2,3,7,8-TCDD对培养乳鼠心肌细胞内游离钙离子浓度影响的研究

目的 测定培养SD大鼠乳鼠心肌细胞内游离钙离子浓度[Ca^2＋]i,观察2,3,7,8-四氯二苯并二噁英（2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin,以下略为TCDD）对心肌细胞[Ca^2＋]i的影响。方法将实验动物分为0．05、0．5、5、10μg／kg4个染毒组,采用Fluo-3／AM同时加入Pluronic F-127作为细胞内游离钙离子的荧光探针,负载培养的心肌细胞,应用共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）技术检测空白组及染毒组乳鼠心肌细胞[Ca^2＋]i。结果静息时,心肌细胞[Ca^2＋]i为（77．68-4-12．00）nmol／L。染毒组心肌细胞的[Ca^2＋]i显示不同程度的升高,且呈剂量依赖性。结论应用Fluo-3／AM和Pluronic F-127结合CLSM技术可以精确的反映细胞内游离钙离子浓度,TCDD可能通过某种机制增加心肌细胞[Ca^2＋]i从而对乳鼠心脏功能产生一定损伤。     

共聚焦显微镜观测阿霉素致心肌细胞钙超载及脂联素的保护研究

目的探讨阿霉素（ADR．）对心肌细胞损伤中钙超载的扩制及脂联素的保护作用。方法采用胰蛋白酶消化法原代培养乳鼠心室肌细胞。选用培养72h的单层心肌细胞,实验分为正常对照组、单纯U）R组、ADR＋APN（3μg／ml）组、ADR＋APN（10μg／ml）组、ADR＋APN（20μg／ml）组、ADR＋APN（30μg／ml）组。实验终止后,在倒置相差显微镜下观察心肌细胞形态的变化,测定乳酸脱氢酶（LDH）的释放及肌酸激酶（CK）的活性,通过流式细胞术来检测心肌细胞的凋亡,激光共聚焦检测细胞内钙离子荧光强度。结果与对照组相比．给予ADR后,细胞凋亡率显著增加（7020±3．73 vs 4．73±1．21,P〈0．05）,乳酸脱氢酶（LDH）的活性7LCK的活性增加（P〈0．05）,钙离子荧光强度明显增加（605．99±45．62 vs 137．17±37．7,P〈0．05）,APN预处理后给予ADR．,可较大程度地逆转上述指标变化,与ADR组相比均具有显著性差异（p〈0．05）,并且呈现一定的浓度依赖性。结论脂联素对阿霉素中毒心肌细胞具有保护作用,其机制可能与保护心肌细胞内质网有关。     

糖基化终极产物对乳鼠心肌细胞胞内游离钙瞬间变化的影响

目的探讨糖基化终极产物(AGEs)刺激对体外培养乳鼠心肌细胞内游离钙的影响.方法应用荧光钙离子指示剂 Fluo-3/AM将体外培养3～5 d的乳鼠心肌细胞染色,激光共聚焦显微镜(LSCM)观察不同浓度AGEs(50、100、200μg/ml)对心肌细胞瞬时刺激后细胞内游离钙离子浓度的影响.结果与对照组相比,AGEs刺激可以迅速引起心肌细胞胞内游离钙浓度的升高,其恢复时程显著延长并呈剂量依赖性.结论AGEs可能通过改变心肌细胞内游离钙离子浓度对心肌细胞造成损伤.     

辛伐他汀心肌保护作用的新机制：对心肌细胞钠氢交换的抑制作用初探

目的：探讨辛伐他汀是否通过抑制心肌细胞的钠氢交换保护心肌急性氧化损伤.方法：用可标记pH值的荧光探针SNARF-1和可标记Ca2＋的荧光探针Huo-3/AM同时负载原代培养的乳鼠心肌细胞30 min,先后加入H2O2及辛伐他汀等药物,激光共聚焦显微镜检测,根据荧光探针被激发出的不同颜色的荧光强度,同步绘出细胞内pH值（pHi）和细胞内钙离子浓度（[Ca2＋]i）的变化趋势图.结果：辛伐他汀使H2O2引起的pHi和[Ca2＋]i上升分别下降0.08±2.28和0.16±0.53（P ＜0.05）,与阿米洛利（EIPA）的作用相似.结论：辛伐他汀能通过影响心肌细胞内的钠氢交换快速起效,使细胞内pH值下降,抑制钙超载,从而对心肌的氧化损伤起急性保护功能.     

