MT 及bFGF体外诱导大鼠骨髓基质干细胞向神经细胞方向分化的研究

目的：探讨体外诱导大鼠骨髓基质干细胞（MSCs）向神经元样细胞分化的最宜条件，为细胞移植提供寿命相对较长种子细胞。方法：采用细胞培养技术分离培养和纯化大鼠MSCs，以褪黑素（MT）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）为诱导剂定向诱导大鼠MSCs向神经元细胞分化。以免疫荧光法测定分化细胞神经特异性烯醇化酶（NSE）、星形胶质细胞特异性标志（GFAP）的表达。结果：MT、bFGF诱导分化3d部分细胞胞体收缩成三角形，有些成为简单的双极或多极细胞。诱导72h细胞开始表达NSE，9-14d阳性细胞增多，其中MT＋bFGF组变化显著，细胞不表达GFAP。结论：MT和bFGF可以诱导大鼠MSCs向神经元细胞分化，并存活14d以上稳定表达神经元细胞的特异性标记NSE。     

人脐血CD34+细胞移植对局灶性脑缺血大鼠神经功能恢复的影响

目的:CD34 造血干细胞具有自我更新、多向分化及重建长期造血和免疫的生物学功能,针对心肌缺血性损伤、肢体血管闭塞引起的组织缺血等治疗有显著的疗效.由于中枢神经系统缺血性损伤临床治疗康复效果不佳,观察人脐带血CD34 细胞移植对大鼠大脑中动脉栓塞后神经功能恢复的影响及CD34 细胞的存活、迁移以及向神经细胞分化的情况.方法:实验于2002-05起在天津市中国医学科学院中国协和医科大学血液学研究所进行.①实验材料:雄性SD大鼠由解放军军事医学科学院第四研究所提供,体质量250-350 g,实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准.人脐带血由天津脐血干细胞库提供,产妇及家属对实验知情同意,并符合医学伦理学标准.②实验方法:将大鼠随机分为3组:CD34 细胞移植组:用线栓法建立大鼠左侧大脑中动脉栓塞模型后24 h移植CD34 细胞:生理盐水组:左侧大脑中动脉栓塞后24 h后注射等量的生理盐水;假手术组:仅行左侧大脑中动脉栓寒.③实验评估:采用改良神经功能损害评分观察大鼠神经功能恢复情况,应用免疫组织化学和免疫荧光双标记技术检测BrdU标记的CD34 细胞存活、迁移及其GFAP蛋白和NeuN蛋白的表达.结果:①CD34 细胞移植组与其它各组在移植完成24h改良神经功能损害评分差异无显著性(P＞0.05);移植后1周到第4周,各组动物均有神经功能不同程度的恢复,CD34 细胞移植组神经功能恢复明显优于另两组(P＜0.05).②CD34 细胞移植组与另两组比较,大鼠脑梗死体积无明显变化.③移植的CD34 细胞可在大鼠脑组织中存活,部分CD34 细胞同时表达GFAP蛋白或NeuN蛋白,并向缺血区域迁移.结论:CD34 细胞可在大鼠脑缺血区域中存活、迁移并向星形胶质细胞或神经元分化,同时促进神经功能恢复.     

