中华绒螯蟹羧酸酯酶基因克隆及其在农药胁迫下的表达变化

【目的】明确中华绒螯蟹羧酸酯酶基因(ES-CXEs)在中华绒螯蟹不同组织及在农药胁迫下的应激表达模式,为揭示其代谢解毒机制打下理论基础。【方法】采用RACE克隆ES-CXEs基因全长序列,并进行生物信息学分析;以实时荧光定量PCR检测中华绒螯蟹不同组织及在农药胁迫下ES-CXEs基因的表达变化。【结果】从中华绒螯蟹肝胰腺中克隆获得两段ES-CXEs基因cDNA序列(ES-CXE5和ES-CXE6),其中,ES-CXE5基因序列全长1889 bp(GenBank登录号MH201558),包括132 bp的5'端非编码区(5'UTR)、122 bp的3'端非编码区(3'UTR)和1635 bp的开放阅读框(ORF),推测其编码544个氨基酸序列;ES-CXE6基因序列全长3089 bp(GenBank登录号MH201555),包括282 bp的5'UTR、779 bp的3'UTR和2028 bp的ORF,推测其编码675个氨基酸序列。多序列比对分析结果显示,ES-CXE5和ES-CXE6基因均具有CXEs家族的特征序列,即催化三联体结构(S-E-H)和N-糖基化位点。ES-CXE5氨基酸序列与三疣梭子蟹、日本长额虾等甲壳类CXEs聚为一簇,而ES-CXE6氨基酸序列与水蚤类和芜菁叶蜂的CXEs聚为一簇。组织特异性表达分布显示,ES-CXEs基因在雌、雄性中华绒螯蟹不同组织中的相对表达量无显著差异(P0.05),且在肝胰腺、肌肉、精巢和副性腺中均有表达,以肝胰腺中的相对表达量最高。在安全浓度的阿维菌素、敌百虫和高效氯氰菊酯胁迫下,ES-CXEs基因在中华绒螯蟹肝胰腺中的相对表达量呈明显诱导表达趋势,且ES-CXE5基因的相对表达量高于ESCXE6基因。【结论】从中华绒螯蟹肝胰腺中克隆获得的ES-CXE5和ES-CXE6基因属于CXEs基因家族,在肝胰腺中高表达,且在农药胁迫下这两个基因的表达呈明显诱导表达趋势而参与杀虫剂的代谢解毒过程。     

中华绒螯蟹Kcna基因功能及其与生长性状的关联分析

为探究中华绒螯蟹Kcna基因的结构、表达模式及生长发育中的分子功能,本研究克隆了中华绒螯蟹Kcna（命名为Es-Kcna）基因的全长,并开展了生物信息学分析和时空表达模式研究;观察了干扰Kcna基因后中华绒螯蟹生长表型性状的变化;筛选了Es-Kcna基因的SNP标记并与种群地理分布、生长性状进行了关联分析。结果显示：Kcna基因位于中华绒螯蟹第46号染色体上,全长945 304 bp,含有9个外显子;其中,cDNA全长2 080 bp,开放阅读框1 584 bp,编码527个氨基酸;原子总量为8 433,分子结构式为C2719H4210N702O787S15,预测蛋白等电点（pI）为5.23,相对分子量为59.81 KDa。系统进化树分析显示Es-Kcna基因与三疣梭子蟹Kcna基因的亲缘关系最近。荧光定量PCR结果显示Es-Kcna基因在蜕壳前期、蜕壳间期和蜕壳后期的肌肉、心脏、肠道等六种组织中均有表达,其中以肌肉组织中的表达丰度最高（P< 0.05）。与对照组相比,干扰Kcna基因的表达后,实验组蟹的体重、蜕壳增重率和第二步足长度显著降低（P< 0.05）;肌肉组织切片结果显示实验组步足肌肉肌纤维直径小于对照组（P> 0.05）。此外,在Es-Kcna基因的第8外显子上鉴定出一个SNP位点（A1 461G）,该位点在辽河野生群体显著富集GG基因型,而在长江野生群体富集AA基因型。生长性状的关联分析表明,具有AA型个体的步足长度显著长于GG型个体（P< 0.05）。本研究为Kcna基因调控中华绒螯蟹生长的分子功能和遗传育种研究提供了研究基础,并为区分长江、辽河野生中华绒螯蟹提供重要参考。     

