腺病毒介导的p27kip1基因转移对食管癌细胞周期的影响

用腺病毒为栽体，研究p27kip1基因转移对食管癌细胞周期的影响。方法将携带p27kip1基因的重组腺病毒转染食管癌细胞株Eea9706，用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法测定细胞生长抑制效应，免疫细胞化学法检测p27kip1表达，流式细胞仪(FcM)检测细胞周期。结果p27klp1基因转染食管癌细胞株Eca9706后，p27kip1表达增强，细胞生长显著受抑制，G0／G1期细胞比例增加，S期、G2／M期比例降低。结论腺病毒介导的p27kip1基因转移能显著抑制食管癌细胞的生长，使细胞产生G1期阻滞。     

宫颈癌p27kip1,p57kip2及CyclinD1的表达及其意义

目的:探讨宫颈癌中细胞周期蛋白依赖性激酶抑制蛋白(cyclin-dependent kinase inhibitor,CDKI)p27kip1和p57kip2及细胞周期蛋白D1(CyclinD1)的表达及其临床病理意义。方法:采用免疫组化S-P法检测p27kip1和p57kip2及CyclinD1在50例宫颈癌(宫颈癌组)、20例宫颈上皮内瘤变(CIN组)和15例正常宫颈组织(正常组)中的表达,并结合宫颈癌临床病理资料进行分析。结果:p27kip1在50例宫颈癌患者阳性表达12例,阳性率为24%。p27kip1蛋白阳性率随着宫颈癌恶性程度的增高而降低,在高分化、中分化、低分化的阳性率分别为66.7%,18.5%,7.1%,高分化组阳性率明显高于中分化和低分化的阳性率,差异有统计学意义(P<0.05)。p27kip1蛋白表达与临床分期、年龄、肿瘤生长类型、肿瘤直径和有无淋巴结转移无显著相关性,差异无统计学意义(P>0.05)。结论:p27kip1和p57kip2表达下降及CyclinD1增加可作为宫颈癌恶性程度的指标,可用于指导临床诊断及治疗。     

抑制mdr1基因对肝癌移植瘤放射疗效的影响

[目的]探讨用反义技术抑制mdr1基因对肝癌移植瘤放射疗效的影响。[方法]设立mdr1正义寡核苷酸组和脂质体组(仅加入等量的脂质体)作对照,用RT-PCR检测肝癌移植瘤组织处理前后mdr1表达水平的变化。测定各组肿瘤瘤重,计算抑瘤率。用免疫组织化学法测定Bcl-2和MGMT蛋白的表达。[结果]mdr1反义寡核苷酸能有效抑制mdr1基因的表达,经脂质体介导的mdr1反义寡核苷酸作用的肝癌移植瘤经射线照射后其抑瘤率较正义寡核苷酸组及单纯照射组明显增加,Bcl-2蛋白和MGMT蛋白的表达也显著下调,与对照各组比较有统计学差异(P﹤0.05)。[结论]mdr1反义寡核苷酸通过抑制mdr1基因降低肝癌移植瘤的放射抗性。其辐射增敏作用可能与mdr1反义寡核苷酸下调照射后肿瘤组织Bcl-2和MGMT蛋白表达有关。     

重组腺病毒介导人野生型p53基因转染神经母细胞瘤细胞系的实验研究

目的 观察人野生型p53基因(wt-p53)转染对神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞增殖、细胞周期及凋亡的影响.结果 以携带绿色荧光蛋白的腺病毒质粒(Ad-GFP)转染SH-SY5Y细胞,通过流式细胞仪(FCM)判断转染效率.确定合适的感染倍数(MOI).分别以空病毒质粒(Ad)及携带wt-p53的腺病毒质粒(Ad-p53)转染SH-SY5Y细胞,即对照组和p53组;并以未转染的肿瘤细胞为空白对照(空白组).采用Western blot免疫印迹法检测p53蛋白的表达.观察转染前后细胞生长情况,绘制生长曲线,通过FCM分析细胞周期分布及细胞凋亡情况.结果 检测结果 表明腺病毒对SH-SY5Y细胞有较高的转染率,100MOI为合适的转染倍数.Ad-p53转染SH-SY5Y细胞后,wt-p53基因得到了高效表达.与空白组和对照组相比,p53组细胞生长曲线上升减缓,生长速度减慢,细胞凋亡增加,G1期细胞比例增加(P<0.01).结论 wt-p53基因转染可以有效抑制SH-SY5Y细胞的生长,这为p53基因修饰的肿瘤疫苗用于神经母细胞瘤的临床治疗提供了体外实验依据.     