造血干细胞与神经生长因子联合移植治疗脑梗死

背景:目前采用外周血造血干细胞移植治疗脑缺血方面的研究还比较少,缺乏大量、系统的实验数据.神经生长因子可调控神经元再生所需的微环境,对神经细胞的存活、增殖起重要作用.目的:观察造血干细胞移植后,神经生长因子对其在脑梗死大鼠脑内的存活、分化及神经功能的影响.设计:随机对照动物实验.材料:清洁级成年雄性SD大鼠120只,随机分为3组:单纯细胞移植组、细胞移植+神经生长因子组、模型对照组,40只/组.神经生长因子为北大之路药业有限公司产品.方法:大鼠颈部皮下注射重组人粒细胞集落刺激因子后,密度梯度离心法分离培养造血干细胞,移植前行Brdu标记.3组大鼠根据改良Longa线栓法建立大脑中动脉闭塞模型,造模后7 d,大鼠麻醉后暴露前囟,选取注射位点:前囟后方1.2 mm,中线向右旁开3 mm,硬膜下4 mm.单纯细胞移植组缓慢注入1×106个造血干细胞,细胞移植+神经生长因子组注入1×106个造血干细胞+200 ng神经生长因子,模型对照组给予等量磷酸盐缓冲液.主要观察指标:采用神经功能缺损评分检测神经功能的改善情况,免疫组化染色观察梗死半球Brdu/CD34、Brdu/Nestin、Brdu/NSE、Brdu/vWF双阳性细胞的分布,TCC染色观察梗死体积的变化.结果:与移植前比较,移植后1,2周仅细胞移植+神经生长因子组神经功能缺损评分均明显下降(P＜0.05),移植后3,4周各组神经功能缺损评分均明显下降(P＜0.05或0.01),且细胞移植+神经生长因子组下降幅度尤为显著(P＜0.01).移植后1周,细胞移植+神经生长因子组Brdu/CD34、Brdu/Nestin、Brdu/NSE、Brdu/vWF双阳性细胞数明显多于单纯细胞移植组(P＜0.01);第4周两组未见Brdu/CD34双阳性细胞,Brdu/Nestin较1周时减少,Brdu/NSE、Brdu/vWF双阳性细胞均明显增多(P＜0.05),且细胞移植+神经生长因子组明显多于单纯细胞移植组(P＜0.01);模型对照组始终未见Brdu双阳性细胞.结论:神经生长因子对外源性移植的造血干细胞在局灶性脑梗死大鼠脑内存活、分化以及神经功能的恢复具有明显促进作用.     

神经细胞移植对大鼠脑损伤修复及行为功能的影响

目的：观察神经胶质细胞、神经元颅内移植对大鼠脑损伤修复作用及其神经行为功能的变化。 方法：实验于2005-04／11在青岛大学医学院附属医院脑血管病研究所完成。①选取出生24h清洁级Wistar大鼠2只作为供体。另选用4月龄清洁级Wistar大鼠48只，随机分为4组：正常对照组3只，模型对照组3只，神经胶质纤维酸性蛋白（G1ial fibrillary acidic protein，GFAP）移植组21只，5-溴脱氧尿嘧啶尿苷（5-bromo2’-deoxy-uridine，Brdu）移植组21只。②取供体鼠脑组织进行神经干细胞的培养，经GFAP抗体、Brdu免疫荧光标记的阳性细胞分别制成单细胞悬液待移植。③除正常对照组外，其余组均建立脑损伤模型。造模后GFAP移植组进行神经胶质细胞移植，Brdu移植组进行神经元移植，正常对照组不接受任何细胞移植。④细胞移植后观察大鼠行为变化，并进行神经行为功能评分。采用免疫荧光法检测组织片GFAP、Brdu标记阳性细胞在脑皮质区、海马齿状回及纹状体区的动态变化。 结果：实验选取清洁级4月龄Wistar大鼠48只，全部进入结果分析。①神经行为功能测试及等级评分：与模型对照组比较，GFAP移植组、Brdu移植组于移植ld无明显变化，均呈重度损伤（15-16分）；移植8d差异明显，呈中度损伤（9-10分）；移植12d差异有显著性意义（P〈0．05），呈轻度损伤（4-5分）；移植16d差异有非常显著性意义（P〈0．01），呈完成不稳定或反射缺陷（1分），接近正常对照组；移植24d呈稳定持续状态。②不同时间点各梗死区域GFAP标记阳性细胞的表达：GFAP移植组标记阳性细胞，第l天脑皮质区、海马齿状回、纹状体区的细胞表达无明显变化；第4天各区细胞表达略有增加；第16天细胞表达为最高值；第20天细胞表达呈下降趋势；第24天细胞表达为最低值。③不同时间点各梗死区域BrdU标记阳性细胞的表达：Brdu移植组标记阳性细胞，第1天脑皮质区、海马齿状回、纹状体区的纽胞表达无明显变化；第4天各区细胞表达略有增加；第16天细胞表达为最高值；第20天细胞表达呈下降趋势；第24天细胞表达为最低值。 结论：神经胶质细胞、神经元颅内移植能够促进大鼠脑损伤的修复，改善大鼠神经行为功能。     

