猪传染性胃肠炎病毒SYBR-Green I荧光定量PCR检测方法的建立

为了建立猪传染性胃肠炎病毒SYBR-Green I荧光定量PCR检测方法,利用RT-PCR技术扩增出猪传染性胃肠炎病毒N基因中324 bp的片段,并克隆到pGEM-T Easy载体上,纯化的质粒作为模板进行SYBR Green I荧光定量PCR扩增并制作标准曲线,建立了猪传染性胃肠炎病毒的荧光定量PCR检测方法.该方法检测灵敏度可达5×101拷贝数.μL-1,与猪伪狂犬病毒、猪蓝耳病毒、猪圆环病毒、猪瘟病毒、猪细小病毒、猪乙型脑炎病毒均不发生交叉反应,具有良好的特异性和重复性.结果表明,建立的实时荧光定量PCR具有特异、敏感、快速、定量、重复性好等优点,可用于临床TGEVN基因的检测.     

牛传染性鼻气管炎病毒gE基因SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法的建立

目的 建立1种特异、灵敏、高效的检测IBRV gE基因的荧光定量PCR方法,并为鉴别IBRV野毒株和gE基因缺失疫苗株的感染提供技术手段.方法 根据IBRV gE基因保守序列,设计一对引物,建立荧光定量PCR反应体系和反应条件,利用10倍梯度稀释病毒DNA进行荧光定量PCR扩增,以检测本试验建立的荧光定量PCR的灵敏度.用IBRV、牛病毒性腹泻病毒、牛轮状病毒、MDBK细胞、牛血清等进行特异性检测.用模拟样品进行临床应用试验.结果 本试验建立的荧光定量PCR方法,其灵敏度约为70 DNA拷贝/μL,除了IBRV从其他病毒和样品未扩增出曲线,临床模拟样品检测结果为0.03TCID50.结论 本试验建立的荧光定量PCR方法具有特异性强、灵敏性高、快速,低污染等优点,因此临床上可以用于IBRV的检测和病原学调查.     

Taqman探针实时定量PCR检测猪伪狂犬病毒

选取猪伪狂犬病毒(PRV)基因组中gE基因,设计特异性引物和Taqman探针,利用实时定量PCR来定量检测PRV.利用PCR技术扩增猪伪狂犬病毒gE基因80 bp片段,并克隆到pMD18-T载体上,阳性重组质粒命名为pgE80.pgE80质粒进行10倍系列稀释,作为荧光PCR检测的标准模板,定量拷贝数,并绘制标准曲线.以提取的PRV、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪细小病毒(PPV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸障碍综合症病毒(PRRSV)和传染性胃肠炎病毒(TGEV)的DNA作为模板,进行特异性检测.该实时定量PCR方法,标准曲线斜率为-0.37,R2=0.992,可以检测到20个拷贝数.PRV能被扩增出S型荧光曲线,而其它病毒均未能扩出.用PRV强毒肌肉注射仔猪,定量PCR比普通PCR更能灵敏而特异地检出呼吸道排毒和血液带毒.建立的实时定量PCR方法可用于临床样品快捷、准确、方便地检测.     

禽坦布苏病毒TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立

【目的】建立禽坦布苏病毒(Avian Tembusu virus,ATmV)TaqMan实时荧光定量PCR检测方法。【方法】根据ATmV非结构蛋白NS1的基因特征,设计特异性的引物和探针,建立基于TaqMan探针检测ATmV的实时荧光定量PCR检测方法,对其特异性、重复性进行检测。用建立的TaqMan实时荧光定量PCR检测方法和之前建立的RT-PCR方法同时对临床15份疑似ATmV感染的病料进行检测,计算其符合率。【结果】成功建立了检测ATmV的实时荧光定量PCR检测方法,当NS1基因含量为(2.67×102)~(2.67×107)拷贝/μL时有良好的线性扩增,其扩增相关系数为0.998,扩增效率为99.9%。建立的ATmV实时荧光定量PCR检测方法敏感度高,最低检测限为2.67×102拷贝/μL;特异性强,对水禽常见病毒(如Ⅰ型鸭肝炎病毒、新型鸭呼肠孤病毒、禽流感病毒、禽Ⅰ型副粘病毒与番鸭细小病毒等)检测均为阴性;重复性好,组内变异系数和组间变异系数分别为0.39%~1.17%和0.51%~1.82%。对临床送检的15份病料,TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的阳性率为73.33%(11/15),RTPCR方法的阳性率为60.0%(9/15),2种方法的符合率为100.0%。【结论】建立了基于TaqMan探针的ATmV实时荧光定量PCR检测方法,该方法可应用于ATmV感染的早期检测。     

