云南墨兰炭疽病的病原菌鉴定、致病性及生物学特性研究

【目的】确定云南屏边墨兰炭疽病的病原菌及其分类学地位、致病谱、生物学特性,为野生墨兰的保护提供理论依据。【方法】采用组织分离法、刺伤接种、形态学结合分子生物学确定墨兰炭疽病的病原菌分类学地位、致病谱,采用生长速率法、血球计数板法测试碳氮源、温度、pH值、光照等对因素对病原菌菌丝生长、产孢的影响。【结果】本试验分离鉴定了云南屏边的2株墨兰炭疽病分离物,经形态学特征、回接发病特征及基于ITS rDNA的系统发育分析鉴定为胶孢炭疽菌。该菌还能侵染兜兰、建兰、红柱兰,菌丝生长最佳碳氮源为甘露醇、甘氨酸,最适温度为30℃,致死温度为55℃,最适pH值为8,最适光照为暗培养;产孢最适碳氮源分别为麦芽糖、蛋白胨,最适温度35℃,致死温度60℃,最适pH值为7,光照对产孢影响不显著。【结论】云南屏边野生墨兰炭疽病的病原菌为胶孢炭疽菌,对兜兰、建兰、红柱兰致病,病原菌的环境适应性强,屏边大围山自然保护区应禁止栽培兜兰、建兰、红柱兰。     

蓝莓炭疽病病原菌鉴定及致病性测定

【目的】鉴定辽宁省部分地区疑似炭疽病的蓝莓病株的病原,为蓝莓病害的防控及抗病育种提供依据。【方法】对采自辽宁省兴城市和庄河市的疑似炭疽病的蓝莓发病枝条及叶片进行组织分离、培养,从所分离获得的两类菌株中选择形态学不同的代表菌株LNSW1和B-Cg1进行后续试验和分析。观察两个代表分离菌株在马铃薯葡萄糖琼脂培养基（potato dextrose agar,PDA）上的菌落及分生孢子的形态特征。对代表菌株LNSW1和B-Cg1的真菌核糖体基因进行PCR扩增和测序,采用Mega5.1软件中邻位加入法（neighbor-joining,NJ）进行基于病原菌rDNA-ITS基因序列和GenBank中已有相关炭疽菌序列的系统发育树构建。利用尖孢炭疽菌（Colletotrichum acutatum）和胶孢炭疽菌（C. gloeosporioides）的特异性引物对CgInt2/ITS4和CgInt/ITS4对代表菌株进行特异性扩增,采用菌丝块叶片接种法对8个蓝莓品种进行代表分离菌株的致病性测定。【结果】从辽宁省部分蓝莓产区罹病植株上共分离纯化得到36个菌株,根据各菌株的形态学差异将其分成两个类别,两类别中代表菌株LNSW1和B-Cg1在菌落颜色及分生孢子形态上具有较大差异,且与已报道的炭疽菌属当中的尖孢炭疽菌和胶孢炭疽菌形态特征相似;两个代表分离株的rDNA-ITS序列实际长度为557和547 bp,通过基于真菌核糖体基因的系统发育分析,表明菌株LNSW1与GenBank中尖孢炭疽菌菌株AB729126、KF698729、EU886755聚在同一分支,B-Cg1与胶孢炭疽菌菌株JF923828、KF516931、GU174547聚在同一分支,相似度分别为99%-100%;两对炭疽菌特异性引物扩增结果再次证明所获代表菌株分别为尖孢炭疽菌和胶孢炭疽菌; 致病性测定结果表明,尖孢炭疽菌和胶孢炭疽菌菌丝块接种8个蓝莓品种的叶片及枝条均可致病,两类病菌回接症状与田间自然发病症状较为相似,尖孢炭疽菌对蓝莓的致病稍强于胶孢炭疽菌。【结论】通过对辽宁省蓝莓主产区的蓝莓发病枝条及叶片的病原菌进行形态学和分子学鉴定,基本明确辽宁省部分地区的蓝莓炭疽病是由尖孢炭疽菌和胶孢炭疽菌侵染所致。     

