶血率,计算Hb回收率。结果经海藻糖负载的红细胞冻干保存,Hb回收率(44.46±5.15)%,细胞内ATP水平(1.91±0.33)μmol/gHb,对照组Hb回收率(7.71±2.71)%,细胞内ATP水平(0.88±0.25)μmol/gHb。2组相比较,P0.05,差异有统计学意义。细胞外PBS液组Hb回收率为(10.36±0.97)%,50 mmol海藻糖组,Hb回收率为(33.57±2.89)%,200 mmol海藻糖组,Hb回收率为(38.64±0.54)%,400 mmol海藻糖组,Hb回收率为(18.10±1.9)%。对照组PBS液组与50 mmol组、200 mmol组、40 0mmol组分别比较,差异有统计学意义。400 mmol组与200 mmol组、5 0 mmol组分别比较,差异有统计学意义(P0.01)。200 mmol组与50 mmol组相比较,差异无统计学意义。结论细胞内的海藻糖大大提高冻干红细胞Hb回收率且可保持冻干红细胞正常ATP水平。细胞外的海藻糖对红细胞冻干保存有保护作用,随着细胞外液中海藻糖浓度增加,冻干红细胞Hb回收率减少。     

不同温度下海藻糖联合葡萄糖负载红细胞后溶血情况

目的探索海藻糖和葡萄糖联合负载红细胞的最适温度,为冷冻干燥红细胞提供基础。方法分别采用0、0.125、0.25、0.5和1mol/L的海藻糖联合葡萄糖在4℃、25℃和37℃负载红细胞6h。然后检测上清液中游离血红蛋白和乳酸脱氢酶含量。结果负载液浓度为1mol/L时,3种温度下的细胞溶血程度较重,即上清中游离血红蛋白和乳酸脱氢酶浓度较高。在浓度低于1mol/L时,25℃负载后,红细胞溶血程度较高。4℃和37℃负载时,上清中游离血红蛋白和乳酸脱氢酶浓度较低。结论在浓度小于1mol/L时,海藻糖联合葡萄糖在4℃和37℃情况下,负载红细胞后对细胞的损伤较小,能够满足冻存的负载要求。