PDGFRB基因重排检测方法的建立

目的建立荧光原位杂交技术（fluorescent in situhybridization,FISH）检测PDGFRB基因重排的方法。方法依据PDGFRB断裂重排方式,设计、制备双色荧光探针。以人外周血培养淋巴细胞为检测对象评价PDGFRB基因重排检测探针的灵敏度和特异性,建立阴性阈值。以白血病患者的骨髓和外周血样本为对象进行PDGFRB重排检测性能评价。结果本研究建立的FISH检测方法在人外周血培养淋巴细胞检测中特异性和灵敏度均达到100％,在对28例样本检测中,筛查出1例PDGFRBFISH阳性样本。结论本研究制备的双色荧光探针可用于PDGFRB基因重排检测。     

免疫组化染色及荧光原位杂交法检测肺鳞状细胞癌中间变性淋巴瘤激酶基因蛋白表达情况的临床研究

目的应用免疫组化染色法、荧光原位杂交法检测肺鳞状细胞癌中间变性淋巴瘤激酶基因蛋白(ALK)的表达情况。方法选择2018年5月至2019年5月驻马店市中心医院收治的85例肺鳞状细胞癌患者作为研究对象,85例肺鳞状细胞癌患者均接受手术治疗,获取其术中切除肿瘤标本行免疫组化染色法检测ALK蛋白,经荧光原位杂交法检测EML4-ALK基因融合。结果85例肺鳞状细胞癌患者经免疫组化染色法对ALK蛋白检出阳性率为9例(10.59%),荧光原位杂交法对EML4-ALK基因融合检出率仅为2例(2.35%),差异有统计学意义(P<0.05)。结论肺鳞状细胞癌患者ALK表达阳性较为少见,荧光原位杂交法检测肺鳞状细胞癌EML4-ALK基因融合阳性率更低。     

ALK融合蛋白在肺癌转移灶细针穿刺涂片标本中的研究

目的探讨基于免疫细胞化学技术检测肺癌细针穿刺细胞学传统涂片标本中ALK融合蛋白表达的可行性。方法收集61例肺癌患者的转移淋巴结细针穿刺传统涂片标本,应用免疫细胞化学(ICC)方法,用罗氏Ventana全自动免疫组化仪检测ALK融合蛋白的表达情况,并与相应的荧光原位杂交(FISH)检测结果进行比较。结果 61例细针穿刺传统涂片中,ICC检测ALK融合蛋白阳性表达率为9.9%(6/61),肺腺癌ALK融合蛋白阳性表达率为10.9%(6/55),其他鳞状细胞癌等均阴性(0/6),与相应FISH检测结果比较,符合率为93.8%(15/16)(Kappa=0.871),敏感性为85.7%(6/7),特异性为100%(9/9)。结论对于无法手术或者活检的晚期肺癌患者,细胞学细针穿刺传统涂片标本的ICC检测可以作为肺癌EML4-ALK融合基因FISH检测前的常规筛查手段。     

1例伴有t（9；22）和ins（3；8）的慢性粒细胞白血病的临床和实验研究

目的报道1例伴有ins（3；8）的慢性粒细胞白血病（CML）病例及其3号、8号全染色体涂染、双色间期荧光原位杂交（FISH）、实时荧光定量PCR研究结果。方法骨髓细胞经直接法或24h短期培养法制备染色体标本，R显带技术进行核型分析；3号、8号全染色体涂染探针进行染色体涂染；bcr／abl双色双融合探针进行FISH分析；实时荧光定量PCR检测bcr／abl融合基因转录本及其拷贝数。结果骨髓细胞R显带核型分析提示，除t（9；22）外，所有细胞伴ins（3；8）；全染色体涂染证实3号染色体上插入一段8号来源的染色体片段；双色FISH检测到bcr／abl基因重排；实时荧光定量PCR检测到bcr／abl融合基因（b3a2）转录本。结论ins（3；8）是CML患者罕见的附加染色体异常；全染色体涂染是明确染色体插入易位的可靠手段。     