中华绒螯蟹血细胞cDNA文库的构建及质量初检

为了筛选中华绒螯蟹Eriocheir sinensis血细胞免疫的相关基因,促进蟹类免疫防治的进展,采用Gubler-Hoffman法构建了中华绒螯蟹血细胞的cDNA文库。结果表明：该文库初始滴度为4.50×106cfu/mL,库容为3.3×106cfu/mL,重组率为73%,插入片段大小多为800~2 500 bp。随机挑取了94个重组子进行测序初检,共得到93条平均长度为511 bp的表达序列标签（EST）序列,对所测EST序列进行拼接,得到75条一致性序列,包括15条重叠群（Contigs）和60条单一序列（Singleton）。对测序结果进行比对分析,获得了15条已报道有一定功能的一致性序列,其中4条与免疫相关;另外60条一致性序列还未见报道。研究表明,中华绒螯蟹血细胞cDNA文库已构建成功,且质量较高,从而为开展中华绒螯蟹功能基因克隆、分析和功能基因组学研究奠定了基础。     

中华绒螯蟹与合浦绒螯蟹线粒体细胞色素b基因片段的DGGE分析

[目的]探讨利用DGGE技术对中华绒螯蟹和合浦绒螯蟹遗传多样性进行分析的可能性。[方法]对中华绒螯蟹5个群体和合浦绒螯蟹1个群体共180个个体的线粒体细胞色素b（cytb）基因片段进行了PCR扩增和变性梯度凝胶电泳（DGGE）分析。[结果]所有PCR产物在DGGE电泳时共有2种迁移速率,合浦绒螯蟹所有个体的PCR产物的迁移速率相同,且中华绒螯蟹江都群体46.7%、仪征群体23.3%以及温州群体20.0%的个体与合浦绒螯蟹的迁移速率一致;而以上3个中华绒螯蟹群体的其他个体以及南京、盘锦群体所有个体的PCR产物在DGGE电泳时的迁移速率均相同,均快于合浦绒螯蟹,表明在中华绒螯蟹中混杂有合浦绒螯蟹的遗传标记类型。[结论]DGGE方法可用于绒螯蟹的遗传多样性分析。     

中华绒螯蟹与合浦绒螯蟹线粒体细胞色素b基因片段的DGGE分析DGGE Analysis

[目的]探讨利用DGGE技术对中华绒螯蟹和合浦绒螯蟹遗传多样性进行分析的可能性。[方法]对中华绒螯蟹5个群体和合浦绒螯蟹1个群体共180个个体的线粒体细胞色素b（cytb）基因片段进行了PCR扩增和变性梯度凝胶电泳（DGGE）分析。[结果]所有PCR产物在DGGE电泳时共有2种迁移速率,合浦绒螯蟹所有个体的PCR产物的迁移速率相同,且中华绒螯蟹江都群体46.7%、仪征群体23.3%以及温州群体20.0%的个体与合浦绒螯蟹的迁移速率一致;而以上3个中华绒螯蟹群体的其他个体以及南京、盘锦群体所有个体的PCR产物在DGGE电泳时的迁移速率均相同,均快于合浦绒螯蟹,表明在中华绒螯蟹中混杂有合浦绒螯蟹的遗传标记类型。[结论]DGGE方法可用于绒螯蟹的遗传多样性分析。     

中华绒螯蟹蜕皮过程中血淋巴主要生化成分的变化

利用生物化学及原子吸收方法测定了中华绒螯蟹蜕皮过程中血淋巴主要生化成分的变化。研究结果显示:在中华绒螯蟹蜕皮前期,血淋巴中总糖、总脂、总蛋白和4种无机离子(Ca2+、Mg2+、Cu2+、Zn2+)的含量都呈上升趋势。总糖含量在D0期达到高峰,Ca2+、Cu2+和Zn2+含量于D1期达到高峰,总脂和总蛋白含量于D3-4期达到高峰;蜕皮后,总糖、Ca2+、Mg2+含量升高,总脂、总蛋白和Cu2+、Zn2+含量开始降低。中华绒螯蟹蜕皮过程中血淋巴生化成分的变化与蜕皮周期密切相关。     