广西降香黄檀炭疽病菌的生物学特性分析

【目的】分析降香黄檀炭疽病蜘蛛兰炭疽菌(Colletotrichum hymenocallidis)的生物学特性,为降香黄檀炭疽病的监测及防治提供理论依据。【方法】在PDA培养基上观测5～40℃范围内不同梯度温度下蜘蛛兰炭疽菌的菌丝生长、产孢量及孢子萌发情况;用小容器空气湿度调节法测定在50%～100%范围内不同湿度下蜘蛛兰炭疽菌的分生孢子萌发情况;用液体培养法测定pH 2～12范围内不同pH培养液处理蜘蛛兰炭疽菌的菌丝生长情况;以Czapek培养基为基础,分别以等质量碳、氮源替代蔗糖和硝酸钠,测定不同碳、氮源处理蜘蛛兰炭疽菌的菌丝生长及产孢情况;在PDA培养基上测定不同光照下蜘蛛兰炭疽菌的菌丝生长及产孢情况。【结果】蜘蛛兰炭疽菌在不同温度条件下生长情况存在差异,温度过高或过低均不利于其菌丝生长、产孢和孢子萌发,在28℃时各项生物学指标达最高值,菌落直径、产孢量及孢子萌发率分别为69.88 mm、3.33×10~6个/mL和94.00%;该菌在水滴中的萌发率最高,为93.00%;菌丝在pH 3～12范围内均能生长,最适生长pH为5;该菌可利用多种碳和氮源,其中对D-果糖、蔗糖、D-木糖、甘露醇、D-山梨醇和可溶性淀粉的利用效果较佳,产孢量差异不显著(P0.05);最适菌丝生长氮源为酵母粉,最适产孢氮源为牛肉膏;光照能加速菌丝生长和促进产孢。【结论】降香黄檀蜘蛛兰炭疽菌菌丝生长和产孢受温度、pH、碳氮源和光照影响明显,适宜的高温和高湿有利于其病原菌分生孢子萌发,生产上可根据该菌的生物学特性进行有效防控。     

玉米弯孢菌叶斑病田间发生动态研究

【目的】对玉米弯孢菌叶斑病田间发生动态进行研究,为生产上防治该病提供一定的理论依据。【方法】采用田间调查和人工接种的方法,调查玉米弯孢菌叶斑病在田间的病株发病率、病叶发病率和病情指数的变化规律,研究该病在田间的发病规律;通过测定不同生育期玉米叶片上病斑的产孢量和病斑面积,研究玉米不同生育期的抗病性。【结果】在四川雅安生态条件下,玉米弯孢菌叶斑病的始发期为5月中旬,从5月下旬至7月中旬病情指数迅速增长;玉米孕穗期叶片病斑面积和产孢量最大,大喇叭口期次之,苗期最小;玉米下部叶片上病斑的产孢量和病斑面积大于上部叶片病斑的产孢量和病斑面积。【结论】在四川雅安生态条件下,玉米弯孢菌叶斑病的始发期为5月中旬;玉米苗期最抗病,孕穗期最感病;下部叶片较感病,上部叶片较抗病。     

玉米弯孢菌叶斑病田间发生动态研究

【目的】对玉米弯孢菌叶斑病田间发生动态进行研究,为生产上防治该病提供一定的理论依据。【方法】采用田间调查和人工接种的方法,调查玉米弯孢菌叶斑病在田间的病株发病率、病叶发病率和病情指数的变化规律,研究该病在田间的发病规律;通过测定不同生育期玉米叶片上病斑的产孢量和病斑面积,研究玉米不同生育期的抗病性。【结果】在四川雅安生态条件下,玉米弯孢菌叶斑病的始发期为5月中旬,从5月下旬至7月中旬病情指数迅速增长;玉米孕穗期叶片病斑面积和产孢量最大,大喇叭口期次之,苗期最小;玉米下部叶片上病斑的产孢量和病斑面积大于上部叶片病斑的产孢量和病斑面积。【结论】在四川雅安生态条件下,玉米弯孢菌叶斑病的始发期为5月中旬;玉米苗期最抗病,孕穗期最感病;下部叶片较感病,上部叶片较抗病。     