基于3′/5′端表达不平衡策略的荧光定量PCR法检测非小细胞肺癌患者血浆游离循环RNA中ALK融合基因

目的分析非小细胞肺癌(NSCLC)患者血浆游离循环RNA(cfRNA)中的ALK融合基因的表达水平,为指导临床个体化用药提供依据。方法选取经高通量测序验证的已知ALK融合基因的NSCLC患者13例、ALK融合基因阴性的NSCLC患者16例和30例体检健康者,采集各组血液样本并分离血浆cfRNA,用荧光定量PCR检测各组ALK基因3'端第20外显子(E20)和5'端3外显子(E3)的表达量,并计算ALK融合基因的表达水平。结果已知ALK融合基因的NSCLC患者、ALK融合基因阴性的NSCLC患者和体检健康者血浆cfRNA中ALK融合基因表达水平分别为278.3(45.3,987.4),4.08(0.38,9.04),3.77(0.34,8.37),各组间差异有统计学意义(H=29.93,P0.01);组间两两比较结果表明,已知ALK融合基因的NSCLC患者血浆中ALK融合基因的表达水平高于ALK融合基因阴性的NSCLC患者或体检健康者(U分别为0,0,P均0.01),而后两组间差异无统计学意义(U=232,P=0.86)。结论基于3'/5'端表达不平衡策略的荧光定量PCR法可以快速检测NSCLC患者血浆cfRNA中ALK融合基因。     

EML4-ALK融合基因与非小细胞肺癌研究新进展

肺癌是目前中国恶性肿瘤中发病率、死亡率最高的恶性肿瘤之一,因肺癌发病隐匿,从基因突变到肿瘤瘤体形成经历了漫长的发病过程,然而在此病发病早期,由于缺乏典型的临床表现及不适,使得非小细胞肺癌往往在晚期得以确诊,传统的以铂类为主的一线化疗由于不良反应大、化疗后耐药进展、患者无法耐受化疗等众多因素的影响而使疗效进入平台期,近十年来随着基因分子生物学突飞猛进的发展,精准医学治疗思维的影响,以肿瘤发病机制为契机及肿瘤精准靶向治疗的问世和研究,非小细胞肺癌的基因精准靶向治疗快速发展,近年来研究证实棘皮动物微管相关蛋白样4(echinoderm microtubule associated protein like 4,EML4)/间变淋巴瘤激酶(anaplastic lymphoma kinase, ALK)融合基因是仅次于表皮生长因子受体(EGFR)的又一参与非小细胞肺癌发病的主要基因。我们就EML4 ALK融合基因突变与非小细胞肺癌（non small cell carcinoma, NSCLC)的最新研究做一综述。     

ALK在非小细胞肺癌中的表达

<正>间变性淋巴瘤激酶(ALK)于1994年首先发现于间变性大细胞淋巴瘤中;EML4-ALK融合基因于2007年首次发现,是新兴的生物标记物和治疗靶标[1]。我们检测了106例经手术切除的非小细胞肺癌组织标本,观察并分析ALK融合基因的表达情况以及阳性病例的临床病理特征。1材料与方法 1.1材料随机抽取吉林省肿瘤医院2010年至2013年间经手术切除的非小细胞肺癌106例,年龄     

阿来替尼治疗ALK阳性非小细胞肺癌伴多处转移1例

<正>肺癌是我国发病率和致死率第一的恶性肿瘤,非小细胞肺癌(NSCLC)占肺癌的85%以上。间变性淋巴瘤激酶(ALK)融合基因阳性是NSCLC的“钻石突变”,最常见的融合类型是棘皮动物微管相关蛋白样4(EML4-ALK)^[1]。研究显示,脑转移在20%～40%的初诊NSCLC患者中被发现,患者发生脑转移后在放化疗等多种治疗方案中预后均欠佳。     

非小细胞肺癌表皮生长因子受体基因突变和EML4-ALK融合基因表达的研究

目的研究广西地区非小细胞肺癌(NSCLC)表皮生长因子受体(EGFR)基因突变和棘皮动物微管相关类蛋白4与间变性淋巴瘤激酶(EML4-ALK)融合基因表达的情况。方法分别采用扩增耐突变系统(ARMS-PCR)法和实时荧光定量PCR扩增检测119例NSCLC患者EGFR基因外显子18~21的突变和9种EML4-ALK融合突变体,同时分析其与临床病理特征的关系。结果 119例NSCLC患者共检出44例EGFR基因突变,检出率为37.0%,检出7例EML4-ALK融合基因阳性表达,检出率为5.9%。其中EGFR基因突变主要见于腺癌、女性、不吸烟患者;EML4-ALK融合基因表达可能与不吸烟有关,而在性别、年龄、肿瘤病理类型、淋巴转移方面比较,差异无统计学意义(P0.05);EGFR基因突变与EML4-ALK融合基因不共存。结论广西地区NSCLC患者的EGFR基因突变率与EML4-ALK融合基因阳性表达率与中国其他地区总体水平接近,均具有一定临床病理特征。     

肺腺癌中Ventana ALK(D5F3)免疫组化检测结果的影响因素及对策

<正>2019年《中国非小细胞肺癌ALK检测临床实践专家共识》指出，Ventana ALK(D5F3)IHC、荧光原位杂交、荧光定量PCR、NGS均可用于ALK基因融合检测。共识对ALK检测强烈推荐优先应用Ventana ALK(D5F3)IHC进行检测^[1]。2020 年NCCN v6 指南更新推荐：Ventana-D5F3 IHC[Ventana ALK(D5F3)]伴随诊断作为独立ALK检测，无需FISH复核，可直接指导用药。     