应用多重SYBR Green-Ⅰ实时荧光定量PCR检测甘蔗黄叶病毒和高粱花叶病毒

基于已报道的甘蔗黄叶病毒(Sugarcane Yellow Leaf Virus,ScYLV)cp基因和高粱花叶病毒(Sorghummosaic virus,SrMV)NSP基因序列设计特异性引物,建立了针对这两种病毒的实时荧光定量PCR(real time-quantitative,RT-qPCR)检测方法。在此基础上,利用扩增产物Tm值的不同,建立了可区分ScYLV与SrMV的多重SYBR Green-Ⅰ实时荧光定量PCR方法,两种病毒扩增产物的Tm值分别为80.8～82.8℃和84.6～86.6℃。检测数据显示:SrMV和ScYLV均有各自的特异性峰值出现,而健康植株无特异性峰值;在单独检测中的检出水平分别可达500和250 copy/μL;两种病毒Tm值的批内变异系数分别为0.03%和0.02%,批间变异系数分别为2.06%和3.12%。综上所述,所建立的多重SYBR Green-Ⅰ实时荧光定量PCR方法在对以上两种病毒的检测中具有较好的特异性、敏感性和稳定性。     

猪伪狂犬病毒SYBR-GreenⅠ实时定量PCR检测方法的建立

利用PCR技术扩增出猪伪狂犬病毒gH基因中187 bp的片段,并克隆到pGEM T栽体上,纯化的质粒作为PCR检测的标准模板,以10倍梯度稀释质粒为标准模板,进行SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR扩增并制作标准曲线.建立了猪伪狂犬病毒的荧光定量PCR检测方法.该方法检测灵敏度可达1.26×102拷贝·μL-1,与猪圆环病毒,猪细小病毒,猪繁殖与呼吸综合征病毒,猪瘟病毒不发生交叉反应,具有良好的特异性和重复性;对15份疑似病料进行了检测.发现均为荧光定量PCR阳性,而常规PCR只能检测出6份阳性.结果表明,建立的实时荧光定量PCR具有特异、敏感、快速、定量、重复性好等优点,可用于临床PRV感染的检测.     

应用多重SYBR Green—I实时荧光定量PCR检测甘蔗黄叶病毒和高梁花叶病毒

基于已报道的甘蔗黄叶病毒（SugarcaneYellowLeafVirus．SCYLV）cp基因和高粱花叶病毒（Sorghummosaicvirus．SrMV）NSP基因序列设计特异性引物．建立了针对这两种病毒的实时荧光定量PCR（re矗time-quantitative,RT-qPCR）检测方法。在此基础上,利用扩增产物‰值的不同,建立了可区分ScYLV与SrMV的多重SYBRGreen—I实时荧光定量PCR方法．两种病毒扩增产物的‰值分别为80．8～82．8℃和84．6～86．6℃。检测数据显示：SrMV和ScYLV均有各自的特异性峰值出现,而健康植株无特异性峰值;在单独检测中的检出水平分别可达500和250copy／ixL：两种病毒m值的批内变异系数分别为0．03％和0．0270．批间变异系数分别为2．0670和3．1270。综上所述．所建立的多重SYBRGreen—I实时荧光定量PCR方法在对以上两种病毒的检测中具有较好的特异性、敏感性和稳定性。     

