亚砷酸钠抑制肝癌细胞增殖与PML蛋白表达

目的：研究亚砷酸钠抑制肝癌（HCC）细胞增殖是否与早幼粒细胞白血病（PML）蛋白表达有关。方法免疫组织化学法、免疫荧光、蛋白免疫印迹法（Western blot）和荧光定量PCR检测HCC组织PML蛋白及基因表达。结果免疫组织化学分析显示随机选择15例高分化、中度分化和低分化HCC组织和细胞均不同程度表达PML蛋白。Western blot 分析发现24例HCC组织、HuH7、HepG2、Hep3B、SMMC‐7721和 L02细胞均表达 PML 蛋白。免疫荧光提示 HuH7、HepG2、Hep3B、SMMC‐7721细胞核均有PML蛋白颗粒,其中 HuH7和 Hep3B细胞表达PML蛋白较 HepG2、SMMC‐7721细胞多。24例 HCC组织, Hep3B、HepG2、SMCC‐7721和HuH7细胞都表达PML基因。亚砷酸钠不仅可下调HuH7和原代 HCC细胞表达PML蛋白,而且亚砷酸钠抑制HuH7,HepG2,Hep3B和SMMC‐7721细胞生长,随着暴露时间延长亚砷酸钠对HCC细胞抑制作用增强。结论HCC 组织和细胞系普遍表达PML 基因和蛋白,PML 蛋白可能是砷剂直接靶向作用的分子基础。     

CXCR4基因RNA干扰对人肝癌细胞系SMMC7721体外粘附、迁移的影响

目的研究CXCR4基因RNA干扰对肝癌细胞系SMMC7721体外增殖、粘附能力的影响。方法psiR—NA．CXCR4真核表达载体转染SMMC7721细胞,Trans well法检测细胞的体外迁移能力,12（;5检测细胞的粘附能力。结果psiRNA-CXCR4真核表达载体转染SMMC7721细胞后,明显沉默了SMMC7721mRNA表达,转染后48h抑制效率最高。SMMC7721细胞体外增殖、迁移能力受到抑制（P〈0．05）。结论CXCR4基因RNA干扰在体外可明显沉默肝癌细胞系SMMC7721CXCR4基因的表达,抑制肝癌细胞系SMMC7721的生长和转移。     

稳定表达促血管生成素基因肝癌细胞系的建立及产物的检测

目的 构建携带促血管生成素(Angiopoietin)基因并稳定表达的肝癌细胞系SMMC7721，为进一步研究奠定基础。方法 选择本身不表达Angiopoietin的肝癌细胞系SMMC7721，通过脂质体介导的基因转染方法将Angiopoietin基因导入SMMC7721肝癌细胞系，并用G418筛选稳定表达的细胞克隆，构建携带Angiopoietin基因并稳定表达的SMMC7721肝癌细胞系。用RT-PCR方法从RNA水平以及用免疫荧光法从蛋白水平均检测新构建的肝癌细胞系是否携带了Angiopoietin基因并能稳定表达其蛋白产物。结果 成功构建了携带Angiopoietin基因的肝癌细胞系，新的细胞系可以稳定表达外源基因及其蛋白产物。结论 脂质体介导基因转染法是一种高效转染方法，新细胞系的建立将为进一步的促血管生成素在肝癌血管的生成和转移中的作用研究奠定基础。     

Gankyrin在肝癌细胞系中的表达

目的检测肝癌细胞系中癌基因Gankyrin的表达。为在肝癌细胞中对Gankyrin基因进行RNA干涉研究的体外实验筛选靶细胞。方法对肝癌细胞系HepG2、SMMC-7721、HHCC进行逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）及Western blotting检测。结果Gankyrin基因在3种肝癌细胞系中均有表达。结论多种肝癌细胞系中均有Gankyrin基因的表达，HepG2、SMMC-7721、HHCC均可作为阳性靶细胞，进行Gankyrin基因的RNA干涉研究。     

血管内皮生长因子及其受体在肝癌细胞中的表达及意义

目的：探讨人肝癌细胞株血管内皮生长因子（VEGF）及其受体的表达,进一步认识VEGF在肝癌血管形成中的作用机制。方法：以人脐静脉血管内皮细胞系ECV304和小鼠成纤维细胞系L929作为对照,采用免疫组化染色及RT-PCR,检测体外培养的人肝细胞肝癌细胞系SMMC7721、HHCC和HepG2中VEGF及其受体的表达。结果：SMMC7721、HHCC和HepG2细胞均有VEGF的表达,同时VEGF受体1（Flt-1)在SMMC7721细胞中也有表达;而HHCC和HepG2细胞则表达VEGF受体2（KDR）。     