中华绒螯蟹过氧化物还原酶基因克隆及其在鳗弧菌感染下的表达分析

【目的】克隆中华绒螯蟹（Eriocheir sinensis）过氧化物还原酶基因（EsPrx）的开放阅读框（ORF）,并分析EsPrx基因的组织表达特征及细菌感染下的表达情况,为中华绒螯蟹的先天免疫和抗病机制研究提供参考依据。【方法】通过RT-PCR结合转录组序列比对克隆出EsPrx基因,利用DNAStar、ClustalW、ExPASy、TMHMM Server v.2.0、SignalP 5.0及NetPhos 3.1 Server等在线软件进行生物信息学分析,并以实时荧光定量PCR检测EsPrx基因的组织表达特征及鳗弧菌（Vibrio anguillarum）感染下的表达情况。【结果】EsPrx基因ORF为597 bp,共编码198个氨基酸残基,含有Prx特有的2个结构域（FYPLDFTFVCPTEI和GEVCPA）。EsPrx蛋白分子式为C₉₉₄H₁₅₄₄N₂₅₈O₂₉₃S₈,分子量为22.05 kD,理论等电点（pI）为5.67,无跨膜域和信号肽,属于非分泌性蛋白。EsPrx氨基酸序列与扁额青蟹（Eurypanopeus depressus）、拟穴青蟹（Scylla paramamosain）和三疣梭子蟹（Portunus trituberculatus）的Prx氨基酸序列高度同源,对应的相似性分别89%、89%和88%;基于Prx氨基酸序列相似性构建的系统发育进化树也显示,EsPrx氨基酸序列先与拟穴青蟹、扁额青蟹及南美白对虾（Penaeus vannamei）的Prx氨基酸序列聚在一起,再与其他动物的2-Cys Prx氨基酸序列聚类,证实EsPrx基因属于未分化的Prx基因,即Prx1/2基因。EsPrx基因在中华绒螯蟹各组织中广泛表达,以肝胰腺的相对表达量最高,极显著高于在其他组织中的相对表达量（P<0.01）;EsPrx基因表达在鳗弧菌感染不同时间段存在明显差异,感染6~24 h其相对表达量显著升高（P<0.05）,而后迅速降至正常水平。【结论】EsPrx基因为甲壳动物未分化的Prx1/2基因,在中华绒螯蟹肝胰腺中高表达,并参与鳗弧菌感染的抗氧化应激反应,即在抗逆过程中发挥重要作用。     

河蟹种质的外观鉴别方法

河蟹又叫螃蟹、毛蟹,学名中华绒螯蟹,在我国分布较广,因栖息生态环境的不同,形成4个种群,即:长江水系种群、辽河水系种群、瓯江水系种群和闽江水系种群。在世界上,除中华绒螯蟹,还有日本绒螯蟹、直额绒螯蟹和狭额绒螯蟹3种。1中华绒螯蟹与日本绒螯蟹等其它蟹种的区别(见图1、图2)     

中华绒螯蟹Myostatin基因在蜕皮过程中的表达分析

本研究通过荧光定量PCR（qRT-PCR）技术对中华绒螯蟹Myostatin（EsMSTN）基因在不同组织及蜕皮阶段的表达情况进行了分析。结果显示,(1) EsMSTN在C期中华绒螯蟹肌肉组织中的基因表达水平最高,胸神经节和脑神经节中也有较高水平的表达,暗示EsMSTN基因的功能并不局限于肌肉生长的调节。(2) 在不同蜕皮阶段,肌肉中EsMSTN的基因表达水平在AB期最高,D期最低,推测EsMSTN可能正向调节中华绒螯蟹肌肉生长,参与肌肉组织蜕皮后的生长以及蜕皮前的萎缩过程;肝胰腺、上皮组织中EsMSTN的最高基因表达水平都出现蜕皮后的AB期,C期或D期相对表达量最低,这可能与上述器官的细胞增殖主要发生在AB期有关;胸神经节中EsMSTN的表达水平在E期最高,D期最低,暗示EsMSTN正向调节胸神经节中的神经发生。     

中华绒螯蟹颤抖病螺原体分布及16 S-23 S rRNA基因间隔区序列的分析

为了探究中华绒螯蟹颤抖病螺原体(Spiroplasma eriocheiris)在江苏省的分布,以2003年至2009年从江苏省养殖池塘收集的发病中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)为研究对象,利用螺原体体外培养、光电镜检测和16 S-23 S rRNA基因间隔区序列比较等方法进行了系统分析。结果表明,S.eriocheiris是一种广泛分布于江苏省养殖中华绒螯蟹体内的病原微生物,它们不仅在7月底8月初的高温季节引起中华绒螯蟹发病和暴发性死亡,还能在3月和11月等低温季节引起部分中华绒螯蟹的发病和死亡,其严重危害中国江苏省中华绒螯蟹养殖业的健康发展。     