糖基化终极产物对乳鼠心肌细胞胞内游离钙瞬间变化的影响

目的 探讨糖基化终极产物(AGEs)刺激对体外培养乳鼠心肌细胞内游离钙的影响。方法 应用荧光钙离子指示剂Fluo-3/AM将体外培养3~5 d的乳鼠心肌细胞染色,激光共聚焦显微镜(LSCM)观察不同浓度AGEs(50、100、200 μg/ml)对心肌细胞瞬时刺激后细胞内游离钙离子浓度的影响。结果 与对照组相比,AGEs刺激可以迅速引起心肌细胞胞内游离钙浓度的升高,其恢复时程显著延长并呈剂量依赖性。结论 AGEs可能通过改变心肌细胞内游离钙离子浓度对心肌细胞造成损伤。     

HOE642对缺氧/复氧心肌细胞的保护机制

目的 观察Na^＋/H^＋交换抑制剂HOE642对心肌细胞缺氧／复氧（A／R）损伤的保护作用，方法 原代培养的心肌细胞分为对照组、A／R组、A／R＋HOE642组、A／R＋尼卡地平（Nic）组、A／R＋蛋白激酶（PKC）阻滞剂（H7）组和A／R＋丝裂元活化蛋白激酶（MAPK）阻滞剂（PD98059）组。检测各组心肌细胞内游离钙浓度（[Ca^2＋]i）、细胞活力、ATP含量及孵育液中乳酸脱氢酶（LDH）含量、MAPK和PKC活性。免疫印迹法检测心肌细胞钙蛋白酶（u-calpain和m-calpain）。结果 A／R＋Nic、A／R＋HOE642使心肌细胞[Ca^2＋]i降低，且m-calpain蛋白表达亦降低。A／R＋Nic、A／R＋HOE642组心肌细胞孵育液中心肌激酶（LDH、CK）均低于A／R组（P〈0．01）；细胞活力、ATP含量、PKC和MAPK活性高于A／R组（P〈0．05或P〈0．01）。PKC抑制剂H7及MAPK抑制剂PD98059组心肌细胞孵育液中心肌激酶（LDH、CK）均高于A／R组（P〈0．05），细胞活力、ATP含量明显低于A／R组（P〈0．05）。结论 HOE642与钙通道阻滞剂一样，可抑制心肌细胞内游离钙超载引起的心肌细胞A／R损伤，阻断PKC和MAPK，使A／R的心肌细胞损伤加剧。     

MicroRNA-133对心肌细胞内钙的调节机制

目的 研究微小RNA133(microRNA-133,miRNA-133)对乳鼠心肌细胞内钙浓度的调节机制.方法 利用lipofectamine2000将miRNA-133转染到原代培养的乳鼠心肌细胞中,采用细胞免疫荧光染色方法检测miRNA-133对L型钙通道蛋白表达的影响,并采用激光共聚焦显微镜检测miRNA-133对心肌细胞内钙浓度的影响.结果 与对照组相比,转染miRNA-133的乳鼠心肌细胞钙通道蛋白的荧光强度显著降低,细胞内钙荧光强度也明显降低(P<0.05),转染AMO133(miRNA-133的反义链,可特异性阻断miRNA-133)的心肌细胞钙通道蛋白的荧光强度显著增强,细胞内钙荧光强度也明显增加(P<0.05),miRNA-133和AMO133共转染的心肌细胞钙通道蛋白的荧光强度和细胞内钙荧光强度与对照组相比无明显变化.结论 MiRNA-133通过抑制L型钙通道蛋白的表达而降低心肌细胞内的钙浓度.     