鸭源PKC基因荧光定量PCR检测方法的建立

为建立基于鸭源宿主细胞的蛋白激酶PKC基因的实时荧光定量PCR检测方法。根据GenBank数据库的PKC基因设计、合成特异性引物,通过PCR技术扩增目的基因片段,构建重组质粒GV pXT19-TPKC,并以其为阳性标准品建立荧光定量PCR检测方法和标准曲线,进行重复性、特异性和敏感性验证。结果显示,荧光定量PCR标准曲线为y=-3.334 0x+44.199,相关系数为0.995 4,扩增效率为99.19%;熔解曲线仅出现单特异峰,未检测到H5亚型/H7亚型/H9亚型禽流感病毒疫苗毒株、新城疫病毒和鸭肝炎病毒等参考毒株的核酸样本的荧光信号。说明,建立的荧光定量PCR方法具有良好的稳定性、特异性和灵敏性。     

猪细小病毒SYBR Green Ⅰ实时定量PCR检测方法的建立

利用PCR技术扩增出猪细小病毒VP2保守区基因194 bp片段,并克隆到pGEM T载体上,纯化质粒作为PCR检测的标准模板,以10倍梯度稀释质粒为标准模板,进行SYBR GreenⅠ荧光定量PCR扩增并制作标准曲线,建立了猪细小病毒的荧光定量PCR检测方法.该方法检测灵敏度可达1.0×102拷贝/μL,与猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒、猪乙型脑炎病毒、猪伪狂犬病毒、猪瘟病毒和猪流感病毒不发生交叉反应,具有良好的特异性和重复性;对10份疑似病料和阴性病料进行了检测,发现10份均为荧光定量PCR阳性,而常规PCR只能检测出7份阳性.结果表明,建立的实时荧光定量PCR具有特异、敏感、快速、定量、重复性好等优点,可用于临床猪细小病毒(PPV)的检测.     

检测猪繁殖与呼吸综合征病毒SYBR Green I实时荧光定量PCR方法的建立及初步应用

利用反转录PCR(RT-PCR)技术扩增出猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)GP5基因部分片段,并克隆到pGEM-T Easy载体上,得到重组质粒作为荧光定量PCR检测的标准模板,以10倍梯度稀释模板,进行SYBR Green I荧光定量PCR扩增并制作标准曲线,建立PRRSV的荧光定量PCR检测方法.该方法检测灵敏度可达10拷贝/μL,与猪圆环病毒、猪乙型脑炎病毒、猪伪狂犬病毒、猪瘟病毒、猪流感病毒和猪细小病毒不发生交叉反应,具有良好的特异性和重复性;对16份临床疑似病料进行了检测,发现15份均为荧光定量PCR阳性,而常规RT-PCR只能检测出12份阳性.结果表明,建立的实时荧光定量PCR具有特异、敏感、快速、定量、重复性好等优点,可用于临床PRRSV感染的早期诊断以及分子流行病学调查.     

检测猪繁殖与呼吸综合征病毒SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法的建立及初步应用

利用反转录PCR （RT-PCR）技术扩增出猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)GP5基因部分片段,并克隆到pGEM-T Easy载体上,得到重组质粒作为荧光定量PCR检测的标准模板,以10倍梯度稀释模板,进行SYBR GreenⅠ荧光定量PCR扩增并制作标准曲线,建立PRRSV的荧光定量PCR检测方法。该方法检测灵敏度可达10拷贝/μL,与猪圆环病毒、猪乙型脑炎病毒、猪伪狂犬病毒、猪瘟病毒、猪流感病毒和猪细小病毒不发生交叉反应,具有良好的特异性和重复性;对16份临床疑似病料进行了检测,发现15份均为荧光定量PCR阳性,而常规RT-PCR只能检测出12份阳性。结果表明,建立的实时荧光定量PCR具有特异、敏感、快速、定量、重复性好等优点,可用于临床PRRSV感染的早期诊断以及分子流行病学调查。     

猪圆环病毒2型实时定量PCR检测方法的建立

用PCR技术从一临床病猪组织中扩增出猪圆环病毒2型（PCV2）417 bp片段,并克隆到pGEM-T Easy载体中,构建成含有PCV2基因片段的重组质粒。应用该重组质粒进行实时荧光定量PCR,建立了PCV2 DNA的实时PCR标准曲线及其直线回归方程。结果显示该方法重复性好,其检测灵敏度达到102拷贝/μL,检测样品时特异性强。此研究表明,所建立的PCV2 DNA实时定量PCR方法具有重复性好、敏感性高与特异性强等特点,能够用于PCV2的定量检测。     

