人脐血源性MSCs成骨诱导分化后的免疫调节作用

目的:探讨脐血源性间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)经成骨诱导分化后,其对淋巴细胞的免疫调节作用。方法:从人脐血中分离、培养及扩增MSCs,流式细胞仪测定细胞表型;将获得的MSCs在成骨诱导体系中诱导分化并鉴定,将诱导后的成骨细胞分别以不同剂量加入到外周血混合淋巴细胞培养体系和植物血凝素(PHA)刺激的外周血淋巴细胞转化体系中,用3H-TdR标记β液体闪烁计数仪检测细胞增殖,观察对混合淋巴细胞反应和淋巴细胞转化的影响。结果:从人脐血中分离获得的MSCs,呈成纤维样的细胞形态,CD29和CD105表达阳性,CD34和CD45表达阴性;在成骨诱导剂诱导下,具有成骨细胞样表型,可表达碱性磷酸酶,并形成矿化结节;人脐血源性MSCs经成骨诱导分化后在体外对混合淋巴细胞反应和PHA诱导的淋巴细胞转化均具有明显的抑制作用,抑制作用与细胞数量呈正相关。结论:脐血源性MSCs诱导为成骨细胞后对同种异体淋巴细胞具有免疫调节作用,为其作为骨组织工程异基因种子细胞来源打下基础。     

人脐带间充质干细胞抑制同种异体脐血淋巴细胞的转化

目的探讨人脐带间充质干细胞(UCMSCs)的生物学特性及其对同种异体脐血淋巴细胞转化的影响。方法从人脐带中分离、培养得到间充质干细胞,通过免疫细胞化学染色等方法对其进行表型鉴定;同时采用MTT法检测UCMSCs对同种异体脐血淋巴细胞转化的影响,以验证UCMSCs在免疫调控方面的作用。结果成功培养出UCMSCs,培养至第3代的UBMSCs形态为均一梭形,细胞倍增时间为51.6 h。细胞表面表达MSCs相关抗原CD29,但不表达造血细胞相关抗原CD34,细胞化学染色显示PAS(+)、NBE(+)、POX(-),表明此种自脐带中分离得到并诱导扩增的成纤维样细胞为间充质干细胞;UCMSCs对PHA刺激的脐血淋巴细胞,增殖反应具有免疫抑制作用,且该作用与UCMSCs接种数量有关,当接种量为2 000个/孔时,抑制率高达60.8%。结论 UCMSCs具有免疫抑制作用,能抑制同种异体脐血淋巴细胞的转化,且此种抑制作用与接种的脐血淋巴细胞数量有关。     

胎盘源间充质干细胞对T淋巴细胞体外增殖的影响

目的从人胎盘组织中分离培养获得间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）,并进一步研究其对T淋巴细胞体外增殖的影响。方法首先从胎盘组织中分离培养胎盘间充质干细胞（PMSCs）,在体外观测其形态,并通过细胞表面抗原表达、分化潜能等特征进行鉴定;然后将体外分离培养扩增的PMSCs,按照不同比例加入双向混合淋巴细胞培养体系（mixed lymphocyte reaction,MLR）中,共同培养6d后,测定T淋巴细胞的增殖。结果从人胎盘组织中分离培养获得问充质干细胞,具有与骨髓间充质于细胞（BMSCs）极为相似的细胞形态及细胞表面标志,表达CD29、CD44和CD105,不表达CD34、CD45、CD106和HLA—DR,并且还具有与BMSCs相似的跨胚层分化能力,能在一定条件下被诱导分化出神经元样细胞。PMSCs与同种异体混合淋巴细胞共同培养能抑制T淋巴细胞的体外增殖。结论胎盘组织是MSCs的有效来源,PMSCs具有与BMSCs相似的生物学特性及免疫调节机制。它为问充质干细胞的研究提供了又一重要的细胞来源。     

