荧光寿命成像显微的频域零差法测量及数据处理

介绍了一种实现荧光寿命成像显微技术（FLIM）的频域零差法，并改进了测量数据的逐点分析法，设计了相应的数据处理软件．通过对模拟数据的处理表明，完全满足FLIM数据处理的要求。     

基于交替下降条件梯度的低光子数荧光寿命分析

发展适用于低光子数应用环境的荧光寿命分析方法对快速荧光寿命显微成像(FLIM)方法的发展和应用都具有重要意义。受高密度单分子定位显微成像中压缩感知算法的启发,将荧光寿命分析看成一个稀疏逆问题,提出了一种基于交替下降条件梯度(ADCG)的荧光寿命分析新方法,并通过对模拟数据和实验数据进行分析,验证了ADCG-FLIM算法即使在低光子数情形下依然能够较好地分析荧光寿命,从而有利于活细胞快速FLIM技术的发展和应用。     

荧光寿命成像显微技术

介绍荧光寿命成像显微（FLIM）技术及其在生物物理、生物化学及临床医学诊断等领域的最新研究成果和发展现状，并就其未来的发展及应用研究进行了讨论。     

荧光共振能量转移技术在生命科学中的应用及研究进展

荧光共振能量转移(FRET)是指两个荧光基团间能量通过偶极-偶极耦合作用以非辐射方式从供体传递给受体的现象,可被用于测定分子间的距离.FRET荧光探针主要有荧光蛋白、有机荧光染料、镧系染料和量子点,近年来有许多新的应用;测试方法上与时间分辨、单分子检测、荧光寿命和荧光相关光谱等技术联用取得了更好的成效.     

荧光寿命成像技术及其研究进展

荧光寿命显微成像(FLIM)技术是一种新颖的荧光成像技术,具有其他荧光成像方法无法替代的优异性能,是生物医学工程领域的研究热点。频域调制、门控探测和时间相关单光子计数(TCSPC)是FLIM的几种主要实现方法。综述了这些技术的原理、研究现状和已取得的部分成果,比较了这三种方法的时间分辨率和成像速度等参数的优劣。宽场FLIM更适用于延时成像和实时成像。荧光偏振各相异性成像和内窥镜FLIM技术都是FLIM技术很有前景的应用方向。     

单分子三维取向超分辨成像技术进展（特邀）

超分辨显微成像技术自诞生以来,凭借其优异的纳米级空间分辨率,已成为生命科学研究中精准揭示复杂生命现象的重要成像技术。其中,基于单分子定位的超分辨成像策略,使得定位、观察、研究单个探针分子独特的理、化、光学性能成为可能。偏振作为荧光信号的一个重要特性,近年来伴随着单分子三维取向成像技术的发展,逐步在单分子成像和超分辨领域中展示出诸多新颖且重要的应用特性。本文总结了单分子三维取向超分辨成像技术的最新进展,介绍并分析了两类主要的单分子三维取向荧光显微技术——基于荧光吸收与辐射偏振调制的单分子三维取向成像方法以及利用点扩散函数工程将单个荧光分子的三维取向信息编码到荧光图像上的成像策略。此外,还探讨了应用于活细胞或单颗粒的其他类型的超分辨取向成像技术。最后,针对单分子三维取向超分辨成像技术发展与应用前景面临的挑战,进行了总结与展望。     

荧光金纳米团簇探针的生物成像应用进展（特邀）

金纳米团簇（AuNCs）因兼具优异荧光特性、超小尺寸、精确化学组成及良好生物相容性等优势，使其成为近些年备受关注的新型荧光探针。为了推动荧光AuNCs在成像领域的应用，研究者们一直致力于发展高性能荧光AuNCs的设计与制备策略。基于对AuNCs结构与发光机制的理解，诸如提高荧光量子产率和细胞摄取率等策略陆续被提出以增强AuNCs的细胞成像效果，极大提升了其作为荧光成像探针的潜力，并将AuNCs的应用推广至荧光寿命成像、多光子成像等新兴荧光成像技术。近些年发展的具有近红外二区荧光的AuNCs进一步推动了其在活体成像的应用。文中概述了AuNCs的制备方法、提高AuNCs细胞荧光成像效果的各种策略，以及AuNCs荧光成像应用的最新进展，并对该领域的挑战和未来发展进行了展望。     

荧光相位成像及实验研究

荧光相位成像是最近发展起来的一项应用于生物的光子学技术．由于大多数有机物或生物组织在紫外或可见光激发下都会产生荧光，而荧光寿命通常能反映出细胞内某些成份（O2，K ，Ca2 ）的浓度变化，这对于研究细胞的功能及动力学过程具有十分重要的意义．荧光相位成像技术则通过相位与寿命之间的关系，可确定荧光寿命．通过下列表达式E（t）＝EO（1＋mesinωt）（1）tanθF＝ωT（2）可以简要阐明荧光相位成像的基本原理．式（1）中EO为激发光源功率，me为调制度，ω为调制频率，式（2）中θF为相位差，r为荧光寿命．当参考信号的相移为…     