人脐血间充质干细胞海马移植治疗大鼠血管性痴呆的实验研究

目的：探讨人脐血间充质干细胞（MSCs）海马移植对血管性痴呆（VD）模型大鼠学习记忆能力的影响及其可能机制。方法：66只SD大鼠随机分为假手术组（n=6）、模型组（n=30）和细胞移植组（n=30）;模型组及细胞移植组又分为术后3d组、7d组、14d组、30d组、60d组5个亚组各6只。假手术组仅分离颈总动脉,模型组采用两血管结扎法建立VD大鼠模型,细胞移植组在建立VD大鼠模型后于大鼠右侧海马CA1区移植经纯化、BrdU标记的人脐血MSCs。于术后第3、7、14、30、60天采用免疫组织化学染色观察大鼠脑内移植后BrdU阳性细胞的分布、存活情况及胆碱乙酰转移酶（chAT）阳性细胞数。于术后60d采用Morris水迷宫系统检测大鼠学习记忆能力。结果：移植后BrdU阳性细胞主要集中在海马及邻近区域,以术后3d组（151．0±7．9）和7d组（95．3±6．4）最多,14d组（51．6±7．2）和30d组（29．4±5．2）则进行性减少,60d组仅可见少量BrdU阳性细胞（8．7±3．2）。与模型组比较,细胞移植组各时间点海马区ChAT阳性细胞数均较多（P〈O．05）,术后60d大鼠学习记忆能力明显恢复（P〈O．05）。结论：海马移植入脐血MSCs可在VD大鼠脑内存活并向邻近区域迁移,能改善大鼠学习记忆能力,其机制可能与内外源性干细胞的增殖分化、海马微环境的改善和胆碱能神经元分化及生长有关。     

神经节苷脂联合神经干细胞移植对颅脑损伤大鼠海马的作用

背景：应用神经干细胞移植治疗脑损伤后神经功能障碍的实验研究是目前的热点。目的：观察神经节苷脂联合神经干细胞移植对创伤性脑损伤大鼠海马神经元的影响。方法：健康Wistar大鼠66只,采用改进Feeney法制作创伤性脑损伤致海马神经元损伤模型,存活的60只大鼠伤后24h给予相应治疗随机分为3组：创伤性脑损伤组注射1mL DMEM/F12培养液;神经干细胞组注射1×1010L-1神经干细胞悬液;神经干细胞＋神经节苷脂组注射1×1010L-1神经干细胞悬液后经腹腔注射30mg/kg神经节苷脂水溶液,1次/d,连续3d。结果与结论：荧光显微镜观察PKH26标记的神经干细胞呈球形,呈现均匀分布的红色荧光;PKH26标记神经干细胞的阳性率为95%。各组平均潜伏时间均逐渐缩短,神经干细胞＋神经节苷脂组3～5d时平均潜伏时间较神经干细胞组缩短（P〈0.05）,较创伤性脑损伤组明显缩短（P〈0.01）;神经干细胞＋神经节苷脂组穿越平台次数及在目标象限游泳距离与总距离百分比均高于其他两组（P〈0.05）。PKH26阳性细胞和苏木精-伊红染色切片中的神经元数量及脑源性神经营养因子mRNA的表达神经干细胞＋神经节苷脂组多于神经干细胞组,神经干细胞组多于创伤性脑损伤组（P〈0.05）。提示神经干细胞移植对创伤性脑损伤大鼠海马神经元有保护作用,联合应用神经节苷脂有协同效果。     