骨髓间充质干细胞体外对T淋巴细胞分泌IL-2、IL-4功能的影响

目的探讨间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)对T淋巴细胞分泌功能的调节作用.方法体外分离培养、扩增人骨髓MSCs,并通过形态学特征及流式细胞术检测其表面标志加以鉴定.将不同数量的MSCs(5×103、1×104、5×104个细胞/孔)分别与PHA激活的T细胞和混合淋巴细胞反应(MLR)体系共培养,并将不同浓度(25%、50%、75%)的MSCs培养上清和MLR体系共培养.应用ELISA分别检测各培养上清液中T细胞分泌IL-2、IL-4的水平.结果骨髓MSCs能抑制PHA作用下的T细胞分泌IL-2、IL-4(P＜0.05),并呈MSCs数量相关性(P＜0.05),且对IL-2的抑制作用更显著;也可抑制MLC体系中T细胞分泌IL-2、IL-4(P＜0.05),但各数量组的MSCs的抑制作用无显著性差异(P＞0.05).不同浓度的MSCs培养上清均可抑制MLC体系中T细胞分泌IL-2、IL-4(P＜0.05),但不同浓度的MSCs培养上清组对IL-4抑制作用无显著性差异(P＞0.05).结论骨髓MSCs及其培养上清均可抑制PHA或异体抗原作用下的T细胞分泌IL-2、IL-4,提示MSCs可能是直接作用于T细胞或通过分泌可溶性因子调节 Th1/Th2反应平衡而发挥免疫调节作用的.     

无血清培养对人绒毛膜来源间充质干细胞免疫活性的影响

目的 评价人绒毛膜来源间充质干细胞(MSCs)在无血清培养体系中的免疫活性,探索干细胞安全的应用于临床的条件.方法 应用无血清与含10％胎牛血清培养基培养人绒毛膜来源MSCs,比较两种培养条件下培养细胞的形态、免疫表型、分化潜能及对混合淋巴细胞反应的抑制作用等生物学特性.结果 两种方法培养的细胞形态相似,表达CD73、CD90、CD105,不表达CD34、人类白细胞抗原(HLA)-DR;具有多向分化潜能,同样能明显抑制混合淋巴细胞反应体系中淋巴细胞的增殖,抑制率与加入的干细胞数量成正比,可以减少混合淋巴细胞反应中白细胞介素2、γ-干扰素的分泌.结论 人绒毛膜来源间充质干细胞经无血清培养后仍保持原有的细胞形态、免疫表型、多向分化等生物学特性,没有改变免疫学活性.无血清培养可取代有血清培养用于细胞培养,避免经有血清培养的干细胞移植等临床应用研究引起的免疫原性反应及人畜共患病.     

慢性再生障碍性贫血患者间充质干细胞对T细胞的抑制作用

目的比较来源于正常志愿者和慢性再生障碍性贫血(CAA)患者骨髓间充质干细胞(MSCs)免疫抑制作用的区别。方法培养5例正常志愿者和10例CAA患者的骨髓MSCs,比较两组MSCs的形态、细胞表型、细胞因子的表达,通过PHA刺激的T细胞增殖试验、混合淋巴细胞培养和T细胞周期检测比较两组MSCs对T细胞的抑制作用。结果两组MSCs形态、表型基本相同。CAA来源的MSCs对PHA和同种异体抗原诱导的T细胞的抑制作用均低于正常志愿者来源的MSCs,加入正常志愿者的MSCs后有更多的T细胞阻滞在G0/G1期,但CAA来源的MSCs作用较弱。两组MSCs表达的肝细胞生长因子(HGF)和转化生长因子(TGF-β2)无明显区别,但CAA患者的MSCs表达的TGF-β1、3较正常志愿者MSCs表达的明显减少。结论虽然CAA的MSCs在形态、增殖和细胞表型上基本正常,但其对T细胞的抑制作用减弱,在经过免疫抑制剂治疗后仍然存在,其异常是否与CAA的发病机制有关需要进一步研究。     

霉酚酸及其衍生物对人T淋巴细胞及混合淋巴细胞免疫应答的影响

目的探讨霉酚酸及霉酚酸衍生物对人T淋巴细胞和混合淋巴细胞免疫应答的影响。方法从正常人外周血中分离单个核淋巴细胞(PBMC),在抗CD3刺激下和混合淋巴细胞反应体系中,加入或不加霉酚酸及其衍生物共培养,应用ELISA和流式细胞术检测CD4+和CD8+T细胞细胞因子的产生、细胞活化和增殖情况。结果经抗CD3刺激后,PBMC产生的细胞因子明显增加,加入霉酚酸及其衍生物后,IFN-γ及TNF-α明显降低,IL-2产生略有增加。在混和淋巴细胞反应体系中,3种细胞因子产生皆被抑制。抗CD3刺激和混和淋巴细胞反应后,T细胞表面活化分子CD25及CD69表达增加,加入霉酚酸及其衍生物共培养24、48 h后,T细胞CD25及CD69的表达并未被抑制。霉酚酸及其衍生物可抑制抗CD3刺激下和混和淋巴细胞反应后T细胞的增殖。结论霉酚酸及其衍生物对T淋巴细胞和混合淋巴细胞体系中因子的产生和细胞增殖都有抑制作用,为其在临床自身免疫疾病及移植排斥中的广泛应用提供了理论依据。     