蒺藜皂苷对缺氧心肌细胞内蛋白激酶C的作用

目的：研究蒺藜皂苷(GSTT)对氰化钠（NaCN）诱导大鼠乳鼠心肌细胞缺氧时心肌细胞内蛋白激酶C含量的影响。方法:利用培养的Wistar大鼠乳鼠心肌细胞,采用NaCN建立心肌细胞内缺氧模型,100 mg·L^-1 GSTT组和30 mg·L^-1 GSTT组干预12 h后,应用激光共聚焦显微镜系统和流式细胞术定性定量研究心肌细胞内δPKC和εPKC的分布及含量。结果:GSTT能明显促进εPKC和δPKC从细胞浆向细胞膜的转位,100 mg·L^-1 GSTT组激光聚焦显微镜系统及流式细胞术测定的荧光定量心肌细胞内εPKC及δPKC（1 325.00±53.25、810.55±36.89;66.22±6.23、40.12±2.21）与模型组（792.00±32.36、492.40±30.15;32.70±2.78、29.28±4.82）比较,差异具有显著性（P<0.001,P<0.01;P<0.001,P<0.01）,GSTT明显增加δPKC和εPKC表达,100 mg·L^-1 GSTT组δPKC和εPKC含量（1 325.00±53.25、810.55±36.89;66.22±6.23、40.12±2.21）高于30 mg·L^-1 GSTT组(998.00±23.21、710.00± 38.12;55.35±5.15、35.68±3.89),两组比较,差异具有显著性（P<0.01,P<0.05;P<0.01,P<0.05）。结论：GSTT可能通过激活PKC以保护受损心肌细胞。     

Urocortin Ⅰ对缺氧/复氧损伤心肌细胞钙离子的影响

目的 观察UcnⅠ对成年大鼠缺氧/复氧损伤心肌细胞钙离子的影响.方法 通过Langendorff离体心脏灌注系统,用Ⅱ型胶原酶逆行灌注法分离成年大鼠心肌细胞,培养20 h后随机分为正常组(N组)、缺氧/复氧组(L/R组)、UrocortinⅠ组(UcnⅠ组)、5-羟葵酸+UrocortinⅠ组(5- HD+UcnⅠ组).各处理组心肌细胞加入Fluo - 3/AM荧光探针,用激光共聚焦显微镜检测细胞内钙的荧光强度.结果 I/R组心肌细胞内钙离子浓度较N组高(P＜0.05),UcnⅠ组较N组荧光强度明显增强(P＜0.01),而5- HD+UcnⅠ组心肌细胞内钙离子荧光强度与UcnⅠ组比较明显降低(P＜0.05).结论UcnⅠ可使成年大鼠缺氧/复氧损伤心肌细胞内钙离子浓度升高,5- HD则可阻断UcnⅠ的作用,提示UcnⅠ导致缺氧/复氧后心肌细胞钙离子浓度的升高可能跟ATP敏感性钾通道开放有关.     

当归超滤物抗阿霉素致心肌细胞损伤的作用研究

目的探讨当归超滤物抗阿霉素致乳鼠心肌细胞损伤的作用及其可能机制。方法用阿霉素诱导Wistar乳鼠原代培养的心肌细胞建立损伤模型,用不同浓度的当归超滤物进行干预,实验分为正常对照组、阿霉素损伤模型组、当归超滤物不同浓度（3．75、7．5、15g／L）干预组。四氮唑蓝（MTT）法检测各组心肌细胞的存活率,2,4二硝基苯肼显色法检测各组细胞培养上清液中乳酸脱氢酶（LDH）的含量,Ca2＋-ATP酶试剂盒测定Ca2＋-ATP酶活性,蛋白印迹半定量测定各组细胞内caspase-3、caspase-12蛋白的表达。结果与阿霉素损伤模型组比较,当归超滤物各干预组心肌细胞存活率明显升高,LDH含量显著降低（P〈0．05）,Ca2＋-ATP酶活性显著提高（P〈0．05）,caspase-3、caspase-12表达显著降低（P〈0．05）。结论当归超滤物具有拮抗阿霉素致心肌细胞损伤的作用,其机制与其增强细胞ATP酶活性、降低细胞内LDH释放、抑制凋亡因子释放有关。     