草莓上胶孢炭疽菌的分离与鉴定

从田间感染炭疽病的草莓组织获得分离物,对其进行培养与纯化,并进行形态学观察,初步鉴定为胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides(Penz.) Sacc.),同时利用通用引物ITS1和ITS4对该病原菌rDNA的ITS序列进行PCR扩增,经聚类分析,鉴定结果与形态学鉴定一致,即分离的病原菌为胶孢炭疽菌.采用人工喷雾接种法将胶孢炭疽菌接种到‘章姬’和‘阿尔比’2个栽培草莓品种以及野生黄毛草莓上,3个检测对象对该致病菌株的抵抗力存在一定的差异:‘章姬’为高度感病,‘阿尔比’为感病,黄毛草莓为中等抗病.     

胶孢炭疽菌对核桃叶生理生化特性的影响

以离体的泡核桃(Juglans sigillata Dode)叶为材料,研究了胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)对核桃(Juglans regia L.)叶生理生化指标的影响。结果表明,接种胶孢炭疽菌感病后核桃叶片内超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)活性均随着感病时间的延长呈先升高后降低的趋势,过氧化物酶(POD)活性则随着感病时间的延长呈先下降后升高的趋势,核桃叶发病第三天和第五天的SOD、POD和CAT活性均显著高于对照;丙二醛(MDA)、可溶性蛋白质和可溶性糖含量均随着核桃叶感病时间的延长呈现出升高的趋势,其中,MDA含量在感病的第三天和第五天均显著高于对照,而可溶性蛋白质和可溶性糖含量与对照差异不显著;叶绿素含量随着核桃叶感病时间的延长而下降,在感病第五天叶绿素含量显著低于对照;感病核桃叶的净光合速率显著低于对照,气孔导度、胞间CO2浓度和蒸腾速率则与对照差异不显著。可见,胶孢炭疽菌感染对泡核桃叶片的生理生化特性有显著影响。     

陕、豫两省苹果炭疽病病原鉴定

 【目的】确定引起中国陕、豫两省苹果炭疽病的病原菌种类。【方法】对病原菌进行分离、纯化、致病性测定以及形态学鉴定、rDNA ITS区序列分析、rDNA ITS区特异引物CaInt2/ITS4扩增。【结果】自陕西、河南11个地点采集192份样本,经鉴定引起陕、豫两省苹果炭疽病的病原菌有2种,胶孢炭疽菌[Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Sacc.]和尖孢炭疽菌(C. acutatum J.H. Simmonds)。两种病原菌的区别主要在于分生孢子形态、菌落颜色、对引物CaInt2的特异性等。【结论】首次证实了中国苹果炭疽病可由尖孢炭疽菌(C. acutatum)引起。两种病原菌在陕、豫两省各地区均有分布,其中,胶孢炭疽菌(C. gloeosporioides)所占比例较高。     

广东地区墨兰和大花蕙兰炭疽病菌的鉴定

对广东省部分地区栽培墨兰(Cymbidium sinense (Jackson ex Andr.)Willd.)和大花蕙兰(C.hybridum L.)上普遍发生的炭疽菌(Colletotrichum)病害进行了鉴定.经病原菌分离培养、致病性测定及病原菌形态观察和内部转录间隔区(Internal transcribed space,ITS)、β-微管蛋白(β-tubulin)序列分析,结果表明,墨兰炭疽病由博宁炭疽菌(Colletotrichum boninese J.Moriwaki,Toy Sato&T.Tsukiboshi)、胶孢炭疽菌(C.gloeosporioides Penz.)引起,而大花蕙兰炭疽病仅由胶孢炭疽菌(C.gloeosporioides Penz.)引起.     

