消岩汤通过WNT通路抑制肺腺癌A549细胞增殖、促进细胞凋亡的机制研究

[目的] 探讨扶正祛瘀解毒法经典用药消岩汤抑制人肺腺癌A549细胞增殖、促进细胞凋亡的可能机制。[方法] 体外培养A549细胞,乳酸脱氢酶（LDH）、CCK8、流式细胞术检测对照组、消岩汤组、消岩汤加WNT通路激动剂组、WNT通路抑制剂XAV939组、单独WNT通路激动剂组细胞毒性、存活率和凋亡率。通过聚合酶链式反应（RT-PCR）测定对照组、消岩汤组和WNT通路抑制剂XAV939组中WNT通路相关基因β-catenin、c-myc,凋亡相关基因Bcl-2、Caspase-3表达情况;通过荧光素酶报告基因检测反应WNT通路活性。[结果] 消岩汤可以抑制A549细胞的增殖,促进细胞凋亡,而消岩汤加WNT通路激动剂组可以减弱以上作用;同时消岩汤可以显著降低A549细胞中β-catenin、c-myc的表达水平,抑制WNT通路活性,并通过降低Bcl-2表达、增强Caspase-3表达来促进了肿瘤细胞凋亡。[结论] 扶正祛瘀解毒法消岩汤可以抑制A549细胞的增殖、促进凋亡,其作用机制可能是抑制WNT通路活性。     

姜黄素对A549细胞亚群SP及NON-SP细胞凋亡的诱导作用

目的 探讨姜黄素对人肺腺癌A549细胞亚群SP及NON-SP生长的影响及其作用靶点。方法 从A549细胞中分选出SP及NON-SP细胞,通过软琼脂克隆形成实验及体外致瘤性对其进行鉴定。将SP及NON-SP细胞用不同浓度的姜黄素（10、20、30、40 μmol/L）处理,MTT法检测姜黄素对SP及NON-SP细胞生长的抑制作用;荧光定量PCR法检测细胞中survivin、caspase-3基因表达。结果 不同浓度的姜黄素对SP、NON-SP细胞的生长产生不同程度的抑制作用,浓度为30 μmol/L的时细胞生存率最低,且与作用时间呈正相关,对SP细胞的抑制作用明显强于NON-SP细胞。姜黄素抑制survivin基因的表达,促进caspase-3基因的表达,其对SP细胞凋亡的诱导作用明显强于NON-SP细胞。结论 SP细胞的致瘤性高于NON-SP细胞。姜黄素主要通过抑制SP细胞的生长、下调survivin基因的表达和促进caspase-3基因的表达而产生诱导肿瘤细胞凋亡的作用。     

消岩汤介导TNKS抑制肺腺癌细胞生长的初步探讨

[目的] 探讨端锚聚合酶（TNKS）在消岩汤抗肺腺癌细胞作用中的表达及意义。[方法] 采用免疫组织化学检测37例肺腺癌患者癌及癌旁组织中TNKS的表达情况。实时荧光定量聚合酶联反应（qRT-PCR）检测梯度浓度消岩汤处理肺腺癌A549细胞后,TNKSmRNA水平的表达;CCK-8法、γ-H2AX细胞免疫荧光、DNA修复试验分别检测各组A549细胞的增殖、DNA损伤及DNA修复能力,划痕实验及Transwell小室分别检测各组A549细胞的迁移及侵袭能力。[结果] 1）TNKS蛋白在肺腺癌组织中的阳性表达率为63.00%,在癌旁组织中阳性表达率为18.92%,差异有统计学意义（P<0.05）。2）随消岩汤浓度升高,A549细胞中TNKSmRNA水平的表达降低。3）当TNKS被下调时,A549细胞增殖活性降低,γ-H2AX表达增强,细胞DNA修复能力、迁移和侵袭能力受抑制,同样给予消岩汤处理细胞后,结果与TNKS下调组一致。[结论] TNKS与肺腺癌细胞的增殖、DNA损伤修复、迁移和侵袭密切相关,消岩汤抗肿瘤作用可能与下调TNKS的表达有关。     