骨髓间充质干细胞的体外扩增及其对T淋巴细胞产生IFN-γ和IL-10的影响

为了探讨骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSC)对T淋巴细胞分泌功能的免疫调节作用,从人骨髓分离培养MSC,通过其形态的均一性及流式细胞术检测表面标志以鉴定其纯度;从外周血分离获得T淋巴细胞,再将MSC分别以不同数量加入到植物血凝素(PHA)刺激的外周血T淋巴细胞和混合淋巴细胞反应(MLR)培养体系及不同浓度MSC培养上清加入混合淋巴细胞反应培养体系共培养后,分别收集上清,ELISA检测IFN-γ和IL-10水平,发现不同细胞数量的MSC对T细胞分泌细胞因子IFN-γ均有抑制,同时促进IL-10分泌,且其抑制和促进均呈剂量依赖性;MSC的不同上清浓度对IFN-γ抑制亦呈浓度依赖性,但未发现对IL-10分泌的影响。表明骨髓MSC在体外可抑制T细胞分泌IFN-γ、促进分泌IL-10,起到免疫调节作用。     

脐带间充质干细胞对T细胞的免疫调控研究

目的:研究脐带源间充质干细胞(UC-MSCs)异源T淋巴细胞的免疫调节作用.方法:从脐带中分离和培养间充质干细胞,流式细胞术检测其表面标志以鉴定纯度;用Brdu法测定细胞增殖率,观察UC-MSCs对异体T淋巴细胞增殖的影响;流式细胞仪检测共培养体系中CD4 、CD8 水平检测及UC-MSCs对T淋巴细胞转化的影响;且用ELISA法检测共培养上清细胞因子IL-4、IFN-γ的表达水平.结果:从脐带获得的MSC免疫表型分析显示,其不表达HLA-Ⅱ抗原.对PHA刺激的脐带血T淋巴细胞,UC-MSCs对其的增殖反应具有抑制作用,呈细胞数量剂量依赖性;UC-MSC与脐带血单个核细胞共培养体系中,CD8 细胞比例降低,与对照组有显著性差异(P＜0.01),CD4 细胞比例无明显变化(P＞0.05);UC-MSC抑制了共培细胞养体系中IFN-γ分泌,然而促进了IL-4的分泌,与对照组有显著性差异(P＜0.01).结论:UC-MSCs抑制PHA刺激的T淋巴的增殖,能够改变T细胞亚群及T细胞分泌的细胞因子,这种抑制特性表明,UC-MSCs对免疫反应具负调节作用,可能为GVHD的防治以及自身免疫性疾病治疗提供一条新途径,有助于UC-MSC的临床应用.     

CTLA4—Ig影响T细胞功能及机理的初步研究

目的：研究CTLA4-Ig融合蛋白对外周血T淋巴细胞活化的抑制作用及机理。方法：分离新鲜人外周血单个核细胞,观察CTLA4-Ig对淋巴细胞转化和混合淋巴细胞培养的作用,用流式细胞术观察CTLA4-Ig对T细胞表面CD25表达的影响,最近通过EMSA方法检测激活T细胞中核蛋白的变化。结果：CTLA4-Ig能够抑制淋巴细胞转化和混合淋巴细胞反应,减低T细胞表面CD25的表达,抑制核内与IL-2表达相关的RE/AP结合因子的活化。结论：CTLA4-Ig通过多种信号途径对T细胞的活化起作用,其机制之一是抑制核内结合于IL-2增强子RE/AP位点的核因子的活化。     

足月小样儿及正常胎儿脐血间充质干细胞的分离培养及形态学观察

目的建立一种简单实用的脐血间充质干细胞(MSCs)的分离培养方法,观察其生物学特性,为脐血MSCs在临床的广泛应用奠定基础。方法无菌条件下采集足月小样儿和足月正常胎儿分娩脐血,密度梯度离心法分离脐血单个核细胞,采用MesencultTM培养基培养,观察脐血MSCs的生物学特性,免疫荧光方法检测其表面标记物的表达情况。结果采用MesencultTM培养基,正常儿脐血MSCs培养成功率为66.67%,相同培养条件下,足月小样儿脐血培养成功率低于正常体重胎儿的脐血。人脐血MSCs强表达CD29、CD44和CD90,不表达造血干细胞表面标志CD34。结论我们建立了最佳的脐血MSCs的分离培养方法。     