利用基于扫描相机的荧光寿命成像显微技术研究细胞周期

利用基于扫描相机的荧光寿命成像显微系统,以细胞周期为模型,研究转染绿色荧光蛋白的HeLa细胞的荧光寿命。结果表明,处于周期内不同进程的细胞的荧光寿命为2.50~3.00 ns。处于分裂期的细胞的荧光寿命在1 h内从2.86 ns下降到2.82 ns;在DNA合成前期的8 h内,荧光寿命从2.82 ns下降到2.78 ns。荧光寿命的差异反映了细胞周期中核浆内大分子浓度的变化,对了解细胞周期的分子机制有一定的意义。     

基于近场光纤探针的活细胞无损测温方法研究

高精度的单细胞温度分布检测对于研究生命活动具有重要意义。为了实现高空间分辨率、高温度灵敏度的细胞测温,本研究团队基于原子力显微镜的扫描成像原理,将对温度敏感的量子点与音叉驱动的近场光纤探针相结合,提出了一种无损伤测量活细胞表面温度分布的方法;并以人脑星形胶质母细胞瘤细胞为研究对象,利用该方法检测了吞金纳米颗粒的固定细胞和未内吞金纳米颗粒的活细胞的温度分布。结果表明：在无金纳米颗粒作为附加热源的情况下,由活细胞内部产热引起的细胞表面最大温差超过0.5℃,而细胞与其外部环境间的温差大于2.5℃。所提活细胞无损测温方法的空间分辨率小于0.2μm,温度分辨率为0.16 nm/℃,为活细胞温度分布成像提供了新思路。     

快速三维荧光显微成像技术的研究进展（特邀）

荧光显微成像具有高分辨率、高灵敏度、高分子特异性以及非介入性的优点,可以在微米乃至纳米尺度下表征样本的形态学与分子功能学信息,成为了生命科学研究的重要工具。随着微观生物学研究的不断深入,荧光显微成像被期待能够动态且立体地观测微观生物结构与分子事件。文中系统性地梳理了近年来快速三维荧光显微成像技术的研究进展,包括点扫描式成像、宽场成像与投影断层成像在提高成像速度、拓展成像维度以及增强成像质量等方面的主要技术手段、改进策略与代表性研究成果,并展望了快速三维荧光显微成像技术的未来挑战与发展前景。     

基于一次成像测量FRET系统校正因子的智能型QuanTi-FRET方法

QuanTi-FRET是一种通过对多种荧光共振能量转移(FRET)标准质粒样本进行多次FRET成像来测量FRET成像系统敏化淬灭转化因子(G)和供受体通道激发效率校正因子(β)的方法。本课题组发展了一种基于一次成像测量系统校正因子G和β的智能型QuanTi-FRET方法——AutoQT-FRET方法。AutoQT-FRET方法包括如下4个步骤：1)将分别转染了不同FRET标准串联质粒(C5V、C17V、C32V和CTV)的细胞合并到一个细胞培养皿中培养,对该皿细胞样本进行三通道FRET成像;2)对三通道图像进行区域划分,并根据不同种类的FRET标准质粒对各区域进行归类;3)对归类成功的区域逐像素绘制三维空间散点图,以确定各个FRET标准质粒的标准线;4)使用确定好的各质粒标准线对整个视野内的细胞区域进行质粒分类与系统校正因子G和β的测量。该方法大幅简化了系统校正因子的测量过程,缩短了测量时间。本文比较了AutoQT-FRET方法与其他方法测量系统校正因子的优劣,实验结果表明：AutoQT-FRET方法操作简单,而且测量稳定性与准确度都有所提高。     

受激拉曼散射显微技术在生物科学中的应用

受激拉曼散射(stimulated Raman scattering,SRS)显微技术,可以通过探测分子的特定振动模式,实现对活细胞的无标记和新型非荧光标记成像。由于SRS显微术具有较高的化学特异性,在生命科学成像领域具有极大的应用潜力。本文简要介绍了SRS显微技术的原理,同时总结了其在脂类、核酸和蛋白质等生物分子,以及在组织结构、小分子药物和食品分析中的应用。     

共聚焦荧光寿命显微系统

提出一种集成了激光扫描共聚焦显微术和荧光寿命测量技术的共聚焦荧光寿命显微系统,用于观察生物细胞等样品微观结构以及对环境条件信息成像。通过配合使用空心角锥棱镜和平面反射镜简化光路调整,成功搭建系统。实验结果显示,系统的空间分辨率能达到约180nm,荧光寿命时间分辨率达到约20ps。本文系统能为生物细胞学、材料学等学科研究提供直观途径。     