静脉移植脐血干细胞可抑制脑缺血大鼠的神经细胞凋亡

背景：已有实验证实脐血干细胞移植后可迁移至脑损伤区域,存活并分化为神经细胞。目的：探讨经静脉移植脐血干细胞治疗大鼠脑缺血的疗效以及对神经细胞凋亡的影响。方法：改良线栓法建立大鼠大脑中动脉闭塞再灌注模型,48只大鼠随机数字表法分成治疗组和对照组,分别在造模1d后经尾静脉注射脐血干细胞和PBS进行观察。结果与结论：治疗后3,7d两组神经功能评分比较,差异无显著性意义（P〉0.05）;14,21d治疗组神经功能评分明显低于对照组（P〈0.05）。对照组未见BrdU阳性细胞,治疗组大鼠脑组织切片中可见BrdU阳性细胞,对侧半球也可见少量BrdU阳性细胞。对照组大鼠缺血侧凋亡细胞显著多于治疗组（P〈0.05）。提示经静脉移植的脐血干细胞可迁移至大鼠缺血侧脑组织,抑制神经细胞凋亡,并显著改善大鼠神经功能。     

神经干细胞移植对192-IgG-saporin阿尔茨海默病模型鼠基底前脑神经元p75~（NGFR）阳性神经元和行为学的影响

背景：神经干细胞能够在体外持续扩增,具有较强的增殖能力和较强的可塑性,能够在成年宿主中枢神经系统中存活、迁移、分化以及与宿主组织整合较好。目的：分析神经干细胞移植对侧脑室注射192-IgG-saporin老年性阿尔茨海默病模型鼠基底前脑神经元p75NGFR阳性神经元和行为学的影响。方法：24只SD大鼠随机数字表法均分为3组：对照组、模型组、移植组。10只新生SD鼠（〈24h）用于神经干细胞分离培养。模型组及移植组192-IgG-saporin侧脑室注射SD大鼠建立阿尔茨海默病模型。造模后,移植组行基底前脑神经干细胞移植。4周后行Y迷宫检测,结合图像分析技术观察大鼠基底前脑p75NGFR阳性神经元数目和形态学参数的变化。结果与结论：注射192-IgG-saporin1个月,模型组损伤侧基底前脑内侧隔核和斜角带垂直支p75NGFR阳性神经元数明显减少（P〈0.01）,移植组分别恢复到对照组的74.85%和71.66%,与模型组损伤侧相比较,差异显著（P〈0.01）。Y迷宫测试结果显示,移植组大鼠的空间学习能力和记忆能力有改善（P〈0.05）,基底前脑p75NGFR阳性神经元细胞数与大鼠的空间学习记忆能力呈正相关。提示,神经干细胞移植对注射192-IgG-saporin致阿尔茨海默病鼠基底前脑胆碱能神经元有明显的补充和保护作用,可改善大鼠的学习记忆能力。     