鄂北岗地山药病害病原菌鉴定

【目的】开展鄂北岗地山药病害病原菌的鉴定,探索引起病害的病原菌及其分类地位,为进一步研究其发生规律及制定切实有效的防治措施提供依据。【方法】采集鄂北岗地山药地上组织病害样本,利用植物病理学组织分离法和ITS-PCR技术,通过病原物培养形态、显微观察、ITS鉴定比对和致病性测定验证,进行山药病害病原菌的分离和鉴定。【结果】鄂北岗地山药病害的病原真菌系链格孢属互隔交链孢霉(Alternaria alternata),刺盘孢属果生炭疽菌(Colletotrichum fructicola)和胶孢炭疽菌(Colletotrichumn gloeosporiaides),毛色二孢属假可可毛色二孢(Lasiodiplodia pseudotheobromae)。【结论】以上结果揭示鄂北岗地山药有多病害发生,病原菌组成复杂。山药炭疽病及其他病害均可导致山药地上组织枯萎甚至死亡。     

美洲棘蓟马体内共生菌Wolbachia的wsp基因分子检测及系统发育分析

【目的】对美洲棘蓟马体内共生菌Wolbachia进行分子生物学鉴定,确定该蓟马体内Wolbachia的进化位置,为进一步探讨Wolbachia对其生殖作用的调控机制提供理论依据。【方法】以wsp基因为目的基因,对美洲棘蓟马体内的共生菌Wolbachia进行特异性扩增和测序,使用Clustal X 1.83软件对所得DNA序列进行比对;在MEGA 4.0软件中采用邻接法对Wolbachia的系统发育关系进行分析。【结果】利用wsp基因的特异性引物从美洲棘蓟马体内扩增出了632 bp的Wolbachia的wsp基因片段(GenBank登录号为JN315668),580 bp的Wolbachia A群的wsp基因片段和405 bp的Mel亚群的wsp基因片段。系统发育分析结果表明,美洲棘蓟马体内的Wolbachia与黑腹果蝇亲缘关系较近。【结论】美洲棘蓟马体内感染的Wolbachia属于A群Mel亚群。     

日本白鲫BMP15和GDF9基因片段的克隆及组织表达分析

根据斑马鱼GDF9、BMP15基因的保守序列设计引物,采用RT PCR方法扩增获得日本白鲫GDF9、BMP15基因片段。日本白鲫GDF9基因片段长778 bp,编码145个氨基酸;BMP15基因片段长811 bp,编码270个氨基酸。氨基酸序列分析表明日本白鲫GDF9与斑马鱼的同源性最高,为78%,与其他物种的同源性在58%~78%之间;日本白鲫BMP15与斑马鱼同源性最高,为80%,与其他物种的同源性在30%~80%之间。系统进化树分析显示,鱼类的GDF9基因独立聚成一支,其中日本白鲫的GDF9基因与斑马鱼的GDF9基因聚成一支;鱼类的BMP15基因独立聚成一支,其中日本白鲫的BMP15基因与斑马鱼的BMP15基因聚成一支。半定量PCR结果显示,BMP15 mRNA在脾脏、肝脏、鳃、脑、心脏、肌肉、肾脏、卵巢中均有表达,其中卵巢中表达量最高;GDF9 mRNA在肝脏、脑、心脏、肌肉、卵巢中均有表达,而在脾脏、鳃、肾脏中表达量极低或不表达,在卵巢中表达量最高,为进一步研究日本白鲫GDF9与BMP15基因的结构与功能奠定了基础。     