腺病毒介导的人CD40配体基因抑制裸鼠卵巢癌生长的实验研究

[目的]探讨重组腺病毒人CD40配体基因(Ad-hCD40L)对卵巢癌的治疗作用.[方法]建立卵巢癌裸鼠动物模型,检测腺病毒介导的人CD40配体基因对肿瘤生长的抑制作用.[结果]瘤内注射Ad-hCD40L明显抑制裸鼠卵巢癌生长,Tunel法检测和HE染色肿瘤组织石腊切片观察调亡细胞明显增多,并可见大量肿瘤细胞坏死.[结论]腺病毒介导的人CD40配体基因抑制裸鼠肿瘤生长,增强诱导肿瘤细胞调亡,为卵巢癌的基因治疗提供了新的途径.     

重组人p53腺病毒药物对人喉癌细胞的抑制实验

[目的]探索p53基因在喉癌基因治疗方面的可行性。[方法]以人喉癌细胞系Hep-2为实验对象,将重组人p53腺病毒药物(rAd/p53)转染Hep-2细胞,体外实验观察重组人p53腺病毒药物(rAd/p53)对Hep-2细胞生长的影响。[结果]各浓度重组人p53腺病毒药物(rAd/p53)(1010、109、108、107)对Hep-2生长均有抑制。尤以1010明显。转染3d后,重组人p53腺病毒药物(rAd/p53)诱导Hep-2细胞明显凋亡。[结论]重组人p53腺病毒药物(rAd/p53)对Hep-2细胞生长能有效抑制,能明显诱导其凋亡,为喉癌的治疗提供了临床前依据。     

腺病毒介导的P53基因抗人胃腺癌增殖的研究

目的：研究腺病毒介导的野生型P53基因（Ad-P53）抗人胃腺癌细胞增殖的效果。方法：利用携带P53基因的复制缺陷型腺病毒(Ad-P53)感染人胃腺癌细胞株SGC-7901，以携带报告基因LacZ的同型载体（Ad-LacZ）作对照，MTT法测定及克隆形成实验分析P53基因对胃腺癌细胞的体外抑瘤效应。用流式细胞技术分析P53基因转染后对细胞周期的影响以及引起凋亡情况，并用电镜观察细胞的超微结构变化。结果：野生型P53基因转移对SGC-7901具有明显的抗增殖作用。Ad-P53感染SGC-7901后细胞生长明显被抑制，抑制率达88.73％（MOI为200，7d）。克隆形成能力也明显受到抑制，当MOI分别为50，100，200时，克隆形成数为22，0，0。流式细胞计数分析显示Ad-P53能引起SGC-7901细胞发生周期阻滞和细胞凋亡，凋亡百分率达71.4％（MOI为200，7d）。电镜观察结果也显示细胞出现凋亡的特征性形态改变。结论：腺病毒成功介导野生型P53基因转移入人胃腺癌SGC-7901细胞中，野生型P53基因有显抑制胃腺癌细胞增殖的作用。其表达可以诱导肿瘤细胞的凋亡及细胞周期阻滞。     

腺病毒载体介导hTERT特异性RNAi诱导乳腺癌细胞凋亡的研究

[目的]构建hTERT特异性RNAi腺病毒载体,并研究该载体对乳腺癌MCF-7细胞增殖的影响,为针对端粒酶的乳腺癌基因治疗提供新的途径。[方法]设计针对人端粒酶逆转录酶催化亚基(hTERT)的干扰靶序列GGAACACCAAGAAGTTCATCT,构建RNAi腺病毒载体rAd-shRNA-hTERT。同时构建不针对任何基因的shRNA阴性对照rAd-shRNA-HK和只含EGFP的rAd-EGFP对照。转染人乳腺癌MCF-7细胞后48h,以荧光定量PCR和免疫印迹法检测MCF-7细胞hTERT基因的表达、流式细胞仪检测细胞凋亡情况。[结果]病毒载体经酶切、电泳分析表明插入序列正确,构建成功;转染MCF-7细胞后,rAd-shRNA-hTERT组可明显抑制hTERT基因表达,并抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡。[结论]通过腺病毒介导的RNAi技术可有效抑制MCF-7细胞中hTERT基因表达进而诱导肿瘤细胞凋亡,有望用于肿瘤的基因治疗。     