消岩汤剂拆方配伍对A549肺腺癌细胞体外生长抑制作用研究

[目的]探讨消岩汤及各拆方组对人肺腺癌A549细胞的体外生长的作用机制,探究消岩汤剂中最有效的作用成分和浓度。[方法]消岩汤全方和根据功效拆分的清热解毒组、活血化瘀组、益气扶正组,以CCK-8检测A549肺腺癌细胞的细胞增殖活性。[结果]各组均有明显的抑制细胞活性作用,抑制强度依次为:全方组、清热解毒组、活血化瘀组、益气扶正组。[结论]消岩汤及其拆方组在体外实验中均能抑制A549肺腺癌细胞细胞生长,消岩汤全方组当浓度达到50 g/L时达到最大抑制率为85.60%。清热解毒组药物在抗肿瘤作用方面,与全方接近,提示清热解毒组中药为体外实验中全方抗肿瘤作用最有效组分。     

基于VEGF/PI3K/AKT通路探讨消岩汤联合阿帕替尼抑制胃癌MGC-803细胞增殖的作用机制研究

[目的] 明确消岩汤通过血管内皮生长因子（VEGF）/磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）/丝苏氨酸蛋白激酶（AKT）通路治疗胃癌的作用机制。[方法] 通过CCK-8检测消岩汤对MGC-803细胞增殖的影响;通过流式细胞术检测消岩汤对MGC-803细胞凋亡和周期的影响;通过蛋白免疫印迹（Westernblot）检测消岩汤、阿帕替尼及其联合用药作用于MGC-803细胞后VEGF/PI3K/AKT信号通路相关蛋白的表达。[结果] 消岩汤呈剂量依赖性抑制MGC-803细胞的增殖（P<0.05）,其半抑制浓度（IC₅₀）为63.56mg/mL;随着消岩汤浓度的增加,MGC-803细胞的总凋亡率逐渐升高（P<0.05）;随着消岩汤浓度的增加,MGC-803细胞的G0/G1期细胞所占百分比逐渐降低（P<0.05）,S期细胞所占百分比逐渐升高（P<0.05）,G2/M期细胞所占百分比变化不大（P>0.05）;与空白对照组比较,消岩汤组、阿帕替尼组及其联合用药组的p-PI3K、p-AKT、Bcl-2、血管内皮生长因子A（VEGFA）和血管内皮细胞生长因子受体2（VEGFR-2）蛋白的表达量显著下调（P<0.05）,Cleaved Caspase-9和Bax蛋白的表达量显著上调（P<0.05）,相较于单药组,联合用药组对相关蛋白的调控作用更强。[结论] 消岩汤能有效抑制人胃癌MGC-803细胞增殖,诱导凋亡以及S期阻滞,抗胃癌作用机制与其对VEGF/PI3K/AKT信号通路的调控相关。     

荷包牡丹碱诱导人肺腺癌细胞A549凋亡及其机制初探

 目的 探讨荷包牡丹碱对人肺腺癌细胞A549的增殖抑制作用并对其作用机制进行研究。方法 MTT比色法检测荷包牡丹碱在不同浓度及不同时间对人肺癌细胞A549的增殖抑制作用。利用TUNEL法探讨荷包牡丹碱诱导人肺腺癌细胞A549的凋亡效果;流式细胞术（FMC）测定荷包牡丹碱对A549肿瘤细胞周期的分布;比色法测定荷包牡丹碱对半胱天冬酶（caspase）-3蛋白活性的影响。结果 荷包牡丹碱对人肺腺癌细胞A549增殖抑制作用随着药物浓度的升高和作用时间的延长而增强;荷包牡丹碱对A549肿瘤细胞具有明显的凋亡效应;荷包牡丹碱与A549肿瘤细胞作用后,发生S期阻滞（P<0.05);荷包牡丹碱促使caspase-3蛋白活化(P<0.05)。结论 荷包牡丹碱能有效抑制人肺腺癌细胞A549的生长,使细胞周期阻滞在S期,进一步诱导其凋亡,并使caspase-3蛋白活化。caspase-3蛋白的激活可能在荷包牡丹碱诱导A549细胞凋亡过程中起重要作用。     

消岩汤经Wnt通路抑制肺腺癌A549细胞增殖的机制研究

目的 探讨消岩汤经Wnt通路抑制人肺腺癌A549细胞增殖的可能机制。方法 体外培养A549细胞,加入梯度浓度消岩汤(10、50、100、200、300 g/L)后,采用CCK8法检测A549细胞存活率。通过PCR测定Wnt通路相关基因β-catenin、c-myc、凋亡相关基因bcl-2、caspase-3表达情况;通过荧光素酶报告基因检测反应Wnt通路活性。流式细胞术检测各组细胞凋亡率。结果 消岩汤可以剂量和时间依赖性地抑制A549细胞的增殖,同时消岩汤可以剂量依赖性地显著降低A549细胞中β-catenin、c-myc的表达水平,抑制Wnt通路活性,并通过降低bcl-2表达、增强caspase-3表达来促进了肿瘤细胞凋亡。结论 消岩汤可能通过抑制Wnt信号通路来抑制A549细胞的增殖、促进凋亡。     

