基于PCR-核酸试纸条快速鉴定鹿茸及其伪品的实验研究

目的 通过聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)与核酸试纸条相结合的方法,实现鹿茸真伪的可视化检测。方法 采用十二烷基硫酸钠(sodium dodecylsulfate,SDS)碱变性法提取正品及伪品鹿茸样品基因组DNA,通过查找细胞色素C氧化酶亚基I(COI)特异性位点,应用Primer 3.0软件设计鹿茸特异引物,摸索PCR最佳反应体系及条件,建立PCR-核酸试纸条及琼脂糖凝胶电泳鉴定鹿茸真伪的最优条件。同时,通过克隆测序,验证鹿茸真伪鉴定的准确性。结果 本实验中正品鹿茸在PCR-核酸试纸条上均出现两条带,阴性对照及伪品出现一条带,与琼脂糖凝胶电泳结果吻合,且试纸条检测的灵敏度可达1 ng·μL^-1。对9个市售鹿茸样品检测,正品鹿茸5个,合格率为45%。结论 自主构建的PCR-核酸试纸条检测方法简单、快速、特异性较好,可在较短时间内实现鹿茸真伪的可视化检测,检测结果稳定,为中药材鉴定提供又一新的方法。     

金钱白花蛇及其混淆品高特异性PCR的鉴别

目的：建立一种实用、简便的金钱白花蛇药材DNA分子标记鉴别方法。方法：根据金钱白花蛇及常见混淆品线粒体Cyt b基因序列,设计一对专门用于中药材金钱白花蛇的鉴别引物HJL-1和HJH-1。用不同的复性温度PCR扩增,确立特异性反应条件,并利用此方法鉴别从市场中购买的金钱白花蛇药材。结果：在67 ℃复性温度下进行PCR,正品金钱白花蛇均得到230 bp的扩增带,而混淆品在同样的条件下无扩增带。对市售金钱白花蛇药材随机选取18块进行PCR鉴别验证,其中正品14块,混淆品4块,检出率达100％。结论：设计的鉴别引物对正品金钱白花蛇有高度特异性。可用于市售金钱白花蛇药材的鉴定。PCR稳定性高,同种不同个体间的种内差异对鉴定结果不会有影响。     

应用PCR-RFLP方法鉴定梅花鹿茸与马鹿茸

目的 建立一种应用限制性片段长度多态性技术鉴别梅花鹿茸与马鹿茸的方法。方法 提取各种鹿茸样品的基因组DNA,通过聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)对正品鹿茸的特异性片段进行扩增,鉴别鹿茸的真伪,然后对正品鹿茸利用动物通用引物进行PCR扩增,并通过限制性片段长度多态性分析进一步对正品鹿茸的种属来源进行确证。结果 通过对特异性片段的PCR扩增,可将梅花鹿茸及马鹿茸与驯鹿、麋鹿、新西兰鹿等伪品鹿茸加以区分,通过对限制性内切酶Msp I 进行酶切后的片段长度进行分析,可进一步区分梅花鹿茸与马鹿茸。结论 本实验建立了一种基于限制性片段长度多态性技术快速、准确的鉴别鹿茸真伪及种属鉴定的方法,为解决中药易混品种难以鉴定的问题提供了又一个新方法。     

金钱白花蛇与三种常见混伪品多重PCR鉴别方法

目的建立一种快速、高效的鉴别金钱白花蛇(银环蛇)与三种常见混伪品的多重PCR方法。方法采用动物DNA提取试剂盒提取金钱白花蛇、赤链蛇、赤链华游蛇与金环蛇DNA;根据各样品COI(动物线粒体细胞色素b基因)序列设计4对不同长度的特异性引物,建立并优化多重PCR反应体系,通过电泳检测扩增产物分子量差异实现4种蛇类的快速鉴别。结果针对金钱白花蛇、赤链蛇、赤链华游蛇与金环蛇所设计的4对引物分别扩增出136、195、244和315bp的目的条带;每对引物特异性扩增,灵敏度为皮克级。结论首次建立了金钱白花蛇与常见三种相似混伪品的多重PCR方法。此方法特异性高,为多重PCR技术体系在中药材金钱白花蛇的快速检测提供参考。     