骨髓间充质干细胞移植并用单唾液酸神经节苷脂治疗大鼠脑梗死

背景：神经节苷脂是目前世界公认的惟一具有修复神经损伤,重塑神经网络的特效物质。单唾液酸神经节苷脂是神经节苷脂的一种。目的：观察骨髓间充质干细胞移植并应用单唾液酸神经节苷脂治疗大鼠脑梗死的效果。方法：Wistar大鼠应用线栓法建立大脑中动脉阻塞模型后随机分为3组,建模成功6h后通过尾静脉注射浓度为1×1010L-1的骨髓间充质干细胞悬液或细胞培养液1mL,同时经腹腔注射单唾液酸神经节苷脂水溶液或生理盐水,1次/d,连续3d。静脉移植后24h,3d及伤后1、2周行Longa行为学评分,检测神经功能的损伤情况。治疗3d后用RT-PCR、WesternBlot检测脑组织中AQP4mRNA表达和蛋白合成的变化。2周后行BrdU免疫组化和苏木精-伊红染色观察移植细胞的存活和对组织的修复情况。结果与结论：移植后1,2周,大鼠神经功能障碍评分细胞移植＋单唾液酸神经节苷脂组低于细胞移植组,细胞移植组低于梗死组（P〈0.05）;移植后3d,脑梗死周围组织AQP4蛋白及其mRNA的表达梗死组高于细胞移植组,细胞移植组高于细胞移植＋单唾液酸神经节苷脂组（P〈0.05）;2周后BrdU免疫组化和苏木精-伊红染色切片中的神经元数量细胞移植＋单唾液酸神经节苷脂组多于细胞移植组,细胞移植组多于梗死组（P〈0.05）。结果提示骨髓间充质干细胞移植的同时应用神经节苷脂治疗可明显改善脑梗死大鼠的神经学功能。     

脑缺血再灌注损伤大鼠尾静脉移植脐带间充质干细胞的安全性

背景：尾静脉移植干细胞穿过血脑屏障到达宿主脑损伤区域内的具体机制尚不明确。目的：观察尾静脉移植人脐带间充质干细胞治疗脑缺血再灌注损伤大鼠的效果及安全性,并探讨其作用机制。方法：通过密度梯度离心法结合贴壁筛选法获取人脐带间充质干细胞并以BrdU标记。Sprague-Dawley大鼠以改良线栓法制作大脑中动脉缺血再灌注模型,移植A组在造模后第7天、移植B组在造模后第14天通过尾静脉移植人脐带间充质干细胞,模型组不做处理。结果与结论：①移植后7,14,28,35,42,49,56d,2个移植组mNSS评分低于模型组（P〈0.05）。移植后7,14,28,35,42,49d,移植A组mNSS评分低于B组（P〈0.05）。模型组在造模后第35天、移植A组在第42天、移植B组在第49天时mNSS评分进入平台期。②2个移植组大鼠脑组织未见到CD11b、MPO单染阳性细胞,可见Brdu＋Nestin、Brdu＋MAP-2、Brdu＋GFAP、Brdu＋FⅧ,Brdu＋VEGF双染阳性细胞。结果表明人脐带间充质干细胞经尾静脉途径移植可以在宿主脑内存活,通过生成神经元样和神经胶质样细胞、促进新生血管形成并分泌神经营养因子等因素促进大鼠神经功能恢复,且未发现明显免疫排斥反应及异常分化细胞,具有较高的安全性。     

间充质干细胞移植对大鼠脑缺血区GDNF表达的影响

目的观察骨髓间充质干细胞移植对大鼠大脑中动脉栓塞后神经功能的影响及GDNF的表达。方法采用线栓法大鼠大脑中动脉栓塞(MCAO)模型,颈内动脉移植MSCs,Bederson神经功能评分观察大鼠神经功能,免疫组织化学和原位杂交技术检测GDNF表达。结果MSCs移植可显著提高大鼠局灶性脑缺血后神经功能,缺血周边区GDNF蛋白及mRNA表达水平均高于对照组。结论MSCs移植可促进神经功能恢复,可能通过增加GDNF的表达起到脑保护作用。     