川芎嗪对白血病U937细胞增殖和凋亡的作用及其机制研究

目的:研究川芎嗪(tetramethylpyrazine,TMP)对白血病U937细胞增殖与凋亡的影响,并初步探讨其作用机制。 方法:应用CCK-8法检测TMP对U937细胞的增殖抑制,流式细胞仪检测细胞凋亡及周期分布,采用Real-time PCR法检测bcl-2,P27 mRNA表达,Western blot检测bcl-2,caspase-3,cyclin E1,CDK2,P27的表达。 结果:川芎嗪呈时间剂量依赖的方式抑制U937细胞的增殖,作用48 h的IC₅₀为160 mg·L^-1;并且诱导U937细胞凋亡,阻滞细胞周期于G₀/G₁期;Real-time PCR及Western blot结果显示川芎嗪使U937细胞中凋亡相关分子bcl-2表达下调,caspase-3上调,周期相关蛋白cyclin E1,CDK2表达下调,P27上调。 结论:川芎嗪对白血病U937细胞呈抑制增殖及诱导凋亡的作用,其机制可能是通过影响细胞周期分布,下调bcl-2的表达,最终激活caspase-3,启动凋亡途径,诱导细胞凋亡。     

消岩汤通过HSPA5逆转肺腺癌耐药的研究

目的 分析肺腺癌耐药细胞株A549/DDP在中药复方消岩汤作用后细胞的差异蛋白并寻找相关耐药靶点。方法 通过Label-free蛋白组学筛选出两组关于耐药方面的差异蛋白,利用GO富集分析,PPI蛋白相互作用网络图的构建筛选核心蛋白,Western blot及qRT-PCR方法验证核心蛋白及基因的表达;利用CCK8法检测A549/DDP细胞增殖活力情况,利用流式细胞术检测A549/DDP细胞凋亡情况。在上调HSPA5蛋白表达的基础上,检测消岩汤对A549/DDP细胞增殖及凋亡的影响,以及A549/DDP细胞对顺铂耐药性的影响。结果 在中药复方消岩汤作用后的A549/DDP细胞蛋白质谱中找到29种耐药相关差异蛋白质,其中14种上调,15种下调。通过PPI蛋白网络互做分析得出核心蛋白,选择HSPA5进行体外实验验证,结果显示与对照组相比,中药复方消岩汤可以降低A549/DDP细胞中HSPA5蛋白及基因的表达,与蛋白组学结果一致。CCK8及细胞凋亡实验显示,消岩汤可以抑制细胞增殖,促进细胞凋亡,增强耐药细胞对顺铂的敏感性;上调HSPA5蛋白表达,消岩汤抑制细胞生长及增强细胞对顺铂敏感性的能力减...     

消岩汤对肺腺癌A549实体荷瘤小鼠肿瘤细胞凋亡干预机制的研究

目的分析消岩汤干预下Survivin siRNA对肺腺癌A549实体荷瘤小鼠肿瘤细胞凋亡的影响。方法以人肺腺癌A549实体移植瘤裸鼠模型为研究对象,将消岩汤含药血清及siRNA转染后的A549细胞分别进行瘤内注射,通过流式细胞术观察小鼠体内细胞凋亡情况;免疫细胞化学法检测Survivin蛋白表达。结果 siRNA转染组对Survivin蛋白表达的抑制率明显高于消岩汤组,但显著低于消岩汤+siRNA转染组。siRNA转染组和消岩汤组均可诱导细胞凋亡,且siRNA转染组的诱导作用强于消岩汤组,消岩汤+siRNA转染组可协同增强诱导细胞凋亡作用。结论消岩汤联合Survivin siRNA可协同增强诱导细胞凋亡作用。     