白藜芦醇对缺氧诱导大鼠乳鼠心肌细胞凋亡的作用

目的 观察白藜芦醇(Res)对缺氧诱导大鼠乳鼠心肌细胞凋亡的保护作用. 方法 建立体外培养大鼠乳鼠心肌细胞缺氧模型, MTT法检测心肌细胞活力,Hoechst33258染色检测心肌细胞凋亡,测定心肌细胞内总抗氧化能力(T-AOC)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性. 结果 经8h、12h、16h、24h缺氧培养后,心肌细胞抑制率分别为(22.13±3.22)%、(29.75±0.34)%、(37.43±6.42)% 和(45.47±7.32)%;心肌细胞缺氧培养24h后,呈现典型的凋亡形态学变化;心肌细胞内GSH-Px活性从(46.96±8.36)U/ml下降到(27.13±4.76) U/ml(P<0.01);心肌细胞内T-AOC为(2.68±0.31)U/ml,缺氧24h后下降到(1.28±0.27)U/ml(P<0.05).Res(25、50、75μmol/L)可剂量依赖性降低8h、12h、16h、24h缺氧培养所引起的心肌细胞抑制率升高(P<0.05,P<0.01或P<0.001);心肌细胞凋亡形态学改变逐渐改善, 50μmol/L和75μmol/L Res作用更明显;剂量依赖性升高心肌细胞内GSH-Px活性和T-AOC水平(P<0.05 或P<0.01). 结论Res可减轻缺氧诱导大鼠乳鼠心肌细胞凋亡程度.     

CaMKⅡ信号通路在神经肽Y诱导心肌细胞肥大中的作用

目的：探讨钙离子／钙调蛋白（Ca^2＋／CaM）依赖的蛋白激酶Ⅱ（CaMKⅡ）信号通路在神经肽Y（NPY）诱导下心肌细胞肥大的作用。方法：原代培养SD乳鼠心肌细胞，将细胞分为5组，NPY组：培养液中加入终浓度为100nmol／L的NPY：KN-931组、KN-935组和KN-9310组除加入100nmol／L的NPY外，分别加入CaMKⅡ特异性抑制剂KN-93，终浓度为1μmol／L、5μmol／L和10μmol／L；对照组：培养液中不加任何刺激药品。加药24h后采用 ^3H-亮氨酸（Leu）掺入法测定各组心肌细胞蛋白质合成速率，Western blotting测定对照组与NPY组心肌细胞的CaMKⅡδ蛋白表达。结果：经100nmol／L NPY刺激24h后，可明显增加心肌细胞^3H-Leu掺入量（p〈0．05），KN-93（1-10μmol／L）可以抑制NPY刺激的心肌细胞^3H-Leu掺入量的增加，并呈剂量依赖性（P均〈0．05）；100nmol／L NPY明显增加心肌细胞内CaMKⅡδ蛋白的表达（P〈（0．05）。结论：Ca^2＋／CaM依赖的蛋白激酶Ⅱ（CaMKⅡ）信号途径参与NPY诱导的大鼠心肌细胞肥大反应。     

G蛋白参与K物质对心肌细胞内游离钙离子浓度的影响

目的　观测 K物质对体外培养的乳鼠心肌细胞内游离钙离子浓度的影响 ,并探讨作用机制 .方法　应用钙离子荧光指示剂 Fluo- 3AM负载原代培养的大鼠心肌细胞 ,通过流式细胞仪检测心肌细胞内游离钙离子浓度 ([Ca2 + ]i)变化 ;分别应用速激肽受体拮抗剂 - DSP和抗水解 GDP类似物 -GDPβS,观察二者对 K物质诱导的 [Ca2 + ]i变化的影响 .结果　 SK能升高 [Ca2 + ]i,即由对照组的 173± 2 0 nmol· L- 1升高至 2 84± 2 0 nmol· L- 1 (P<0 .0 1) ,且在 1.78× 10 - 5～ 1.78×10 - 7mol· L- 1 浓度范围内存有剂量 -效应关系 ;DSP和GDPβS均可阻断 SK诱导的心肌细胞 [Ca2 + ]i升高的效应 .结论　SK可升高心肌细胞 [Ca2 + ]i,其作用有 G蛋白参与     