静脉移植人脂肪间充质干细胞治疗大鼠颅脑损伤

背景:动物实验及临床研究证实间充质干细胞对创伤性脑损伤具有一定的治疗作用。目的:观察脂肪间充质干细胞移植治疗急性创伤性脑损伤大鼠行为学及损伤脑组织中胶质纤维酸性蛋白、神经元特异性烯醇化酶和巢蛋白的表达。方法:以自由落体硬膜外撞击法制作SD大鼠脑损伤模型后随机分为3组:移植组于脑损伤48h时经尾静脉注射Brdu标记的成人脂肪间充质干细胞;对照组不作处理;生理盐水组于脑损伤48h时经尾静脉注射生理盐水。采用NSS评分法评价大鼠神经功能恢复情况;倒置显微镜观察脂肪间充质干细胞在损伤脑组织内的迁移情况;免疫组织化学法检测大鼠受损脑组织中胶质纤维酸性蛋白、神经元特异性烯醇化酶和巢蛋白表达。结果与结论:移植组NSS评分明显低于对照组与生理盐水组(P<0.05)。在受损伤脑组织周围可发现经Brdu标记的脂肪间充质干细胞。移植组大鼠受损脑组织中胶质纤维酸性蛋白和神经元特异性烯醇化酶阳性表达率明显低于对照组与生理盐水组(P<0.05),且下降速度较快;巢蛋白表达明显高于对照组与生理盐水组(P<0.05)。证实脂肪间充质干细胞通过血脑屏障进入受损大鼠脑组织后,以上调巢蛋白基因的表达来发挥保护神经元、促进神经发育与再生的功能。     

静脉移植人脂肪间充质干细胞治疗大鼠颅脑损伤

背景：动物实验及临床研究证实间充质干细胞对创伤性脑损伤具有一定的治疗作用。目的：观察脂肪间充质干细胞移植治疗急性创伤性脑损伤大鼠行为学及损伤脑组织中胶质纤维酸性蛋白、神经元特异性烯醇化酶和巢蛋白的表达。方法：以自由落体硬膜外撞击法制作SD大鼠脑损伤模型后随机分为3组：移植组于脑损伤48h时经尾静脉注射Brdu标记的成人脂肪间充质干细胞;对照组不作处理;生理盐水组于脑损伤48h时经尾静脉注射生理盐水。采用NSS评分法评价大鼠神经功能恢复情况;倒置显微镜观察脂肪间充质干细胞在损伤脑组织内的迁移情况;免疫组织化学法检测大鼠受损脑组织中胶质纤维酸性蛋白、神经元特异性烯醇化酶和巢蛋白表达。结果与结论：移植组NSS评分明显低于对照组与生理盐水组（P〈0.05）。在受损伤脑组织周围可发现经Brdu标记的脂肪间充质干细胞。移植组大鼠受损脑组织中胶质纤维酸性蛋白和神经元特异性烯醇化酶阳性表达率明显低于对照组与生理盐水组（P〈0.05）,且下降速度较快;巢蛋白表达明显高于对照组与生理盐水组（P〈0.05）。证实脂肪间充质干细胞通过血脑屏障进入受损大鼠脑组织后,以上调巢蛋白基因的表达来发挥保护神经元、促进神经发育与再生的功能。     

脐血干细胞移植对帕金森病大鼠旋转行为的影响

背景：目前帕金森病的临床治疗还是以药物为主,细胞移植实验也多见于骨髓间充质干细胞,脐血来源干细胞移植能否改善帕金森病的旋转行为报道较少。目的：观察脐血间充质干细胞移植对帕金森病大鼠旋转行为的影响。方法：帕金森病模型大鼠随机分成实验组和对照组。实验组大鼠纹状体内植入用Hoechst33258标记的第4代脐血间充质干细胞,对照组注射PBS。此后每周腹腔注射阿扑吗啡以观察大鼠的旋转行为;并在移植后3,6,9周用免疫荧光双标法检测间充质干细胞的存活、迁移情况以及胶质纤维酸性蛋白、神经元特异性烯醇化酶、酪氨酸羟化酶和突触素的表达。结果与结论：移植脐血间充质干细胞后大鼠的旋转行为与对照组相比有明显改善（P〈0.05）;间充质干细胞可在大鼠脑内存活,随时间延长迁移范围扩大,分布于纹状体、胼胝体和皮质;胶质纤维酸性蛋白、神经元特异性烯醇化酶、酪氨酸羟化酶都有表达,突触素无表达。结果可见移植脐血间充质干细胞后能明显改善帕金森病大鼠旋转行为,有望成为治疗帕金森病的种子细胞。     