超分辨显微技术在活细胞中的应用与发展

细胞是生命体的基本单位和功能单位,对活细胞内部结构及其功能的研究是了解掌握生命本质的基础之一,因此活细胞的实时观测对生命科学的发展具有重要意义。传统的光学显微技术受衍射极限的限制,无法观测200 nm以下的生物结构细节。近20年来,随着超衍射极限光学理论、技术、器件和荧光探针等方面的快速发展,超分辨显微成像技术已成为应用于生命科学研究的重要手段。然而,大多数超分辨显微方法或测量耗时长,或易引起荧光蛋白漂白/细胞损伤,在活细胞研究中受到极大限制,已成为超分辨显微领域重点攻关的方向之一。为此,文中结合作者在快速超分辨显微技术研究的基础上,介绍了基于单分子成像的光激活定位显微技术和随机光学重构显微技术、基于荧光非线性可饱和光转换的受激发射显微技术以及基于结构光照明的超分辨显微技术,并探讨了在活细胞成像中的发展应用。最后,文中展望了超分辨显微成像技术在活细胞成像中的未来发展趋势。     

隐失波荧光显微镜及其在植物细胞生物学中的应用

隐失波荧光显微术（evanescent wave fluorescence microscopy,EWFM）是一种对细胞膜附近的生物学过程进行选择性观测的光学显微成像技术,该技术是基于全内反射原理,即当光在生物样品表面产生全内反射时,虽然在样品表面未被光直接照亮,但它仍会产生一种隐失波,这种隐失波却有足够能量将样品表面100～200 nm范围内的荧光基团激发。由于这一特性使得隐失波荧光显微镜能对靠近细胞膜的生物学过程,如胞吞胞吐、单个分子与细胞膜的结合和解离,以及膜上受体的动态变化过程等进行更好的观测。本文简略地介绍了隐失波荧光显微术的原理,同时对其在细胞生物学,特别是在植物细胞生物学中的应用作了初步总结。随着隐失波荧光显微镜的商业化及其观测技术的不断改进,它将在生命科学领域的研究中发挥越来越大的作用。     

超分辨成像中荧光分子定位算法性能比较

超分辨成像已成为活细胞结构和功能成像的关键工具,荧光分子定位是超分辨成像过程中不可缺少的步骤。从超分辨成像角度研究各种荧光分子定位算法性能具有重要的意义。选择5种典型的荧光分子定位算法:质心法、广义质心法、高斯拟合、解线性方程组和极大似然法,以定位精度和定位时间来评价所选择算法的性能。结果表明,1)高斯拟合、极大似然法和广义质心法能高精度对荧光分子定位,不受荧光分子所在子区域提取的影响;2)质心法和解线性方程组法能应用于图像在线分析,但定位精度较低,受子区域提取影响较大;3)当两个荧光分子位于一个衍射斑时,采用这5种算法的定位精度都会急剧下降。     

具有荧光开关特性的喹啉衍生物用于高效选择性标记细胞脂滴

脂滴是一种重要的细胞器，与细胞中多种生理活动密切相关。为了观察脂滴并研究其多种多样的功能，共聚焦荧光成像技术是最有力的工具之一。然而，细胞脂滴荧光成像所需的具有高荧光亮度和高标记选择性的脂滴荧光探针却十分有限，这严重限制了脂滴的深入研究。研制了一种具有荧光开关特性的喹啉衍生物脂滴荧光探针（Lipi-QL）。该探针因其敏感的极性淬灭荧光特性，展现出了很高的脂滴标记选择性。Lipi-QL能靶向脂滴是因为其脂溶性，进入脂滴后，荧光增强是脂滴内的较低极性引起的。给受体型分子结构还赋予了该探针高的荧光亮度以及大的斯托克斯位移。将该探针用于细胞脂滴共聚焦荧光成像，在不同浓度下都实现了显著优于脂滴商用探针BODIPY 493/503的标记选择性。此外，使用该荧光探针实现了固定细胞的三维共聚焦成像和活细胞的四色共聚焦成像。该荧光探针的研制一方面为脂滴生理功能的研究提供了强有力的工具，另一方面也为新型高标记选择性荧光探针的设计提供了新的思路。     

蛋白酶荧光探针及新型显微成像技术的生物医学应用

研究上正常生理条件蛋白酶的活化情况仍然存在很多困难,将蛋白酶荧光探针技术和基于各种光学平台的显微成像技术有机地结合起来,可以最大限度地记录活细胞生理条件下蛋白酶活性变化的时空信息.综述了蛋白酶荧光探针技术及其与该类探针应用相关的新型显微成像技术在生物医学光子学领域的应用进展.     

研究进展

光学显微镜揭示单个蛋白质分子美国研究人员开发了一种新型光学成像技术,可以显示细胞中纳米尺度的蛋白质分子,该技术被称为光敏化定位显微术(photoactivlated localization microscopy,PALM)。它开创性地将荧光蛋白质分子附着在目标蛋