消岩汤含药血清介导下Survivin siRNA对人肺腺癌A549细胞增殖及凋亡的影响

[目的]分析消岩汤含药血清介导下Survivin siRNA对人肺腺癌A549细胞增殖及凋亡的影响,探究其抑瘤机制。[方法]在Invitrogen公司的网上设计系统中设计靶向Survivin基因的siRNA序列,并将其转染A549细胞,应用噻唑蓝(MTT)法检测消岩汤以及转染组对A549细胞生长抑制的情况,免疫组化法观察A549细胞Survivin蛋白的表达情况,流式细胞术检测各组细胞凋亡情况。[结果]MTT法显示消岩汤具有抑制A549细胞生长的作用,其作用具有一定的时间依赖性,转染中药组的抑制率显著高于转染对照组及非转染中药组。经免疫组化法检测,转染对照组对Survivin蛋白表达的抑制率明显高于非转染中药组,但显著低于转染中药组。流式细胞术检测结果显示消岩汤及重组质粒以诱导细胞晚期凋亡为主,转染中药组A549细胞凋亡率显著高于其他各组。[结论]消岩汤可诱导A549细胞的凋亡,联合应用转染靶向Survivin基因的重组质粒可增强其体外诱导A549细胞凋亡的作用。     

消岩汤逆转肺癌顺铂耐药的机制研究

目的探讨消岩汤逆转肺癌顺铂(DDP)耐药的可能机制。方法 MTT检测细胞增殖情况,划痕实验检测细胞侵袭能力;si RNA转染细胞获取稳定低表达基因的细胞株;实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和Werstern blotting检测m RNA和蛋白表达水平的变化。结果 MTT检测A549/DDP,在72、96 h,消岩汤能够明显抑制细胞增殖,而在48、72、96 h,DDP联合消岩汤能够明显抑制细胞增殖。划痕实验显示与A549/DDP/si RNA-NC比较,A549/DDP/siRNA-Beclin1细胞株迁移距离明显缩短。MTT显示与A549/DDP/si RNA-NC比较,A549/DDP/si RNA-Beclin1细胞株增殖能力减低,Westernblotting显示与A549/DDP/siRNA-NC比较,A549/DDP/siRNA-Beclin1细胞P-糖蛋白(P-gp)和肺耐药相关蛋白(LRP)蛋白表达降低,MTT检测A549/DDP/siRNA-Beclin1细胞,在72、96 h,DDP和消岩汤能明显抑制细胞增殖;而在24、48、72、96 h,DDP联合消岩汤明显抑制细胞增殖。结果显示DDP联合消岩汤使A549/DDP/siRNA-Beclin1细胞株中YES关联蛋白1(YAP1)、P-gp和LRP蛋白表达明显降低。结论消岩汤可能通过影响Beclin 1-YAP1分子通路进而改变肺癌细胞对DDP的敏感性。     

消岩汤对肺癌A549细胞及肺癌干细胞迁移及侵袭的影响

目的探讨消岩汤对非小细胞肺癌转移的作用机制。方法通过划痕实验,观察消岩汤对肺腺癌A549细胞的迁移能力的影响;通过侵袭实验,观察消岩汤对肺癌干细胞(SP细胞)侵袭能力的影响。结果划痕实验中消岩汤组肺腺癌A549细胞在24、48、72 h的迁移距离明显短于各时刻对照组细胞(P0.05);侵袭实验中消岩汤干预下的SP细胞穿出Transwell小室的细胞数明显少于对照组(P0.05)。结论消岩汤可有效抑制肺腺癌A549细胞的迁移及SP细胞的侵袭。     

消岩汤对耐顺铂人肺腺癌A549/DDP细胞多药耐药相关蛋白的调控作用

目的探讨消岩汤含药血清对耐顺铂人肺腺癌A545659/DDP细胞多药耐药相关蛋白1(MRP1)、肺耐药蛋白(LRP)及其m RNA表达水平的影响,发现消岩汤对化疗耐药的作用靶点,为肺癌化疗耐药的临床治疗提供理论基础。方法 A549裸鼠皮下移植瘤模型ip给予等量生理盐水,2 mg/kg顺铂,消岩汤低、高剂量(20、40 g/kg)获得含药血清,选择耐顺铂人肺腺癌A549/DDP细胞系作为获得性耐药模型,采用Western blotting免疫印迹法及RT-PCR技术,检测各组含药血清作用下A549/DDP细胞多药耐药基因MRP1、LRP及其产物MRP1、LRP蛋白的表达水平。结果与对照组相比,随着血清中药物浓度的增加,消岩汤低、高剂量组LRP与MRP1蛋白表达逐渐减弱(P0.05)。LRP及MRP1 m RNA水平也有所下降(P0.05),且随着药物浓度的增加,基因表达抑制越明显。结论不同浓度的消岩汤含药血清对MRP1、LRP及其m RNA表达均具有不同程度的抑制作用,且浓度越高,抑制作用越明显,即与剂量呈正相关,揭示消岩汤逆转肺癌耐药可能与抑制MRP1和LRP蛋白功能有关。     