茶氨酸对人肺癌A549细胞株作用机制的研究

目的观察茶氨酸在体内外对肺癌A549细胞株生长的抑制、凋亡效应、抗肿瘤生成及抗血管生成作用。方法观察茶氨酸对肺癌A549细胞生长的影响,通过FCM检测茶氨酸对肺癌细胞凋亡的作用,以及茶氨酸在裸鼠移植瘤模型上对瘤体生长的抑制作用,免疫组化法检测肿瘤组织中CD34和血管内皮生长因子（VEGF）表达,观察茶氨酸对肺癌生长的抑制作用。结果茶氨酸显著抑制A549肺癌细胞生长,具有时间依赖性和浓度依赖性。茶氨酸使A549细胞出现明显凋亡,凋亡率17．8％。茶氨酸组治疗2周后,移植瘤瘤体体积变化和瘤体重量变化差异均有统计学意义,抑瘤率为47．2％。茶氨酸组瘤体组织中VEGF的表达与PBS组比较差异有统计学意义,瘤体组织中CD34标记的微血管密度（MVD）降低,因此,茶氨酸显著抑制肿瘤血管形成。结论茶氨酸通过促进肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤生长及抑制肿瘤血管生成的作用。     

多西紫杉醇和腺病毒介导NDRG2基因对人前列腺癌细胞株DU145的协同作用

目的 观察携带NDRG2基因的腺病毒(Ad-NDRG2)与多西紫杉醇(DT)联合给药对人前列腺癌细胞株DU145的抗肿瘤增效作用.方法 以Ad-NDRG2感染体外培养的DU145细胞,采用Western-blot方法检测CyclinD1、CyclinE、NDRG2蛋白表达水平的变化.流式细胞仪检测和MTT试验分析Ad-NDRG2给药后DU145细胞对DT敏感性的变化.建立裸鼠移植瘤模型,观察Ad-NDRG2与DT联合给药的体内抗肿瘤作用.结果 Ad-NDRG2感染后,DU145细胞中NDRG2表达明显增加,而CyclinD1和CyclinE表达水平降低.Ad-NDRG2协同10-7 mol/L以上浓度DT作用48h,可增强对DU145细胞的生长抑制作用(抑制率=41.8％,t=4.18,P＜0.01),增强诱导凋亡作用(凋亡率=32.4％,x2=11.66,P＜0.05),并且使DT所致的G2/M期细胞比例由50.2％变为23.6％,部分逆转了其G2/M期阻滞.动物实验表明:DT组、Ad-NDRG2组、Ad-NDRG2与DT联合给药组其移植瘤的抑瘤率分别为30.7％、28.2％和55.8％,两药相互作用指数(CDI)为0.89.结论 腺病毒介导NDRG2基因感染细胞后,增加了人前列腺癌DU145细胞在体内及体外对多西紫杉醇的敏感性.     

金雀异黄素对U251MG的抑制作用及对癌基因表达的影响

[目的]探讨金雀异黄素(Genistein)对胶质瘤细胞株U251MG增殖的影响及可能的作用机制。[方法]用MTT比色法观察不同浓度Genistein在不同作用时间下对U251MG细胞增殖的影响,并通过流式细胞仪和免疫细胞化学染色检测p53(突变型)、c-erbB1、c-myc、cyclinD1蛋白表达。[结果]当Genistein在达到一定浓度或(和)一定时间后,对U251MG细胞增殖均有不同程度的抑制作用,且呈时间剂量依赖性。U251MG细胞经Genistein作用48h后,p53(突变型)、c-myc基因蛋白表达均较对照组明显下降(F=25.766,P﹤0.01;F=22.974,P﹤0.01),且呈剂量依赖性,而c-erbB1、cyclinD1基因蛋白表达无明显变化(F=0.984,P﹥0.05;F=2.416,P﹥0.05)。[结论]Genistein对U251MG细胞的增殖有明显的抑制作用,其抗肿瘤的机制可能与p53(突变型)和c-myc蛋白表达降低有关。     