沙门菌、巴氏杆菌和大肠埃希菌多重PCR检测方法的建立

旨在建立一种可以应用于临床样本同时检测沙门菌、多杀性巴氏杆菌和大肠埃希菌感染的多重PCR方法。根据NCBI上已收录的沙门菌hut基因、多杀性巴氏杆菌 kmt1基因和大肠埃希菌23SrRNA基因的全基因序列,设计并合成3对特异性引物,通过优化多重PCR反应条件,建立能够同时检测3种细菌混合感染的多重PCR诊断方法。特异性分析表明,应用该方法可以从沙门菌、多杀性巴氏杆菌和大肠埃希菌以及3种细菌的混合物中扩增出3条大小分别为286 bp、457 bp和652 bp的特异性条带,其他对照组检测结果均为阴性;敏感性分析表明,该方法对沙门菌、多杀性巴氏杆菌和大肠埃希菌的最低检出量分别为1.77×10　、1.99×10　、2.01×10　 CFU/mL;人工模拟感染样本检测表明,该方法能从混合感染的病料中检测出3种病原菌。可见：所建立的多重PCR方法具有特异性强,敏感度高,稳定性好的特点,可以有效检测沙门菌、多杀性巴氏杆菌和大肠埃希菌的混合感染。     

禽多杀性巴氏杆菌、副鸡嗜血杆菌和大肠杆菌多重PCR检测方法的建立及应用

为了建立鉴别禽多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida)、副鸡嗜血杆菌(Haemophilus paragallinarum)和大肠杆菌(Escherichia coli)的多重PCR检测方法,参照GenBank中登录的3种细菌基因组序列,合成3对特异性引物,通过优化多重PCR反应条件,建立快速检测3种细菌的多重PCR方法。特异性试验结果表明,可分别扩增出3种细菌对应的目的片段,对Ⅰ群禽腺病毒4型(FAV-4)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、沙门氏菌(Salmonellaspp)、鸡胚成纤维细胞(DF-1)的DNA和灭菌双蒸水均无扩增;敏感性试验结果表明,最低检测量分别为24.3pg/μL禽多杀性巴氏杆菌、21.4pg/μL副鸡嗜血杆菌和28.6pg/μL鸡大肠杆菌的基因组DNA;应用该方法对83份临床病料进行检测,结果与其他已建立的单重PCR检测一致,说明所建立的方法可用于临床上3种细菌的鉴别诊断。     

油菜菌核病菌激发子基因SsXYN克隆及表达载体构建

以核盘菌菌株NGA₄提取的总RNA为模版,利用RT-PCR技术扩增获得SsXYN基因的全长cDNA片段,将其克隆到pMD19-T载体上,菌落PCR、酶切鉴定和cDNA测序结果表明成功克隆了核盘菌SsXYN基因。从pMD19-T : SsXYN载体上,用BamH I和Sal I 双酶切切下目的基因片段,将该基因片段连接到原核表达载体pET32a中。菌落PCR和酶切鉴定结果显示成功构建了表达载体pET32a : SsXYN。利用热击法将该重组表达载体导入大肠杆菌BL21,获得携带SsXYN基因的大肠杆菌菌株,为进一步研究激发子诱发植物抗病性机理奠定了基础。     

猪种、牛种、羊种、绵羊种布鲁菌多重PCR检测方法的建立及应用

为建立在临床样本能够同时检测猪种、牛种、羊种、绵羊种布鲁菌的多重PCR方法,根据NCBI已收录的布鲁菌全基因,设计并合成4对特异性引物,通过优化多重PCR的反应条件,建立能够同时检测4种布鲁菌的多重PCR诊断方法。特异性试验结果表明,可以从4种布鲁菌以及4种细菌混合物中扩增出大小分别为276、494、733和976bp的特异性条带,对照组的检测结果为阴性;敏感性试验结果表明,对4种病原菌基因组DNA的检出量为猪种32.2pg、牛种21.3pg、羊种27.5pg、绵羊种43.2pg;人工模拟感染样本检测结果表明,能从混合感染的病料中特异地检测出4种病原菌。应用该方法对200份临床奶山羊乳样进行检测,结果检出4份阳性。建立的多重PCR方法具有特异性强、敏感度高、稳定性好的特点,可以有效地检测4种布鲁菌的感染。     