小分子干扰RNA沉默肝癌细胞CDK2基因对RB、CyclinE、E2F1基因表达的影响

【目的】观察小分子干扰RNA(siRNA)沉默细胞周期素依赖性蛋白激酶(CDK2)基因后,细胞周期相关基因RB、CyclinE、E2F1在肝癌细胞SMMC7721中mRNA的表达。【方法】将前期研究中已构建成功并筛选出的最有效干扰抑制CDK2基因的siRNA序列片段,采用Lipofectamine TM2000脂质体转染法转染肝癌细胞株SMMC7721后分6组:重组质粒组190、重组质粒组191、SMMC7721肝癌组、转染试剂组、阴性对照组、空质粒组。采用实时荧光定量PCR法检测RB、CyclinE、E2F1 mRNA水平。【结果】CDK2的siRNA转染SMMC7721细胞后,RB基因mRNA表达上调,CyclinE、E2F1基因mRNA表达下调。【结论】抑制CDK2基因的表达能使肝癌细胞SMMC7721中RB基因mRNA表达上调,CyclinE、E2F1基因mRNA表达下调,提示肝癌细胞中RB、CyclinE、E2F1基因的表达与CDK2基因的表达具有明显的相关性。     

siRNA对HepG2细胞mcl-1表达的影响

目的:探讨特异性siRNA对肝癌细胞系HepG2中mcl-1表达的影响.方法:将特异性siRNA经脂质体介导转染人肝癌细胞系HepG2;半定量RT-PCR观察干扰前后mcl-1 mRNA水平变化,比较对应不同位点的两对siRNA片段对mcl-1的干扰效果,分析RNA干扰的特异性、时效性;Western Blot检测转染前后Mcl-1蛋白表达情况.结果:特异性siRNA片段能有效降低mcl-1 mRNA水平,最大干扰效率达67.25%,高于作为对照的非相关片段;对应不同位点的两对siRNA片段对mcl-1均可产生干扰作用,彼此间差别不大;干扰作用于转染后24 h即可出现,48 h达高峰,72 h稍有降低;Western Blot证明转染siRNA-F1后Mcl-1蛋白表达下调.结论:RNA干扰技术可有效下调肝癌细胞系HepG2中mcl-1 mRNA水平,明显下调Mcl-1蛋白表达.     

Na~+/K~+-ATP酶α1亚单位小干扰RNA和哇巴因诱导肝癌HepG2细胞S期阻滞及其机制

目的 观察哇巴因联合Na~+/K~+-ATP酶(钠泵)α1亚单位小干扰RNA(siRNA)对人肝癌HepG2细胞增殖和细胞周期的影响.方法 分析人肝癌临床组织标本、正常肝组织和肝癌细胞系SMC7721、Bel7402和HepG2细胞钠泵α1亚单位的表达.CCK-8法检测采用钠泵α1亚单位siRNA和哇巴因作用肝癌HepG2细胞增殖抑制状况,分析各组细胞的钠泵活性变化,流式细胞术分析细胞周期变化.实时定量PCR和蛋白质印迹法检测钠泵α1、促分裂源活化蛋白激酶1(MAPK1)、细胞围期蛋白1(CyclinA)、周期蛋白依赖性激酶2(CDK2)、增殖细胞核抗原(PCNA)和细胞周期蛋白抑制因子(P21~(WSF1))表达的变化.结果 肝癌组织标本的钠泵α1亚单位密度值(174.7±16.8)明显高于正常肝组织(65.3±7.9,P<0.05);HepG2细胞钠泵α1亚单位表达明显高SMMC-7721和Bel-7402细胞(P<0.05).siRNA、哇巴因和联合用药可抑制HepG2细胞的增殖,联合实验组效果更显著(P<0.05),0.03μmol/L siRNA组、0.1 μmol/L哇巴因和联合实验组细胞24、48和72 h抑制率分别为17.4%、20.3%、24.3%,37.5%、44.3%、51.2%,52.3%、70.2%、88.2%.各实验组均出现钠泵活性降低,以联合实验组最显著(P<0.05).0.1 μmol/哇巴因和联合实验组HepG2细胞S期比例从24.2%上升至66.5%和75.2%;实时定量PCR和蛋白质印迹检测显示哇巴因组和联合实验组P21<'WAF1>表达上调而钠泵μ1亚单位、MAPK1、CyclinA、CDK2和PCNA表达下调.结论 钠泵α1亚单位siRNA联合哇巴因抑制HepG2细胞钠泵后可抑制细胞增殖,而P21~(WAF1)表达上调和CyclinA/CDK2/PCNA周期调控复合体生成减少可能是引起S期阻滞的主要原因.     