基于巢式PCR方法联合Sanger测序技术对大黄庶虫丸中水蛭成分真伪的鉴定

目的 基于DNA条形码技术建立一种可以实现对大黄庶虫丸中水蛭成分真伪品鉴定的方法。方法 首先以COⅠ通用引物对大黄庶虫丸中成药DNA进行一轮聚合酶链式反应(PCR)扩增,随后采用自行设计和筛选出的水蛭通用引物对一轮PCR反应液进行二轮PCR扩增,联合Sanger测序技术,对二轮PCR扩增产物测序,最后对测序结果峰图采用seqman软件进行序列拼接,将拼接后的DNA序列在NCBI数据库中用BLAST在线比对软件进行比对判定,进而鉴定水蛭成分真伪。结果 本实验建立的巢氏PCR方法联合Sanger测序技术通过了对9份经COⅠ通用引物鉴定的水蛭干药材的验证,结果验证两方法鉴定结果一致。同时采用本研究建立的巢氏PCR方法联合Sanger测序技术对收集的14批大黄庶虫丸进行鉴定,共有5批鉴定出含有伪品水蛭成分。结论 本实验建立的的巢氏PCR方法联合Sanger测序技术能够实现对大黄庶虫丸中水蛭成分真伪品的鉴定,对中成药的质量控制具有一定的意义。     

基于物种特异性PCR方法的鸡内金真伪鉴别

目的:建立鉴别鸡内金及其常见伪品的物种特异性聚合酶链式反应(PCR)方法,对全国中药材及饮片专项抽验任务中所抽取的鸡内金饮片进行真伪鉴别,评价市场上鸡内金的真伪情况。方法:根据鸡、鸭、鹅的12S序列差异,设计或优化物种特异性PCR鉴别引物,对影响PCR结果的主要因素退火温度,PCR循环次数,模板DNA浓度,Taq酶种类等进行方法学考察和优化。使用优化的特异性PCR方法对鸡、鸭、鹅内金样品进行DNA分子鉴别。结果:在进行方法学考察确定最优鉴别条件的基础上,当PCR退火温度为55℃,循环次数为30次的条件下,当使用文中筛选得到的鸡物种特异性鉴别引物时,所测鸡内金饮片均检出约为273 bp的特异性扩增条带,混伪品鸭内金和鹅内金均无相应扩增条带;当使用鸭和鹅鉴别引物时,均未检出相应的扩增条带。结论:位点特异性PCR方法能够快速准确的鉴别出鸡内金真伪品,可用于全国中药材及饮片专项抽验任务中鸡内金的真伪鉴定,目前市场上用鸭内金和鹅内金充鸡内金现象较少,质量评价较好。     

快速PCR方法在蛇类药材真伪鉴别中的应用

为优化获得一种准确、快速、高效鉴别药典所载蛇类药材(乌梢蛇,金钱白花蛇,蕲蛇)真伪品的方法。该研究以蛇类药材经典PCR鉴定方法为基础,采用碱裂解法提取基因组总DNA,加入特异性PCR引物,采用两步法进行PCR扩增,从而对蛇类药材及其混淆品进行鉴别。通过对影响PCR反应时间的退火温度、变性温度、退火时间、变性时间、循环次数等因素进行优化,并对不同型号PCR仪和Taq酶进行考察,分别获得乌梢蛇、金钱白花蛇、蕲蛇快速PCR反应程序。在PCR产物中加入SYBR Green I染料,正品显示出明亮绿色荧光,而混淆品不显示荧光。所建立的蛇类药材快速PCR真伪检测方法可在30~45 min完成,为蛇类药材现场快速鉴定提供技术支持。     

应用多重PCR技术鉴别3种肾源性中药的实验研究

目的 建立一种应用多重聚合酶链式反应(PCR)技术鉴别3种肾源性药品的方法。方法 提取梅花鹿、驴、犬3个物种肾组织的基因组DNA,通过多重PCR对梅花鹿、驴、犬的特异性片段进行扩增,鉴别样品中是否含有梅花鹿、驴、犬3种动物源性成分。结果 通过对特异性片段的PCR扩增,可同时将梅花鹿、驴、狗的肾与其他物种进行区分。结论 本研究建立了一种基于多重PCR技术的快速、准确的同时鉴别梅花鹿、驴、犬3个物种肾源性药品方法,为解决药用性产品易混、难以鉴定的问题提供了又一个新方法。     