腺病毒介导的人突变p27基因转染对人大肠癌细胞系的作用

目的　用人重组p2 7mt腺病毒感染大肠癌细胞株SW 480 ,研究p2 7mt对大肠癌细胞的抑制作用。方法　用重组腺病毒Ad -p2 7mt转染SW 480后 ,用Westernblot检测目的基因的表达 ;用流式细胞仪对转染细胞进行倍体分析 ,绘制生长曲线观察对细胞的生长抑制作用。结果　Ad -p2 7mt转染SW 480后 ,通过Westernblot分析发现p2 7在细胞中出现了高表达 ;PI染色流式细胞仪检测 ,77 9%的细胞阻滞于G0 /G1 期 ,而Ad -LacZ组及空白对照组分别为 2 5 5 7%和 2 5 2 9%(P <0 0 0 1) ;由生长曲线可以看出Ad -p2 7mt于 2 4h内对细胞就有明显的抑制作用 ( P<0 0 5 ) ,且持续时间长。结论　重组腺病毒能够有效转染p2 7mt基因进入SW480细胞内并获得了高表达 ;p2 7mt对细胞周期有明显的阻滞作用且对细胞的生长有明显的抑制作用。突变p2 7是一种细胞周期高效阻滞因子和高效生长抑制因子 ,为p2 7基因治疗大肠癌开辟了一条新途径     

p27kip1蛋白在宫颈癌及癌前病变中的表达及临床意义

目的:探讨宫颈癌及癌前病变组织中p27kip1蛋白的表达情况及临床意义。方法:采用免疫组化S-P法检测32例宫颈正常鳞状上皮、70例宫颈上皮内瘤样病变(CINⅠ22,CINⅡ24,CINⅢ24)、47例宫颈浸润癌中p27kip1蛋白的表达,分析宫颈癌形成过程中p27kip1蛋白表达的变化以及p27kip1蛋白表达与宫颈癌临床病理特征的关系。结果:p27kip1蛋白在CINIII及宫颈浸润鳞癌中表达平均阳性细胞百分率分别为37.1%,14.3%,显著低于宫颈正常鳞状上皮和CINⅠ、Ⅱ(分别为58.0%,65.9%,62.1%),有统计学意义(P<0.0001)。p27kip1蛋白在不同组织类型、分化程度、临床期别、有无淋巴转移的宫颈浸润癌中的表达无统计学差异。结论:p27kip1蛋白表达下降可能在宫颈细胞的恶性转化过程中起重要作用,为宫颈癌变的早期信号。     

P53、CyclinD1蛋白在胃癌中的表达与淋巴结转移关系

目的探讨P 53、CyclinD1在胃癌中表达与淋巴结转移的关系.方法应用免疫组化S-P法,对230例胃癌标本进行检测.结果 P 53、CyclinD1在胃癌中阳性表达率分别为36.52%(84/230)、61.74(142/230),P 53、CyclinD1的阳性表达与胃癌的淋巴结转移密切相关(P＜0.01).结论 P 53、CyclinD1蛋白在胃癌发生过程中可能起重要作用,可作为监测预后的有效指标.     