siRNA干扰骨形态发生蛋白2对肝癌SMMC7721细胞迁移和侵袭能力的抑制作用

目的 设计并化学合成针对骨形态发生蛋白2(bone morphogenetic proteins,BMP-2)的siRNA分子片段,转染人肝癌SMMC7721细胞,观察其对SMMC7721细胞迁移和侵袭能力的影响.方法 设计并化学合成针对BMP-2的3个siRNA分子序列,阳离子脂质体法瞬间转染SMMC7721细胞,运用半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和Western印迹法检测细胞中BMP-2在mRNA水平和蛋白水平的变化,体外侵袭实验榆测转染后细胞侵袭能力的变化.实验共分6组,①正常对照组;②空白对照组;③阴性对照组;④～⑥分别为BMP-2-siRNA-A、BMP-2-siRNA-B、BMP-2一siRNA-C转染组.结果 RT-PCR和Western blot显示3对特异性BMP-2-siRNA转染肝癌细胞SMMC7721之后,其BMP-2的基凶和蛋白表达均受到抑制,以siRNA-B抑制效果最明显[(0.32±0.07)vs(0.92±0.14),(0.37±0.10)vs(0.89±0.17),P<0.01].体外侵袭实验显示转染后肝癌细胞数明显低于未转染组和阴性对照组[分别为(6.48±3.62)、(23.72±3.24)、(22.38 4-3.84),P<0.05].结论 BMP-2与肝癌的侵袭转移潜能相关,siRNA-BMP-2能明显抑制肝癌细胞SMMC7721的BMP-2表达,从而抑制肝癌细胞的迁移和侵袭能力.     

过表达长链非编码RNA H19促进miR-124-3p表达抑制肝癌细胞增殖

目的 探讨长链非编码RNA H19 (long non-coding RNA H19,IncRNA H19)对miR-124-3p表达的影响及在肝癌细胞增殖中的作用.方法Real-time PCR检测肝癌细胞系及临床标本中lncRNA H19和miR-124-3p的表达;在肝癌细胞系HepG2和SMMC7721中过表达lncRNA H19,Real-time PCR 检测miR-124-3p及其靶基因cyclinD1的表达;Western blot检测cyclinD1蛋白表达水平;CCK-8法检测lncRNA H19对细胞增殖的影响;过表达lncRNA H19同时加入antagomiR-124-3p后,检测miR-124-3p及其靶基因表达情况及细胞增殖情况.结果lncRNA H19和miR-124-3p在肝癌细胞系及肝癌组织中均低表达(P＜0.05);过表达lncRNA H19后miR-124-3p表达显著增加(P＜0.05),miR-124-3p的靶基因cyclinD1蛋白和mRNA表达明显下降(P＜0.05),细胞增殖受到抑制(P＜0.05);过表达lncRNA H19同时干扰miR-124-3p后,细胞增殖抑制作用减弱(P＜0.05).结论长链非编码RNA H19通过促进miR-124-3p表达,进而抑制其靶基因cyclinD1表达而抑制肝癌细胞增殖.     

SATB1在不同侵袭潜能肝癌细胞株的表达

目的研究SATB1在不同侵袭潜能的人肝癌细胞株表达状况。方法分别用荧光定量PCR,RT-PCR,Western blotting及免
疫荧光方法,检测人永生化肝细胞株HL-7702及肝癌细胞株HepG2、SMMC-7721、MHCC97L、MHCC97H、HCCLM3 中SATB1
的表达。结果相对于HL-7702,SATB1 mRNA在其余5 种肝癌细胞株中都有较高程度的表达,其中高侵袭性HCCLM3、
MHCC97H 表达最高,MHCC97L 次之,SMMC-7721、HepG2 最低（P<0.001）;Western blotting 分析HepG2、SMMC-7721、
MHCC97L、MHCC97H、HCCLM3肝癌细胞株的蛋白相对表达量分别为0.271±0.002;0.351±0.023;0.621±0.026;0.878±0.026;
1.236±0.006,高侵袭性HCCLM3相当于HepG2的4.6倍（P<0.001）;免疫荧光显示SATB1在5种肝癌细胞株的胞浆和胞核内均
有分布,高侵袭性细胞株HCCLM3、MHCC97H表现强阳性染色。结论SATB1在不同侵袭潜能肝癌细胞株中的表达有差异,
与肝癌转移密切相关。     