千亩中华绒螯蟹落户石屏

石屏县具有得天独厚的气候优势和水资源优势,其气候适宜,水草茂盛,食料丰富,非常适合中华绒螯蟹的生长。2005年起石屏县从上海引进中华绒螯蟹示范养殖获得成功。为确保千亩中华绒螯蟹养殖目标的实现,石屏县成立中华绒螯蟹技术指导组,制定中华绒螯蟹养殖技术实施方案,指定专人负     

中华绒螯蟹线粒体DNA的电镜观察

中华绒螯蟹(Eriocheir japonica sinensis)接近全长序列的线粒体基因组大小为16354 bp。为探讨中华绒螯蟹线粒体基因组中是否有巨线粒体DNA,采用差速离心法自中华绒螯蟹卵巢提取线粒体,试剂盒抽提较纯的线粒体DNA。经RNase消化,用水相法展开,以铜网取样,醋酸双氧铀染色,放大12000~35000倍于透射电镜下观察中华绒螯蟹线粒体DNA的形态。底片经放大、扫描,以Image J软件分析并测量线粒体DNA长度,通过经验公式计算分子大小。电镜观察结果显示:中华绒螯蟹的线粒体DNA为典型单个闭合环状结构,大小约为(18465±1271)bp,表明中华绒螯蟹的线粒体基因组内不含有巨线粒体DNA。     

氟虫腈在中华绒螯蟹中的残留效应

采用半静态实验法,设置质量浓度为10、30、50μg/L的氟虫腈水溶液在中华绒螯蟹中的残留效应试验。结果表明,不同质量浓度的处理组分析,高质量浓度组中华绒螯蟹蟹腿中氟虫腈的含量显著高于低质量浓度组,高质量浓度组中华绒螯蟹身体中的含量也显著高于低质量浓度组。对中华绒螯蟹不同部位氟虫腈的含量分析无差异性,氟虫腈富集部位的走向应该是先从腿部再到身体最后到性腺。氟虫腈在中华绒螯蟹体内的残留没有性别选择性,但雌性中华绒螯蟹体内富集的速度比雄性的快。此次研究可为处理相关的渔业污染事故提供一定的参考。     

眼柄切除对中华绒螯蟹肝胰腺和生殖腺蛋白质含量及其种类的影响

中华绒螯蟹性早熟问题已成为目前水产养殖的难点,但有关中华绒螯蟹生殖调控分子机制方面的基础研究资料国内外一直很缺乏。以中华绒螯蟹为实验材料,眼柄切除后,分别在不同时期对其肝胰腺及生殖腺蛋白质含量及种类进行测定。用组织捣碎器法破碎细胞并提取总蛋白,然后用考马斯亮蓝法测定各组织总蛋白含量,最后通过PAGE电泳测定其蛋白质种类。结果表明,切除眼柄可使肝胰腺及生殖腺蛋白质含量总体呈升高趋势,但在眼柄切除21 d时各组织蛋白质含量急剧下降,并且切除眼柄后各组织蛋白质种类也发生了明显变化。在以上过程中,雌雄蟹之间各组织蛋白质含量及其种类变化趋势有明显不同。由此可见眼柄神经分泌、肝胰腺及生殖腺在雌雄中华绒螯蟹生殖调控中的关系。     

浦东新区中华绒螯蟹绿色养殖技术

为规范上海市浦东新区中华绒螯蟹的淡水养殖行为,从仔蟹培育、扣蟹培育、成蟹饲养等环节,总结了浦东新区中华绒螯蟹绿色养殖技术,以进一步推行中华绒螯蟹标准化养殖技术,不断提高养殖户科学合理用药、正确投喂饲料的能力和自觉性,提高中华绒螯蟹产品质量,增强市场竞争力,实现优质优价。     

中华绒螯蟹“长江2号”

正"长江2号"是以引进的莱茵河水系中华绒螯蟹群体为定向选育基础群体,经4个世代选育而获得经济性状优良的中华绒螯蟹新品种,系江苏省淡水水产研究所选育,于2013年通过全国水产良种审定委员会审定(审定编号:GS-01-004-2013)。一、生物学特征中华绒螯蟹"长江2号"属十足目方蟹科绒螯蟹属。中华绒螯蟹又称河蟹,其头胸甲明显隆起,额缘有4个尖     