P53、P21^WAF/CIP1和Cyclin D1基因蛋白在沥青烟暴露小鼠肺组织中的表达

[目的]探讨沥青烟对小鼠肺组织形态及基因蛋白P53、P21^WAF/CIP1和Cyclin D1表达的影响。[方法]建立沥青烟亚急性染毒小鼠模型，将120只昆明种健康小鼠随机分为3组，即1个对照组和2个染毒组，染毒组进行不同浓度（55、165mg,／m^3）和不同时间（30、60d）染毒，光镜下观察肺组织形态改变，采用免疫组化S-P法，对P53、P21、Cyclin D1染色，观察P53、P21和Cyclin D1基因蛋白表达。[结果]不同浓度、不同时间染毒小鼠肺组织形态有不同程度改变，高浓度染毒组出现不典型增生。小鼠肺组织P53基因蛋白表现为低浓度染毒30d组，未见阳性表达；高浓度染毒60d组呈强阳性表达（P〈0．01）。P21^WAF/CIP1基因蛋白表达低浓度染毒30d呈阳性表达；高浓度染毒60d组表达明显下调（P〈0．01）。Cyclin D1基因蛋白表达同P53基因蛋白表达。[结论]随着染毒浓度和染毒时间的增加，肺组织增生逐渐明显，P53和Cyclin D1基因蛋白的表达呈上升趋势，P21^WAF/CIP1呈下降趋势。     

前列腺素E1对大鼠急性心肌梗死血管内皮生长因子表达的影响

[目的]探讨前列腺素E1(PGE1)对急性心肌梗死(AMI)大鼠心肌血管内皮生长因子(VEGF)表达的影响。[方法]健康雄性SD大鼠50只分为PGE1处理组(n=40)、生理盐水对照组(n=10)和假手术组(n=10),PGE1处理组分为4个亚组,每组10只,分别采用不同剂量PGE1每日静脉注射,手术后2周和4周处死大鼠,取心脏标本切片,HE染色及VEGF免疫组化染色后显微镜观察,分析心肌VEGF蛋白表达水平。[结果]PGE1处理组VEGF蛋白的表达显著增加,明显高于对照组和假手术组,差异有统计学意义(P﹤0.05)。随着PGE1剂量的增加,VEGF蛋白表达水平逐渐升高。[结论]PGE1可以增加AMI大鼠心肌VEGF蛋白表达,促进侧支循环建立。PGE1引起的心肌VEGF蛋白表达升高作用呈剂量依赖性。     

Combination of radiotherapy and adenovirus-mediated p53 gene therapy for MDM2-overexpressing hepatocellular carcinoma

The p53 gene plays a determinant role in radiation-induced cell death and its protein product is negatively regulated by MDM2. We investigated whether adenovirus-mediated modified p53 gene transfer, which blocks p53-MDM2 binding, is effective for radiation-induced cell death in hepatocellular carcinoma (HCC) at different MDM2 cellular levels. Human hepatocellular carcinoma cell lines expressing MDM2 at low levels (Huh7) and high levels (SK-Hep1) were used. Ad-p53 and Ad-p53vp are replication-deficient adenoviral vectors containing human wild-type or modified p53, respectively. The anti-tumor effect was highest for Ad-p53 + radiotherapy (RT) in the low-level MDM2 cells, whereas this effect was highest for Ad-p53vp + RT in the MDM2-overexpressing cells. In Huh-7 cells, Ad-p53 + RT decreased cell viability (32%) in vitro and inhibited tumor growth (enhancement factor, 1.86) in vivo. Additionally, p21 expression and apoptosis were increased. In contrast, in SK-Hep1 cells, Ad-p53vp + RT showed decreased cell viability (51%) in vitro and inhibition of tumor growth (enhancement factor, 3.07) in vivo. Caspase-3 expression and apoptosis were also increased. Adenovirus-expressing modified p53, which blocks p53-MDM2 binding, was effective in killing tumor cells overexpressing MDM2. Furthermore, the combination strategy for disruption of the p53-MDM2 interaction with RT demonstrated enhanced anti-tumor effects both in vitro and in vivo.     

CFSE活性染剂检测放化疗联合治疗对胶质瘤复发影响的研究

[目的]探索利用顺铂联合放疗对胶质瘤治疗复发率的影响。[方法]将C6细胞分为空白对照组、单纯放疗组、单纯化疗组和放疗加化疗组,激光共聚焦观察细胞形态,用流式细胞仪测定CFSE的荧光信号。[结果]放疗加化疗组细胞的增殖能力较单纯放疗及单纯化疗组明显下降。[结论]放疗加化疗联合不仅减少了化疗药物和射线的用量,也大大降低了治疗后的肿瘤细胞增殖能力,为指导临床胶质瘤的后续治疗提供依据。