AFP基因启动子区甲基化与其表达的关系

【目的】研究细胞系中AFP基因启动子甲基化模式与其基因表达的关系。【方法】应用RT-PCR方法检测人源HepG2、SMMC-7721肝癌细胞系和人成纤维细胞中AFP基因的表达,应用甲基化特异性聚合酶链反应（MS-PCR）法和亚硫酸氢盐-DNA测序法检测AFP基因启动子甲基化密度及特定位点的甲基化水平。【结果】HepG2细胞高表达AFP,AFP基因启动子非甲基化程度较高;SMMC-7721细胞低表达AFP,AFP基因启动子部分甲基化;正常细胞不表达AFP,AFP基因启动子甲基化程度很高;位于AFP全基因组序列-2494bp,-2431bp处的两个CG位点有可能作为肝癌的检测位点。【结论】AFP基因启动子甲基化程度与基因表达水平存在负相关,AFP基因沉默与其启动子甲基化有关,AFP基因启动子低甲基化可能是AFP高表达的分子机理。     

Lin28与肝癌细胞紫杉醇耐药关系的研究

[目的]Lin28是一种重编程因子和保守的RNA结合蛋白,存在Lin28A和Lin28B两种同源基因,两者结构和功能类似。本研究旨在探讨Lin28与肝癌细胞对紫杉醇耐药的关系。[方法]MTT法检测紫杉醇对HepG2、Hep3B、SMMC-7721肝癌细胞的IC50;用荧光定量PCR法（简称RTPCR）在RNA水平检测Lin28A和Lin28B在Hep3B、HepG2、SMMC-7721中的表达,蛋白质印迹法分析Lin28A和Lin28B蛋白在Hep3B、HepG2、SMMC-7721细胞中的表达情况。[结果]Hep3B、HepG2、SMMC-7721细胞株对紫杉醇的IC50分别为：Hep3B为0.194μM、HepG2为19.54μM、SMMC-7721为0.444μM。HepG2、SMMC-7721细胞株中的Lin28A基因表达量分别是Hep3B的5.06、3.10倍;HepG2、SMMC-7721细胞株中的Lin28B基因表达量分别是Hep3B的7.16、3.16倍。Hep3B、HepG2、SMMC-7721细胞株中Lin28A和Lin28B蛋白的表达量与从荧光定量数据显示的趋势一致。[结论]Lin28与肝癌细胞对紫杉醇耐药密切相关,肝癌细胞中Lin28表达与肝癌细胞对紫杉醇的耐药性成正比,暗示Lin28表达可能是肝癌细胞紫杉醇耐药的潜在机制并有望成为逆转肝癌紫杉醇耐药的靶点。     

SiRNA稳定抑制肝癌细胞hTERT基因的表达

目的：利用RNA干扰稳定筛选-抑制技术,抑制人端粒酶逆转录酶（hTERT）基因表达,探讨靶向hTERT基因RNAi与抑制肝癌细胞增殖的时-效关系．方法：设计靶向hTERT基因的小干扰RNA,构建重组表达质粒pGenesil—shRNA—hTERT并导入肝癌SMMC-7721细胞株,经G418筛选,建立稳定表达siRNA—hTERT的细胞株．采用real—time RT—PCR、MTF和PCR—TRAP法同时检测pGenesil—shRNA-hTERT稳定抑制组和未处理SMMC-7721细胞组hTERT基因表达、端粒酶活性及细胞增殖变化．结果：在稳定表达pGenesil—shRNA—hTERT的SMMC-7721细胞株中,RNAi效力持续、稳定存在,hTERTmRNA表达、端粒酶活性明显降低,瘤细胞增殖被抑制．结论：RNA干扰能持续、稳定地抑制靶基因hTERT mRNA表达及肿瘤细胞增殖,是有潜力的基因治疗肿瘤新方法．     

不同XAGE-1异构体在肝细胞癌中的表达

目的 探讨肝癌细胞株HepG2、SMMC-7721以及肝癌患者肿瘤组织标本中的4种XAGE-1异构体的表达情况,同时研究其与肝癌患者临床病理之间的关系.方法 使用RT-PCR方法检测肝癌细胞株HepG2、SMMC-7721以及80例肝癌患者肿瘤组织标本中的4种XAGE-1异构体的表达情况,同时收集患者临床资料,对XAGE-1b的表达与肝癌患者临床病理特征之间的关系进行研究.结果 XAGE-1b和XAGE-1d mRNA在肝癌细胞株和部分患者肿瘤组织标本中阳性表达[分别是35/80(43.75%)、6/80(7.50%)];而XAGE-1a和xAGE-1c mRNA在肝癌细胞株和肝癌患者标本中均为阴性表达;在对照组组织标本(4例肝血管瘤,8例肝破裂)中4种xAGE-1异构体均为阴性表达.XAGE-1bmRNA在肝癌组织中具有较高的表达率,并且其表达与肝癌TNM分期相关.结论 XAGE-1b在肝癌细胞中呈阳性表达,同时在肝癌组织中呈高度阳性表达,预示XAGE-1b的表达与肝癌预后相关,可作为其免疫治疗的潜在靶点之一.     