鹿茸线粒体DNA的指纹鉴定研究

 目的 通过鹿茸特异性引物鉴别和随机扩增多态DNA(RAPD)鉴别的比较,选择一种更简便的方法用于鉴别鹿茸。 方法 采用盐析法从梅花鹿茸、马鹿茸、驯鹿茸、市售鹿茸等样品中抽提线粒体DNA,并应用试剂盒进行纯化。进行特异性引物扩增和序列测定,同时进行随机扩增多态DNA扩增。结果 梅花鹿茸,马鹿茸,驯鹿茸以及部分市售鹿茸经特异性引物扩增后均可在琼脂糖凝胶中显示313 bp片段,只是条带亮度不同。而其余市售鹿茸无扩增条带; 随机扩增多态DNA不仅有效显示阳性与阴性的DNA扩增结果,而且对梅花鹿茸,马鹿茸,驯鹿茸的聚合酶链反应产物的差异,以不同的条带数目和条带亮度得以验证。结论 随机扩增多态DNA鉴别鹿茸真伪的方法更准确快捷,通过随机扩增多态DNA扩增后主条带与梅花鹿茸或马鹿茸扩增的条带大小和亮度一致,则为正品;如不一致,则为《中国药典》规定外的鹿茸或其他混淆品。这种方法对于筛选、甄别市售动物中药材,特别是名贵中药具有广阔的应用前景。     

特异性PCR鉴别蜈蚣及其混伪品

目的:蜈蚣是我国传统的中药材,具有良好的药用价值。目前市场上蜈蚣的混伪品日益增多,临床用药的安全性和有效性难以保证。该研究建立了一种蜈蚣基原物种的特异性聚合酶链式反应(PCR)方法,以准确、简便的鉴别蜈蚣及其常见混伪品。方法:通过比较蜈蚣及其混伪品基原物种的COI基因序列差异,根据变异位点设计蜈蚣正品少棘巨蜈蚣的特异性鉴别引物WG-500.F和WG-500.R,采集蜈蚣原动物样本及药材样本,优化反应体系并对此方法进行耐受性和适用性的考察和验证。结果:少棘巨蜈蚣原动物样本及蜈蚣正品药材使用设计的蜈蚣鉴别引物经PCR扩增和凝胶电泳后出约500 bp的单一明亮条带,其他混伪品如多棘蜈蚣、模棘蜈蚣、哈氏蜈蚣、海南蜈蚣等均无条带出现。结论:PCR鉴别方法可准确鉴别蜈蚣原动物和药材的真伪,具有高度特异性,为中药材蜈蚣的真伪鉴别提供了良好的科学依据。该方法具有简单、直观等特点,有利于广泛的普及与应用,在中药材鉴定方面有着广阔的应用前景。     

环介导等温扩增技术在西洋参鉴定中的应用

目的 探讨利用环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术鉴别西洋参的方法.方法 针对西洋参的CYP450基因设计特异性引物,应用RT-LAMP(real time-LAMP)、琼脂糖凝胶电泳和可视化检测3种方法对LAMP检测方法进行优化,并对其灵敏性...     

桃仁及苦杏仁DNA检测试剂盒的研制与评价

目的 本研究旨在研制一种快速检测试剂盒,鉴定桃仁及苦杏仁DNA成分,并对其进行性能评价。方法 建立DNA提取方法,确保有效提取桃仁及苦杏仁基因组DNA,紫外分光光度法测其浓度及纯度。美国国立生物技术信息中心(NCBI)查询并比对桃仁及苦杏仁的ITS序列,针对特异性位点,NCBI Primer-Blast设计种属特异性引物。建立并优化聚合酶链式反应(PCR)检测体系,DH5α感受态细胞克隆特异性片段,测序验证体系准确性,制备阳性对照。组装DNA检测试剂盒,对其特异性、稳定性及重复性进行评价,并对市售桃仁和苦杏仁样品进行检测。结果 所建立DNA提取方法,提取效率高,DNA质量浓度高于100 ng·μL^-1,A_260/280处于1.80～2.10之间。该试剂盒可准确鉴定桃仁及苦杏仁DNA成分,检测灵敏度高,特异性强,最低检测限为1 ng·μL^-1。反复冻融20次后仍可有效检测,可于-20 ℃保存1年。20个市售样品中检出1个桃仁伪品及2个苦杏仁伪品,其余均为正品。结论 桃仁及苦杏仁DNA检测试剂盒特异性强、灵敏性高、稳定性好,具有良好重复性,可快速鉴定桃仁及苦杏仁,为桃仁中药材市场质量安全管理提供有力支持。     