Cord blood mesenchymal stem cells: Potential use in neurological disorders

Our previous studies demonstrate enhanced neural protective effects of cord blood (CB) cells in comparison to stem cells from adult marrow. To determine further whether mesenchymal stem cells (MSCs) derived from human umbilical cord blood (hUCB) possess optimal characteristics for neural therapy, we isolated populations of plastic-adherent CB MSCs. These cells generated CD34-, CD45-, CD11b-, CD3-, CD19- cells in culture and failed to produce CFU-M, CFU-GEMM, or CFU-GM hematopoietic colonies in methylcellulose. However, cultured CB MSCs possessed a remarkable ability to support proliferation as well as differentiation of hematopoietic cells in vitro. In addition, supernatants from cultured CB MSCs promoted survival of NT2 N neural cells and peripheral blood mononuclear cells (MNCs) cultured under conditions designed to induce cell stress and limit protein synthesis. After incubation in neural differentiation medium, CB MSCs expressed the neural cell-surface antigen A2B5, the neurofilament polypeptide NF200, the oligodendrocyte precursor marker 04, intermediate filament proteins characteristic of neural differentiation (nestin and vimentin), as well as the astrocyte marker glial fibrillary acidic protein (GFAP) and the neural progenitor marker TUJ-1. We examined the immunomodulatory effects of the CB MSCs after co-culture with murine splenocytes. Whereas spleen cells from normal C57Bl/6 mice exhibited a prominent immunoglobulin M (IgM) response after immunization with the T cell-dependent antigen sheep red blood cells, this response was significantly decreased after incubation with CB MSCs. These data indicate that CB MSCs possess multiple utilities that may contribute to their therapeutic potency in the treatment of neurological disorders.     

An inhibitor of lymphocyte proliferation and lymphokine production released by unstimulated foetal monocytes.

Supernatants obtained from 3-day cultures of cord blood monocytes inhibited normal lymphocyte activation by either PHA or in a two-way MLC. Both lymphocyte transformation and lymphokine production was significantly inhibited by these supernatants but not by those derived from adult mononuclear cell cultures. The inhibitory material produced by foetal monocytes was dialysable and was non-cytotoxic to target cells. It is postulated that this factor contributes to the depressed maternal cell-mediated immune response observed in pregnancy.     

人脐静脉来源的间质干细胞体外分离扩增及多向分化的研究

目的： 探讨人脐静脉来源的间质干细胞(MSCs) 的体外分离、纯化、扩增和多向分化条件。 方法： 无菌条件下取正常人脐静脉,1%胶原酶Ⅱ消化脐静脉细胞，以IMDM作为培养基进行培养和纯化细胞，瑞氏染色和电镜观察形态；FACS检测其免疫表型和细胞周期；体外诱导成骨细胞、脂肪细胞分化，von Kossa染色、油红O染色和RT-PCR检测骨钙蛋白、脂蛋白脂酶mRNA的表达以检测细胞向成骨、成脂肪细胞分化情况。 结果： 脐静脉来源的细胞呈纤维样贴壁生长，瑞氏染色和电镜观察具有MSCs特征；FACS检测结果显示, 表达MSCs相关的抗原CD29、CD44、CD105，而CD31、CD13、CD34、CD45、HLA-DR为阴性；体外诱导成骨细胞、脂肪细胞分化成功。 结论： 人脐静脉来源的MSCs的细胞形态、生长特性、免疫表型、多向分化能力与骨髓来源的MSCs相似，可作为满足实验和临床需要的MSCs来源。     

Immune modulation exerted by thymic humoral factor (THF-gamma 2), on T-cell subsets and IL-2 production of umbilical cord blood lymphocytes

The effect of a synthetic thymic humoral factor, THF-gamma 2, on the immune competence of T-cells was investigated in vitro on lymphocytes from human cord blood (UCBL). It was found that preincubation of UCBL with THF-gamma 2 caused an increase in the percentage of cells expressing the CD4 or the CD8 differentiation antigens, but did not affect the percentage of CD3 cells. The effect of THF-gamma 2 on PHA-induced IL-2 secretion was also studied and found that a 3hr preincubation with THF-gamma 2, prior to suboptimal PHA stimulation caused an increase in the IL-2 activity of the treated UCBL cultures. This effect was THF-gamma 2 dose dependent with an optimum in the range of 300-600 ng/ml and was not influenced by irradiation of the UCBL. These results indicate that THF-gamma 2, a synthetic octapeptide, modulates the immune state and response of human umbilical cord blood lymphocytes.     