坦布苏病毒荧光定量RT-PCR方法的建立

【目的】利用SYBR GreenⅠ荧光定量技术建立一种相对定量检测坦布苏病毒的方法。【方法】针对坦布苏病毒NS5、E基因分别设计了1对特异性引物,同时设计1对扩增内参基因β-actin引物,将PCR扩增的片段分别连接到pMD18-T载体上构建重组质粒,经筛选、鉴定纯化后,倍比稀释作为质控样品,用于实时荧光定量PCR中NS5、E基因及内参基因β-actin标准曲线的构建,并进行反应的灵敏性、特异性和重复性试验。【结果】结果显示标准曲线线性关系R2值均在0.99 以上, 检测极限约为1.0E+01拷贝数质粒DNA;特异性结果表明只能检测到坦布苏病毒的扩增曲线;批内和批间重复性试验的变异系数均小于0.5%;用已建立的方法对临床样品进行3次重复检测,病毒RNA的检出率为100%。【结论】本研究初步建立了基于坦布苏病毒NS5、E基因的SYBR GreenⅠ荧光定量RT-PCR的方法,为养鸭场诊断和监测坦布苏病毒提供了一种新的特异、灵敏的检测方法。     

猪圆环病毒Ⅱ型TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立与应用

【目的】建立一种能在临床上快速、准确检测猪圆环病毒Ⅱ型(PCV-2)的TaqMan实时荧光定量PCR方法。【方法】根据GenBank中已公布的PCV-2陕西分离株的全基因序列,在PCV-2的ORF2核苷酸序列的保守区域,设计合成1条TaqMan探针和1对特异性引物;利用设计的引物扩增ORF2部分基因并鉴定后,回收PCR扩增产物,连接pMD19-T载体,转化DH5α大肠杆菌,涂布Amp+琼脂平板,挑取阳性克隆进行PCR及测序鉴定后提取质粒,作为荧光定量PCR的标准品;以标准品为模板建立检测PCV-2的TaqMan实时荧光定量PCR方法,并对该方法的灵敏度、稳定性和特异性进行评价;用建立的荧光定量方法对56份临床样品进行检测,并将检测结果与传统PCR方法进行比较。【结果】建立了PCV-2的TaqMan实时荧光定量PCR检测方法,其标准曲线的斜率为-3.383,R2=0.998,具有良好的线性关系;重复性试验结果表明,该方法循环数阈值Ct的变异系数(CV)为0.86%～1.02%,具有良好的稳定性;敏感性检测结果表明,该方法的最低检测限度为5.06copies/μL;特异性检测结果显示,该方法对猪圆环病毒Ⅰ型(PCV-1)、伪狂犬病病毒(PRV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和猪瘟病毒(CSFV)的检测结果均为阴性,对PCV-2标准品的检测结果为阳性,说明该方法具有较好的特异性。临床样品的检测中,所建立的Taq-Man实时荧光定量PCR检测方法的检出阳性率较传统PCR方法高14.3%。【结论】成功建立了PCV-2的TaqMan实时荧光定量PCR检测方法,该方法可用于临床上对PCV-2的检测。     

猪传染性胃肠炎病毒SYBR-Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法的建立

为了建立猪传染性胃肠炎病毒SYBR-Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法,利用RT-PCR技术扩增出猪传染性胃肠炎病毒N基因中324 bp的片段,并克隆到pGEM-T Easy栽体上,纯化的质粒作为模板进行SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR扩增并制作标准曲线,建立了猪传染性胃肠炎病毒的荧光定量PCR检测方法.该方法...     