麻黄碱、β-细辛醚和去甲乌药碱对大鼠心肌细胞钙离子浓度和细胞膜钙通道的影响

 目的初步筛查麻黄细辛附子的活性单体麻黄碱、β-细辛醚、去甲乌药碱对大鼠心肌细胞钙离子的作用,探讨3种活性单体对心肌细胞功能的影响。方法用酶解法急性分离大鼠心室肌细胞,采用Fluo-3AM荧光探针测定麻黄碱、β-细辛醚、去甲乌药碱对大鼠心室肌细胞内钙离子浓度的影响。利用电生理片钳技术的全细胞电压钳方法测定心肌细胞内高电压依赖性钙离子电流的变化。结果（1）麻黄碱使心肌细胞内钙离子浓度升高,而细胞外液钙离子浓度为零时则无此现象。同时,麻黄碱液使心肌细胞I_Ca峰电流密度显著增大;（2）β-细辛醚和去甲乌药碱分别使心肌细胞内钙离子浓度降低,I_Ca峰电流密度也呈轻度减弱趋势。结论麻黄碱能够增强I_Ca峰电流密度,提高细胞内钙离子浓度,因而具有兴奋心肌细胞的作用,与高电压门控性钙通道开放有关;β-细辛醚和去甲乌药碱通过降低细胞内钙离子浓度和轻微阻断钙离子内流而可能起到保护心肌细胞避免钙超载损害的作用。麻黄碱、β-细辛醚和去甲乌药碱三者对心肌细胞内钙浓度和功能的影响结果符合中药方剂学的相反相成、补偿控制配伍理论。     

阿霉素抑制抗氧化基因表达增强心肌细胞内氧化应激水平

目的 研究阿霉素对乳鼠心肌细胞损伤的机制.方法 将原代培养的乳鼠心肌细胞分成两组:对照组和阿霉素处理组,通过流式细胞术检测心肌细胞内氧化应激水平,采用MTT比色法检测细胞活性,应用Real Time-PCR技术检测Gclc、SLC7A11的表达水平,通过紫外分光光度法检测细胞内谷胱甘肽浓度.结果 阿霉素升高乳鼠心肌细胞内氧化应激水平,对乳鼠心肌有损伤作用.经阿霉素处理后,乳鼠心肌细胞内Gclc、SLC7A11的表达水平及谷光氨肽浓度显著降低.结论 阿霉素通过下调乳鼠心肌细胞Gclc、SLC7A11表达水平,降低细胞内谷光氨肽浓度,升高细胞内氧化应激水平造成乳鼠心肌细胞损伤.     

8 Hz/90 dB次声暴露后心肌细胞凋亡及相关机制研究

目的：观察不同时间90dB次声诱导的大鼠心肌细胞凋亡,并探讨其相关机制．方法：用8Hz／90dB的次声分别作用大鼠1,7,14,21和28d,每日2h,观察大鼠心肌细胞凋亡率的变化,测定大鼠7心肌细胞钙离子浓度的变化．结果：大鼠心肌细胞凋亡率随时间逐渐增大（P〈0．01）,大鼠心肌细胞内钙离子浓度随时问逐渐增多（P〈0．01）．结论：90dB次声可引起大鼠心肌凋亡,与次声暴露时间有关．     

芬太尼对离体大鼠心脏收缩力及心肌细胞钙离子移动的影响

目的　观察芬太尼对离体灌流心脏收缩力及心肌细胞钙离子移动的影响,研究其对心肌收缩力的作用。方法　（１） 以含不同浓度芬太尼的克汉二氏重碳酸盐缓冲液（ＫＨＢ） 灌流大鼠心脏,测定心率（ＨＲ） 、左室收缩压（ＬＶＳＰ） 、左室舒张压（ＬＶＤＰ）、左室收缩压上升最大速率（ ＋ ｄｐ／ｄｔｍａｘ）、左室舒张压下降最大速率（ － ｄｐ／ｄｔｍａｘ） ;（２） 用Ｆｌｕｏ３ＡＭ 钙荧光指示剂染色急性分离的大鼠心肌细胞,在激光共聚焦显微镜下动态观察用药前和用不同浓度芬太尼后,ＫＣｌ 诱发的细胞内钙离子浓度的变化。结果　１ ｎｇ／ｍｌ 和２０ ｎｇ／ｍｌ 的芬太尼对心肌收缩力和心肌细胞钙离子移动的影响较小,心肌收缩力的各项指标和钙荧光强度与对照组相比,差异无显著性（ Ｐ＞ ０．０５） 。而２００ ｎｇ／ｍｌ 芬太尼使心率减慢及＋ ｄｐ／ｄｔｍａｘ 、－ ｄｐ／ｄｔｍａｘ下降,且差异有显著性（ Ｐ＜０ ．０５） 。结论　芬太尼对心肌细胞钙离子的跨膜内流影响较小,而使心肌收缩力保持稳定。超临床使用浓度的芬太尼仍有抑制心肌的趋势。     