中华绒螯蟹白斑症病毒病的诊断

[目的]对江苏省吴中地区养殖池塘患病的中华绒螯蟹进行诊断。[方法]结合临床流行病学调查和分子生物学鉴定,对江苏省吴中地区发病的中华绒螯蟹进行实验室检测与鉴定。参考Gen Bank中白斑症病毒(WSSV)的基因序列设计1对特异性引物,以从中华绒螯蟹的鳃、肝胰腺、肌肉等组织提取的DNA为模板,进行PCR扩增。[结果]经过解剖观察,发现病蟹内脏器官无明显变化。从病蟹的肝胰腺和肌肉中未分离到致病菌。通过PCR扩增,均能扩增出预期大小的特异性产物,测序比对显示扩增条带的基因序列与WSSV的基因序列同源性高达99.6%。病理切片显示鳃和肝胰腺可见大量细胞核肿大细胞,与WSSV引起对虾组织的病变相一致。[结论]经初步诊断,确定引起中华绒螯蟹发病死亡的病原为WSSV。     

基于图像处理的中华绒螯蟹性早熟问题的研究

研究了规格和颜色特征与中华绒螯蟹性早熟的关系,运用图像平滑、HSI选取、膨胀与腐蚀、颜色量化等方法对其图像进行处理,得到中华绒螯蟹的规格和颜色特征,为鉴别中华绒螯蟹的性早熟提供了方便、快捷、客观的依据。     

中华绒螯蟹致病性维氏气单胞菌的分离鉴定、药敏特性及其组织病理学观察

[目的]查明引起江苏省连云港市某养殖场中华绒螯蟹死亡的病原菌及其药敏特性与组织病理特征,为该病的临床诊断和药物防控提供科学依据.[方法]采用传统方法从患病中华绒螯蟹肝胰腺组织中分离病原菌,通过人工回归感染试验确定其致病性,利用API ID32E细菌生化鉴定试剂条和16S rRNA序列分析对病原菌进行鉴定,以纸片扩散法测定病原菌的药敏特性,并通过常规石蜡切片观察患病中华绒螯蟹肝胰腺和肠道等病灶组织的病理特征.[结果]从患病中华绒螯蟹肝胰腺中分离获得1株具有致病性的病原菌株(HXH1),经生理生化特性鉴定和16S rRNA序列分析确定其为维氏气单胞菌(Aeromonas veronii).HXH1菌株对健康中华绒螯蟹的半数致死剂量(LD50)为6.92×104 CFU/mL,对复方新诺明、杆菌肽、奈替米星、氟苯尼考、多粘菌素B、新霉素、庆大霉素、氧氟沙星、诺氟沙星、恩诺沙星、卡那霉素、磺胺异噁唑、链霉素和甲氧嘧啶等14种抗生素高度敏感,对罗红霉素中度敏感,对多西环素、萘啶酸、阿莫西林、四环素和吡哌酸等5种抗生素已产生耐药性(不敏感).与健康中华绒螯蟹相比,患病中华绒螯蟹的肝胰腺和肠道存在明显病理变化,具体表现为:肝胰腺细胞排列极其紊乱,局部可见坏死细胞,细胞核固缩深染;局部肠黏膜上皮组织溶解脱落至肠腔内.[结论]维氏气单胞菌对中华绒螯蟹具有较强的致病性,通过引起肝胰腺和肠道等器官组织的病理变化而造成机体损伤甚至死亡,养殖生产上可选用喹诺酮类、氨基糖苷类、磺胺类和酰胺醇类渔用抗生素进行防治.     

不同水域条件下中华绒螯蟹的形态和元素分布

以江苏省阳澄湖、滆湖、长荡湖和江西省军山湖产的中华绒螯蟹为对象,对其形态和第三步足元素积累特征进行了比较研究.基于17个形态数据的框架测量结果的多元统计分析表明,不同产地的中华绒螯蟹个体形态学差异不显著,很难作为不同水域产地的判别依据.但不同产地中华绒螯蟹第三步足元素积累类型的研究结果显示,检出的12种元素的环境“指纹”特征极显著,产地间判别的准确率可达100％,具有可区别不同水域产中华绒螯蟹的潜力.