一种改良的猪圆环病毒2型荧光定量PCR检测方法的建立

[目的]利用SYBR Green Ⅰ荧光染料建立一种快速、灵敏的用于检测猪圆环病毒2型的荧光定量PCR方法.[方法]根据猪圆环病毒2型ORF2保守区的基因片段,扩增目的基因645 bp插入至PUC57载体,以重组质粒为模板进行荧光定量PCR反应条件优化及灵敏度、特异性等验证.[结果]建立的猪圆环病毒2型绝对定量检测方法与猪圆环病毒1型、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒、猪细小病毒、猪博卡病毒无交叉反应.检测猪圆环病毒2型的灵敏度是5.0×101 copies/μL,建立的标准曲线回归方程的相关系数0.999,扩增效率105.403％.[结论]成功建立一种特异性强、敏感性高、稳定性良好的绝对定量检测猪圆环病毒2型的荧光定量PCR方法,可以用于临床样品猪圆环病毒2型的检测.     

鸭肠炎病毒核衣壳蛋白质互作蛋白质基因荧光定量PCR检测方法的建立

为进一步阐明鸭肠炎病毒(DEV)的致病机理,本试验建立检测鸭肠炎病毒核衣壳蛋白质(NP)的互作蛋白质(PKCI)基因荧光定量PCR方法。针对PKCI基因设计特异性引物,经PCR扩增目的基因构建重组质粒p MD18-T-PKCI,将其作为阳性标准品构建荧光定量PCR标准曲线,并对建立的荧光定量PCR方法进行重复性、特异性和敏感性试验。结果显示:标准曲线的线性关系为Y=-3.31x+42.00,相关系数为-1.00,扩增效率为100%,熔解曲线仅出现单特异峰,对H5亚型、H7亚型和H9亚型禽流感病毒及新城疫病毒、鸭肝炎病毒均未检测到荧光信号。表明本试验建立的方法具有良好的稳定性、特异性和灵敏性。     

马铃薯卷叶病毒外壳蛋白基因克隆转化及其转基因后代的表达

根据GenBank中的马铃薯卷叶病外壳蛋白基因(PLRV-CP)全序列,设计一对特异性引物,以马铃薯卷叶病毒RNA为模板,克隆了马铃薯卷叶病外壳蛋白基因,在pBI121的基础上构建了植物表达载体。利用PLO(Poly-L-Ornithine)将PLRV-CP基因导入到马铃薯加工型品种大西洋的原生质体中,获得了转基因后代。在5株转化后代中扩增出长度为610bp的目标DNA片断,说明导入的外源PLRV-CP基因已经整合到马铃薯基因组中。Southern blot分析结果进一步证明了PCR结果的正确性。RT-PCR结果表明,在3株转化后代叶片中具有阳性表达。马铃薯卷叶病毒接种实验结果表明,转基因植株比对照有明显的马铃薯卷叶病抗性。     

中华鲟基因SYBR Green实时荧光PCR检测方法的建立

根据NCBI上已公布的中华鲟D-loop基因、细胞色素b基因、12S rRNA基因的核酸序列设计出4对引物,经SYBR Green实时荧光PCR反应、熔解曲线分析和扩增片段克隆测序后,发现针对D-loop基因的F2 - R1引物能够高效、特异地实现对靶序列扩增,选择其作为中华鲟基因特异性扩增引物,建立中华鲟基因SYBR Green实时荧光PCR检测方法.所建立的中华鲟D -loop基因SYBR Green实时荧光PCR检测方法特异性好、可操作性强,具有较好的应用价值.     

双重RT-PCR法快速检测多种马铃薯病毒的研究

为建立快速、简便、灵敏度高、特异性强的RT-PCR检测马铃薯病毒技术,依据马铃薯X病毒、马铃薯S病毒、马铃薯A病毒以及马铃薯卷叶病毒的基因组RNA保守序列设计特异性引物对,从反转录和PCR等方面优化双重RT-PCR反应条件,同步扩增出上述四4种病毒,分别得到620(PVX)、435(PVS)、300(PVA)、222 bp(PLRV)大小的扩增片段。结果表明,反转录反应中引物浓度比例、dNTPs浓度和PCR反应中Mg2+浓度对双重RT-PCR检测多种马铃薯病毒的影响较大。优化的双重RT-PCR反应体系可以同步快速检测田间自然感染的马铃薯病毒,此方法还适合检测马铃薯脱毒种薯及试管苗,对马铃薯病毒病早期监测有一定的作用。