两种分离脐血间充质干细胞的方法比较

背景：目前分离脐血间充质干细胞的方法很多,尚没有确定一种为最有效的方法。 目的：寻找一种最为可靠的脐血间充质干细胞分离方法。 方法：应用Percoll分离液法和羟乙基淀粉沉降法对脐血进行分离得到单核细胞,在含体积分数15%新生牛血清的DMEM/F12培养基中进行培养并传代。观察不同分离方法脐血单核细胞的回收率,每次传代的时间和细胞增值速度,培养过程中间充质干细胞形态的变化情况,并用流式细胞仪检测第3代细胞表面标志物CD90、CD44、CD34的表达。 结果与结论：与Percoll分离液法相比羟乙基淀粉沉降法获得的单核细胞多,单核细胞回收率高(P < 0.01),第1次传代时间短(P < 0.01)。然而两种方法获得的细胞经培养在形态的变化和表面标志物CD90、CD44、CD34的表达上差异并无显著性意义(P > 0.05)。所以羟乙基淀粉沉降法的分离效率较高,培养时间短,但是并不能获得质量较高的脐血间充质干细胞。     

脐血来源间充质干细胞可抑制异体T细胞的反应

目的研究脐血间充质干细胞(HUCB-MSCs)对异体T细胞的抑制作用。方法体外培养HUCB-MSCs,流式细胞术测表面标记;取正常人外周血,免疫磁珠分离CD3+T细胞,将分离的CD3+T与HUCB-MSCs 1∶1混合培养5 d,PHA刺激或不刺激,采用3H-TdR掺入法观察T细胞增殖,ELISA方法检测细胞因子,流式细胞术观察细胞凋亡。结果 HUCB-MSCs呈纺锤样的细胞形态,不表达CD14、CD34、CD45、HLA-DR,而表达CD29、CD44、HLA-ABC。HUCB-MSCs抑制PHA引起的T细胞增殖(5 230±550 vs 10 500±800 counts/min,P<0.001);HUCB-MSCs还能抑制异体T细胞分泌IFN-γ(510±60 vs 1 580±100 pg/mL,P<0.001)和TNF-α(590±20 vs 1 180±30 pg/mL,P<0.001),上调IL-4(16.3±8.2 vs 4.1±1.8 pg/mL,P<0.001)和IL-10(105±5 vs 17±2 pg/mL,P<0.001)分泌;HUCB-MSCs不诱导T细胞的凋亡。结论 HUCB-...     

Immunomodulatory function of whole human umbilical cord derived mesenchymal stem cells

Bone marrow derived mesenchymal stem cells (MSCs) play a critical role in immune modulation. However, immunomodulatory function of whole human umbilical cord derived mesenchymal stem cells (UC-MSCs) remains unclear. In this study, UC-MSCs were separated from whole umbilical cord using a single enzyme digestion. UC-MSCs (CD73⁺, CD90⁺, CD105⁺, and CD34⁻, CD45⁻, HLA-DR⁻) were differentiated into adipocytes, osteocytes and chondrocytes in vitro under specific stimulatory environments. UC-MSCs suppressed umbilical cord blood lymphocyte proliferation stimulated by mitogen, and ELISA showed that the secretion of INF-γ was downregulated, and the secretion of IL-4 was upregulated, with CD8⁺ T cells markedly decreased and CD4⁺ T cells changed lightly. Moreover, the infusion of UC-MSCs in recipient mice transplanted with donor bone marrow cells ameliorated acute graft-versus host disease (aGVHD) and extended survival. In conclusion, UC-MSCs might negatively modulate immunoreactions, and have application potential in the treatment of aGVHD caused by allogeneic stem cells transplantation.     

人脐血和外周血内皮祖细胞的分离培养和鉴定

背景：国内外有关内皮祖细胞的分离培养和鉴定方面的文章很多,但是人脐血和外周血内皮祖细胞的鉴别方面文章不多。 目的：从人脐血和外周血中分离出内皮祖细胞,并对其进行培养和鉴定。 方法：选取密度梯度离心法从脐血和外周血中分离获得单个核细胞,按照1× 10⁶/cm²的浓度种植于预先铺有纤维连接蛋白的培养板中,用含血管内皮生长因子的M199培养基进行诱导培养。 结果与结论：人脐血和外周血中存在内皮祖细胞,浓度梯度离心联合贴壁筛选获得的单个核细胞在血管内皮生长因子的诱导培养下可分化成内皮祖细胞,内皮祖细胞表达CD34、CD133、CD105、KDR和CD31,能吞噬乙酰化低密度脂蛋白,结合荆豆凝集素1,它们可作为体外分选内皮祖细胞的标志。