新精氨酸类似物对异丙肾上腺素诱导心肌细胞钙浓度改变的影响

目的 探讨新精氨酸类似物对异丙肾上腺素(isoproterenol,ISO)诱导心肌细胞内游离钙变化的影响.方法 培养乳鼠心肌细胞,白介素-6(IL-6)联合内毒素(LPS)诱导心肌细胞表达诱导型一氧化氮合酶(iNOS),钙离子荧光指示剂Fluo-3/AM及激光共聚焦显微镜检测精氨酸类似物对ISO诱导的心肌细胞内游离钙变化的影响.结果 IL-6联合LPS可以明显诱导心肌细胞表达iNOS,增加心肌中一氧化氮(NO)浓度;新精氨酸类似物可以降低炎症凶子刺激的心肌细胞中NO浓度,明显升高ISO诱导的心肌细胞内游离钙浓度.结论 新精氨酸类似物可以通过抑制心肌iNOS/NO途径,提高心肌对β受体激动剂的反应.     

衔接蛋白p66shc在雌激素抑制AngⅡ诱导的心肌细胞凋亡中的作用

目的 探讨衔接蛋白p66shc在血管紧张素Ⅱ (AngⅡ)诱导的心肌细胞凋亡中的作用及雌激素的干预影响。方法 原代培养SD乳鼠心肌细胞,将心肌细胞分为5组:正常对照组、10-11 mol/L AngⅡ组、10－9 mol/L AngⅡ组、10－7 mol/L AngⅡ组、10－7 mol/L AngⅡ+雌二醇组;经药物干预后应用MTT法测定细胞存活率、流式细胞仪测定活性氧含量和细胞凋亡率、荧光酶标仪检测线粒体膜电位水平、Western blot检测p66shc和磷酸化(p-p66shc)蛋白的表达水平。结果 随着AngⅡ浓度的升高,心肌细胞存活率和线粒体膜电位水平逐渐下降,而细胞内活性氧含量和凋亡率逐渐升高 （P<0.05）;且雌激素预处理可减轻AngⅡ对心肌细胞的损伤 （P<0.05）。AngⅡ可使心肌细胞内p-p66shc和线粒体内的p66shc的表达呈剂量依赖性升高 （P<0.05）,雌激素预处理可减弱AngⅡ对细胞内p-p66shc和线粒体内p66shc表达水平的影响 （P<0.05）。结论 p66shc参与了AngⅡ诱导的心肌细胞凋亡反应,且雌激素可通过下调线粒体内p66shc的表达而减轻AngⅡ对心肌细胞的损伤。     

细胞外信号调节激酶对心肌细胞钠氢交换体调控的作用

目的：探讨细胞外信号调节激酶（ERK）对心肌细胞钠氢交换体（NHE）的调控作用。方法：用氯化铵诱导乳鼠心肌细胞内酸化,用荧光指示剂（BCECF／AM）法测定细胞内pH值,钠氢交换体的活性用酸化后每分钟pH值的变化率（dpHi／dt）表示,观察使用ERK特异性抑制剂U0126后对NHE活性的影响;用Western blotting检测心肌细胞ERK蛋白的磷酸化水平。结果：用ERK的选择性抑制剂U0126（3μmol／L）预孵育5min,与模型组比较,U0126组可以使钠氢交换的活性下降49．46％（P〈0．05）;与模型组比较。ERK的磷酸化水平降低66．5％（P〈0．05）。结论：细胞内酸化激活NHE和ERK的过程中,NHE的激活受到ERK的调控。