New targets in advanced NSCLC: EML4-ALK

Targeted therapies aimed at inhibiting oncogenic tyrosine kinases are becoming commonplace in the treatment of cancer. The EML4-ALK fusion gene was first identified as a potentially targetable oncogenic driver in non-small cell lung cancer in 2007. A small molecule ALK inhibitor, crizotinib, may now be on the verge of approval by the US Food and Drug Administration for the treatment of ALK-rearranged lung cancer. Here we review the discovery of EML4-ALK, the development of clinical diagnostics for ALK rearrangements, the clinical epidemiology of lung cancers driven by EML4-ALK, and ongoing ALK inhibitor-based clinical trials.     

中山市非小细胞肺癌患者EGFR基因与EML4-ALK融合基因突变的统计分析

目的检测广东省中山市非小细胞肺(NSCLC)癌患者表皮生长因子受体(EGFR)基因和棘皮动物微管相关蛋白样-4与渐变性淋巴瘤激酶(EML4-ALK)融合基因的突变情况,及与NSCLC临床病理特征的关系。方法通过探针扩增阻滞突变系统(ARMS)荧光定量PCR法对到中山市人民医院就诊的753例NSCLC患者进行EGFR基因及EML4-ALK融合基因检测,研究其突变率及与临床特征的相关性,探讨NSCLC患者EGFR基因和EML4-ALK融合基因突变的意义。结果 753例NSCLC患者中EGFR基因突变率43.16%(325/753),其中19和21号外显子突变率最高,分别为43.08%(140/325)和47.38%(154/325),21号外显子主要是L858R突变。EGFR突变率高的NSCLC患者以女性、无吸烟史、腺癌、腺鳞癌、腺癌转移者多见(P0.05),与患者年龄无相关性(P0.05)。对EGFR基因检测中的110例病例同时进行了EML4-ALK融合基因检测,突变率为9.09%(10/110),突变体1型的突变率(80%)明显高于突变体2、3型(各10%),EML4-ALK基因突变患者多为年龄偏小者(P0.05),与性别、吸烟史及病理分型差异均无统计学意义(P0.05)。并检测到1例EGFR和EML4-ALK共存突变的患者。结论中山市NSCLC患者的EGFR突变率与国内外文献报道的结果基本一致,因此,EGFR基因及EML4-ALK融合基因检测是分子靶向治疗NSCLC患者的重要依据和必要检测手段。     

Diagnostic and therapeutic biomarkers for lung cancer patients

Identification of sensitive biomarkers predictive of diagnosis, prognosis and drug sensitivity could have a clinically significant impact on non-small cell lung cancer (NSCLC) treatment strategies. Recently, molecular-targeted therapies have been developed for NSCLC treatment. NSCLC patients with epidermal growth factor receptor (EGFR) gene mutations have shown a dramatic response to EGFR tyrosine kinase inhibitors (EGFR-TKI) such as gefitinib and erlotinib. In addition, target therapies against echinoderm microtubule-associated protein-like 4-anaplastic lymphoma kinase (EML4-ALK) fusion protein present in approximately 5% of the Japanese patients with adenocarcinomas are currently under development. In this paper, we reviewed diagnostic and therapeutic biomarkers for lung cancer patients.     

LAMP技术检测非小细胞肺癌患者外周血EGFR基因L858R位点突变方法的建立及应用

目的利用环介导等温扩增(LAMP)技术建立非小细胞肺癌(NSCLC)患者外周血靶点表皮生长因子受体(EGFR)基因L858R位点突变的快速筛查方法。方法在Genebank上查找EGFR 21号外显子(L858R)的DNA序列,利用Primer Explorer V4软件设计特异性引物,建立LAMP检测方法,并对其特异性和敏感性进行评价。采集11例临床病理诊断为NSCLC患者外周血血浆,以聚合酶链反应(PCR)扩增结果为标准,对建立的LAMP方法的准确性进行验证。结果采用自行设计的LAMP引物及构建的反应体系可特异性扩增EGFR L858R位点突变阳性DNA,检测敏感性为0.1%,特异性达到100%。LAMP法在11例EGFR L858R位点突变阳性的NSCLC患者血浆标本中检测到9例阳性。结论成功建立了LAMP检测人外周血浆EGFR基因突变方法,诊断敏感性、特异性和准确性均较高,可荧光目测判读检测结果,是一种简单、快速的EGFR基因突变筛查方法。     