火龙果HpGST基因克隆及表达分析

为探究火龙果（Hylocereus）谷胱甘肽S-转移酶基因（HpGST）的功能,克隆了HpGST基因的cDNA序列,并进行生物信息学及表达分析。结果显示：HpGST序列全长为666 bp,编码221个氨基酸,编码蛋白属于非分泌型不稳定亲水性蛋白,亚细胞定位预测其于细胞质中发挥作用;系统进化树显示其与藜麦亲缘关系较近,属谷胱甘肽转移酶Tau家族;实时荧光定量PCR分析结果显示,HpGST在火龙果不同色泽类型品种果肉中均有表达,在有色素累积的紫肉和粉肉类型中表达量均显著高于无色素累积的白肉类型,表达趋势均为先上升后下降,其表达量与甜菜素含量呈现正相关,且在不同色泽类型品种中表达趋势与甜菜素累积趋势高度一致,推测HpGST基因在火龙果甜菜素合成与分布中发挥重要作用。     

Pina新等位变异Pina-D1o的分离及分析

Puroindoline基因(Pina和Pinb)是控制小麦籽粒硬度的主效基因,决定小麦加工品质,分离该基因的新等位变异有利于小麦籽粒硬度性状的改良。采用同源克隆方法从节节麦(Aegilops tauschii,DD PI603224)中分离到一个Pina新等位变异Pina-D1o。生物信息学分析表明,该基因编码区全长447bp,编码148个氨基酸残基,具有小麦族作物PinA蛋白所特有的WRWWKWWK色氨酸结构域和10个半胱氨酸所形成的5个二硫键结构。根据核苷酸序列构建的拓扑树,Pina-D1o与Pina-D1m、Pina-D1n相同,均由功能性等位变异Pina-D1a发生单基因突变而来,因而Pina-D1o有可能来源于Pina-D1a。可见,新等位变异类型PinaD1o的发现可以为小麦的籽粒硬度改良提供基因资源。     

犬蠕形螨混合金黄色葡萄球菌和大肠杆菌感染的病原鉴定与诊治

为了对1例皮肤病患犬进行诊断和有效治疗。结合患犬临床症状，采用寄生虫学、血液学和微生物学等方法进行诊断检查，并进行对因和对症治疗。结果显示，经皮肤刮片和皮肤细胞学镜检，观察到犬蠕形螨；血常规和生化指标检查显示白细胞数和中性粒细胞数显著升高、总蛋白含量升高，表明患犬有严重慢性感染和炎症；细菌分离培养获得1株呈金黄色菌落的革兰氏阳性菌和1株呈乳白色菌落的革兰氏阴性菌，利用VITEK 2 Compact全自动微生物分析仪鉴定为金黄色葡萄球菌和大肠杆菌；药敏试验结果显示2种细菌均对丁胺卡那霉素敏感，而对其他8种药物存在耐药差异；经选用多拉菌素抗犬蠕形螨治疗、丁胺卡那霉素抗菌治疗，结合对症治疗和提高犬体免疫力等综合治疗方法，连续治疗4周后，患犬病症消失，生理生化指标恢复正常，治疗效果明显。本治疗方法可为犬蠕形螨混合细菌感染的诊治提供参考。     

二穗短柄草DREB1G基因表达模式分析和在拟南芥中的异源过量表达

CBF/DREB基因是一类植物特异性转录因子,通过调控下游抗逆相关基因的表达,在植物逆境胁迫应答过程中发挥重要作用。为了研究新型的禾本科模式植物二穗短柄草DREB基因的功能,克隆BdDREB1G的cDNA序列,分析该基因在各种非生物胁迫条件下的表达,构建过表达载体,获得转基因拟南芥。结果表明:高温、低温和水杨酸胁迫处理显著诱导BdDREB1G的表达,暗示该基因响应高温和低温胁迫。初步观察结果说明,该与野生型拟南芥相比,转基因植株生长发育迟缓。这些为研究该基因响应非生物胁迫的功能奠定基础。