消岩汤对A549/DDP细胞自噬及耐药蛋白的影响研究

[目的]通过消岩汤对耐顺铂人肺腺癌细胞A549/DDP多药耐药及自噬蛋白的影响,探究消岩汤对耐顺铂人肺腺癌A549/DDP的耐药逆转作用及探讨相关分子通路。[方法]建立稳定细胞耐药模型,连续灌胃不同浓度消岩汤10 d后,通过血清药理学的实验方法,提取药物血清,用含药血清作用于肺腺癌细胞耐药细胞A549/DDP,通过实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(QPT-PCR)和蛋白免疫印迹法(Werstern Blot)检测A549/DDP耐药、自噬相关基因的表达及相关通路蛋白的变化。[结果]高剂量消岩汤,低剂量消岩汤和生理盐水作用于肺腺癌耐药细胞A549/DDP,检测A549/DDP细胞中耐药相关蛋白P-糖蛋白(P-gp)、肺抗药性相关蛋白(LRP)及自噬相关蛋白Beclin1,HMGB1m RNA和蛋白表达变化,发现高剂量组消岩汤处理细胞株后P-gp、LRP及自噬相关蛋白Beclin1,HMGB1 m RNA和蛋白均发生降低(P0.05),进一步发现消岩汤可影响AKT1-m TOR相关基因,消岩汤明显降低AKT1,m TOR蛋白的表达。[结论]消岩汤通过影响AKT1-m TOR分子通路进而影响耐药相关蛋白P-gp、LRP及自噬相关蛋白Beclin1,HMGB1基因的变化。     

芪玉三龙汤药物血清对肺癌A549细胞增殖及凋亡的影响

目的观察芪玉三龙汤药物血清对人肺癌A549细胞增殖及凋亡的影响。方法制备芪玉三龙汤药物血清,体外培养A549细胞。将A549细胞分为正常血清组、5%药物血清组、10%药物血清组和20%药物血清组。CCK-8法和集落形成实验检测A549细胞增殖,TUNEL法检测细胞凋亡,Western blot检测凋亡相关蛋白Bax、cleaved Caspase-3、Bcl-2表达。结果与正常血清组比较,不同浓度芪玉三龙汤药物血清组A549细胞活力明显降低(P<0.001),细胞凋亡率明显升高(P<0.001),10%药物血清组和20%药物血清组A549细胞Bax、cleaved Caspase-3蛋白表达明显升高,Bcl-2蛋白表达明显降低(P<0.001)。结论芪玉三龙汤可能通过上调A549细胞Bax和cleaved Caspase-3蛋白表达,下调Bcl-2蛋白表达,进而诱导肿瘤细胞凋亡,抑制肿瘤细胞增殖。     

莪术醇对肺癌A549细胞凋亡诱导因子、 聚ADP核糖聚合酶及Caspase-3表达的影响

目的:观察莪术醇干预后,体外培养A549细胞凋亡诱导因子(apoptosis induce factor,AIF)和聚ADP核糖聚合酶[poly(ADP-ribose)polymerase,PARP]的表达情况,探讨莪术醇对非半胱天冬酶(caspase)依赖细胞凋亡的分子机制。方法:以不同质量浓度的莪术醇(12.5,25,50,100 mg.L-1)及阴性组处理肺癌细胞,药物作用48 h后提取各组蛋白;采用Westernblotting法分别检测各组AIF,PARP,caspase-3蛋白表达,并进行统计学分析。结果:经莪术醇处理后,阴性组的A549细胞的PARP相对蛋白表达量为0.545 3,AIF的相对蛋白表达量为0.358 6,而100 mg.L-1加药组的相对蛋白表达量分别为1.661 3和2.212 4,蛋白表达均随药物浓度的增加而增多,药物组与阴性组相比差异极显著(P<0.01),而caspase-3的前体(32×103)表达受药物影响较小,其激活体(17×103)基本不表达。结论:莪术醇可能主要是通过上调PARP蛋白的表达,进而将AIF转位到细胞核而引起凋亡的非依赖caspase途径来介导肺癌A549细胞的凋亡。