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??OBJECTIVE To design specific PCR primers and establish the PCR identification method of Ophiopogon japonicas from Sichuan.METHODS The gene footprint of Ophiopogon japonicas from Sichuan named CM503 was screened from random amplified polymorphic DNAC(RAPD) amplification. Reclaimed CM503 gene was inserted into T-vector to be cloned and sequenced. One pair of specific primers CM1/CM2 were designed according to the CM503 sequence and applied in specific PCR using the genomic DNA of Ophiopogon japonicas from Sichuan as template.RESULTS A specific band around 297 bp was detected in Ophiopogon japonicus from Sichuan at 68 ??, while nothing appeared for the other varieties.CONCLUSION The method is convenient, reproducible, and precise, with broad application prospects.     

菟丝子、莱菔子与其易混淆品的快速PCR法鉴别研究

完善快速PCR鉴定检测体系,并建立菟丝子或莱菔子的分子鉴别方法。收集不同地区的菟丝子、莱菔子及其易混淆品材料,所有样品进行总DNA的提取,通过对菟丝子、莱菔子及其易混淆样品ITS片段进行扩增、测序,进行同源比对后根据其变异位点设计特异性鉴别引物,采用2步法进行PCR扩增,从而对菟丝子或莱菔子进行鉴别。通过对影响PCR退火温度、变性温度、退火时间、变性时间、循环次数等因素进行优化,并对不同型号PCR仪进行考察,分别获得菟丝子、莱菔子快速PCR反应程序。在稀释后的PCR产物中加入SYBR GreenⅠ染料,正品显示出明亮绿色荧光,而混淆品不显示荧光,且可有效的避免因引物二聚体而存在的假阳性问题。快速PCR方法可以简单快速鉴别菟丝子、莱菔子,为实现药材分子鉴别的现场运用提供技术支撑。     

基于cp DNA序列和ISSR分子标记的甘肃祁连山地区麻花秦艽变异与遗传分化分析

目的 采用叶绿体基因(cp DNA)序列和ISSR分子标记技术对甘肃祁连山地区麻花秦艽进行序列变异和遗传分化分析。方法 利用试剂盒提取法提取麻花秦艽的基因组DNA,利用筛选出的trnS-trnG和rpl20-rps12引物进行扩增并测序,通过软件Chromas、ContigExpress对得到的序列进行校正、拼接,利用MegaX、DanSP5、GenALEx软件对拼接后的序列进行序列特征分析,最后利用PopART软件得到麻花秦艽的单倍型网状进化图。结果 18个麻花秦艽居群共计114个个体被成功扩增和测序;2个cp DNA片段经拼接后的长度为1 246 bp,共有676个多态性变异位点,459个单一突变位点、217个简约信息位点和107个插入-缺失位点;单倍型41个,其中特有单倍型34个;Tajima′s D检验在P>0.05水平上不显著,整体遵循中性进化模型。居群内变异百分比为89%,说明遗传变异主要存在于居群内;Fst=0.114(P<0.05),Nm=3.889说明居群间分化程度较低,居群间具有较强的基因交流。遗传距离与地理距离相关性分析r=-0.094(P<0.05),说明遗传距离与地理距离不具有明显的相关性。结论 甘肃祁连山地区麻花秦艽在物种水平上遗传多样性较高,具有丰富的单倍型类型,居群的遗传变异主要来自于遗传漂变。     

中成药DNA检测标准物质的制备及评价

目的 研究制备和评价DNA检测标准物质的方法,为促进聚合酶链式反应(PCR)检测方法在中成药检验中的应用提供保证.方法 以水稻源性DNA检测标准物质(水稻标准物质)为例,依据CNAS-GL03:2018《能力验证样品均匀性和稳定性评价指南》和CNAS-GL017:2018《标准物质/标准样品定值的一般原则和统计方法》的...