肝癌细胞系中SLIT2、DAPK、RIZ1、CHFR、EDNRB、3-OST-2基因甲基化状态

目的 了解SUN449、BEL-7402、SMMC-7721、Hep3B和HepG2 5种肝癌细胞系中SLIT2、DAPK、RIZ1、CHFR、EDNRB和3-OST-2 6种基因启动子区域甲基化状态.方法 体外培养以上5种肝癌细胞系,应用甲基化特异性PCR(MSP)技术,检测5种肝癌细胞系SLIT2、DAPK、RIZ...     

人肝癌SMMC-7721细胞株部分线粒体基因表达的研究

目的:观察人肝癌SMMC-7721细胞株部分线粒体DNA(mtDNA)基因表达的情况.方法:根据人线粒体DNA(mtDNA)基因序列,利用primer premier 5.0生物软件设计了4对PCR引物,分别是扩增D-loop区、ND6、ATPase8-ATPase6、16sRNA基因,采用RT-PCR方法对SMMC-7721细胞线粒体DNA上D-loop区及其他3个基因的表达进行了检测,并与其在正常人肝细胞株(L02)线粒体中的表达作了比较.结果:我们发现,与正常人肝细胞株(L02)相比,在SMMC-7721细胞中,D-loop区、ND6、ATPase8-ATPase6基因表达总体是增高的,16sRNA基因表达基本不变,同时在同一基因两条链(重链和轻链)之间的表达也存在差异.结论:我们认为,由于线粒体DNA编码的多肽均是氧化磷酸化酶复合物的亚单位,这些基因表达的异常可能造成细胞对氧利用障碍,细胞能量产生减少,成为造成SMMC-7721细胞主要以糖酵解的方式提供能量的重要原因之一.     

Hsa_circ_0000711在人肝癌细胞系中的功能研究

目的 研究环状RNA hsa_circ_0000711在人肝癌细胞系中的表达以及对肝癌细胞生物学功能的影响.方法 利用RT-qPCR检测环状RNA hsa_circ_0000711在肝癌细胞系的表达;通过小干扰RNA特异性敲低hsa_circ_0000711的表达;通过CCK-8实验检测肝癌细胞系的增殖情况;利用流式细胞技术检测细胞周期及细胞凋亡.Western blot检测下调hsa _circ _0000711后Cyclin D1、CDK4、 cleavaed Caspase 3及Bcl-2蛋白的表达水平.结果 Hsa_circ_0000711在肝癌细胞HepG2和SMMC- 7721中明显高表达(P＜0. 05) .与对照组相比,hsa_circ_0000711干扰组的肝癌细胞增殖能力显著降低(P＜0. 05),处于G1期细胞增多(P＜0. 05),且凋亡细胞显著增加(P＜0. 05) .干扰hsa_circ_0000711的表达后,肝癌细胞中Cyclin D1、CDK4和Bcl-2的蛋白表达量显著降低(P＜0. 05),cleavaed Caspase 3蛋白表达量显著升高(P＜0. 05) .结论 Hsa_circ_0000711可能通过调控细胞周期及凋亡影响肝癌细胞的增殖.     

多罗清泰颗粒对人肝癌细胞株信号转导基因表达的影响

目的观察多罗清泰颗粒对人肝癌细胞株SMMC-7721信号转导基因表达的影响。方法体内抑瘤实验研究多罗清泰颗粒对小鼠肝癌移植瘤生长的影响;采用中药血清药理学方法和基因芯片技术,分析多罗清泰含药血清对人肝癌细胞株SMMC-7721信号转导基因表达的影响。结果多罗清泰颗粒能显著抑制小鼠肝癌移植瘤生长,抑制率为63%~67.8%。多罗清泰颗粒对所检测的99条信号转导基因中的68条基因表达具有显著影响,占所测基因的69%。其中,上调的基因为42条,下调的基因为36条。在多罗清泰颗粒小剂量处理组和大剂量处理组之间,SMMC-7721细胞信号转导基因表达则存在相当大的差异。结论多罗清泰颗粒能显著抑制肝癌细胞的生长,显著影响肝癌细胞信号转导基因的表达。