非小细胞肺癌患者外周血循环内皮干细胞的检测及其临床意义

目的探讨外周血循环内皮祖细胞（endothelial progenitors cells,EPCs）与非小细胞肺癌患者的关系及临床意义。方法选择非小细胞肺癌患者45例和对照组15例,用抗CD133和KDR的单克隆抗体标记外周血细胞,应用流式细胞术检测其外周血中循环内皮祖细胞。应用Real-time RT-PCR方法检测患者外周血中CD133和KDR的mRNA表达水平。密度梯度离心法从人外周血分离出单个核细胞,将其接种在人纤维粘连蛋白包被培养板,在加有EGM-2-MV-SingleQuots的培养液中培养,在荧光显微镜下进行鉴定。其中U EA-1和D iI-A c-LDL染色双阳性细胞为正在分化的内皮祖细胞。结果肿瘤患者外周血中EPCs含量高于正常对照组（P〈0.01）,外周血中CD34和KDR的表达水平明显高于正常对照组。结论非小细胞肺癌患者外周血EPCs明显增高,为今后将EPCs作为非小细胞肺癌患者辅助诊断和治疗效果检测的标志物奠定基础。     

Development of a high-throughput and sensitive assay of fusion genes in lung cancer by array-based MALDI-TOFMS

ALK (anaplastic lymphoma kinase gene), ROS1 (ros proto-oncogene 1) and RET (ret proto-oncogene) fusions are oncogenic drivers in non-small cell lung cancer (NSCLC). Methods like fluorescence in situ hybridization (FISH) and immunohistochemistry (IHC) are highly sensitive but subjectively analyzed, labor intensive, expensive and unsuitable for multiple fusion gene screening. This study aimed to establish a high-throughput, sensitive and cost-effective screening method (array-based matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry, array-based MALDI-TOFMS) for ALK, ROS1 and RET fusion detection. This method was established with three fusion gene positive cell lines (H2228, ALK positive; HCC78, ROS1 positive; LC-2/AD, RET positive) and negative samples. Then, 34 clinical samples were selected and detected by Sanger sequencing, next generation sequencing (NGS) and array-based MALDI-TOFMS. The results were compared and analyzed and Sanger sequencing was considered the standard. 7 cases showed ALK fusions, 1 case showed ROS1 fusions, no case showed RET fusions and 4 cases were both ALK and ROS1 fusions. Results showed that array-based MALDI-TOFMS was 100% concordant with Sanger sequencing and NGS 82.3%. In this study, we reported the utility of array-based MALDI-TOFMS in the assessment of ALK, ROS1 and RET fusions in routine lung biopsies of FFPE and fresh tissue specimens. Besides, this method may also be applied to the diagnosis, monitoring and prognosis of illness.

This study established a high-throughput, sensitive and cost-effective method to detect three lung fusion genes of 96 samples at one time.     

非小细胞肺癌CT特征与驱动基因突变相关性影像基因组学研究进展

Driver genes of non-small cell lung cancer (NSCLC) include EGFR, KRAS, BRAF, PIK3CA and ALK, etc. Obtaining precise molecular phenotype is the premise of target therapy. However, because of heterogeneity of NSCLC, the genetic mutations of the tumor may not be accurately obtained from small biopsy samples. As a routine modality for NSCLC, CT may comprehensively reflect the underlying pathophysiology and molecular biology of the tumors. Radiogenomics, which is focusing on defining relationships between image features (image phenotypes) and molecular markers (molecular phenotypes), has a broad prospect in the prediction of driver gene mutations of NSCLC. Progresses of radiogenomics in association between CT features and driver gene mutations of NSCLC were reviewed in this article.     

荧光原位杂交技术检测BCR/ABL融合基因

目的建立荧光原位杂交(FISH)技术,直接原位检测间期细胞中BCR/ABL融合基因,辅助临床诊断和治疗慢性粒细胞性白血病(CML)。方法应用FISH技术检测15例CML患者骨髓培养细胞BCR/ABL融合基因,其中5例CML患者同时取骨髓直接涂片检测,5例CML患者同时取外周血浓缩单个核细胞直接涂片检测。以5例非CML患者骨髓培养细胞为阴性对照。结果15例患者骨髓标本成功培养10例,染色体分析检测到Ph1染色体8例。15例患者骨髓培养细胞FISH检测BCR/ABL融合基因阳性14例。5例CML患者同时做骨髓直接涂片FISH检测,结果阳性4例。5例CML患者同时做血标本浓缩单个核细胞FISH检测阳性2例。5例非CML患者FISH结果均阴性。结论FISH技术能直接原位检测间期细胞中BCR/ABL融合基因,且快速、可靠、成功率高,是诊断和监测CML的一项有效新技术。