许旺细胞修复大鼠脊髓损伤:静脉移植的可行性及优势

背景:目前细胞移植是修复脊髓损伤的研究热点之一,许旺细胞能够分泌多种神经营养因子,改善损伤局部微环境,大量相关文献证实了其能够促进脊髓损伤后功能的恢复.针对治疗脊髓损伤的细胞移植方法很多,其中静脉移植具有操作方便、能够避免传统移植方法造成的附加损伤等优点.目的:探讨许旺细胞尾静脉移植修复大鼠脊髓损伤的疗效.方法:体外分离Wistar大鼠双侧坐骨神经,植块法培养,S-100染色鉴定,Hoechst33342标记许旺细胞.Impactor model-Ⅱ打击仪制作 Wistar大鼠T10脊髓损伤模犁60只,随机分为3组,空白对照组术后未作处理,DMEM对照组、许旺细胞移植组术后1周分别尾静脉注射1 mL.DMEM或1 mL.许旺细胞.术前1 d,术后1,3 d,1周及以后每周进行BBB评分.移植后1,2,4周取材行冰冻切片观察移植许旺细胞的迁移.移植后8周取材行苏木精-伊红染色及免疫荧光染色观察损伤段胶质原纤维酸性蛋白、神经元特异性烯醇化酶的表达.结果与结论:经纯化鉴定获得纯度为95%的许旺细胞.移植后1,2,4周损伤段及邻近节段脊髓内可观察到Hoechst33342阳性细胞.术后4周,许旺细胞移植组与空白对照组、DMEM对照组BBB评分差异开始有显著性意义(P<0.05),且许旺细胞移植组高于空白对照组、DMEM对照组.苏木精-伊红染色示各组均有脊髓空洞形成,许旺细胞移植组空洞小于空白对照组、DMEM对照组.免疫组织化学染色示空白对照组、DMEM对照组胶质原纤维酸性蛋白反应较强,许旺细胞移植组胶质原纤维酸性蛋白阳性面积小于其他组(P<0.05);许旺细胞移植组神经元特异性烯醇化酶的阳性面积明显大于其他组(P<0.05).提示静脉移植许旺细胞修复大鼠脊髓损伤是可行的,操作简便,且有较好的疗效.     

感染性脑损伤中的细胞凋亡及凋亡诱导因子的表达及意义

目的:探讨凋亡在感染性脑损伤的发生发展以及caspase非依赖性途径在感染性脑损伤机制中的作用。方法:SD大鼠160只,随机分为NS组和LPS组各80只,LPS组颈内动脉注射LPS制作感染性脑损伤模型,NS组颈内动脉注射NS,2组均观察注射后6、12、24、48及72h5个时间点,检测各组不同时间点脑组织的EB含量,免疫组化检测脑组织NSE、GFAP蛋白及凋亡诱导因子(AIF)的表达,并应用脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(TUNEL)技术检测细胞凋亡数。结果:LPS组NSE、GFAP、AIF表达及细胞凋亡数均为6h开始增加,12h表达进一步增强,24h达高峰,48-72h时渐减少,但均明显高于NS组。结论:细胞凋亡参与感染性脑损伤细胞发展过程,Caspase非依赖性途径通过AIF的表达发挥重要作用。     

骨髓基质干细胞移植对脑梗死大鼠生长相关蛋白43表达的影响

背景:目前生长相关蛋白43作为构建中枢神经系统可塑性的基本物质,是研究神经生长及损伤修复的首选分子标记物.目的:通过建立大鼠局灶性脑缺血模型,观察骨髓基质干细胞移植内源性轴突再生标志物生长相关蛋白43的表达变化.设计、时间及地点:随机对照动物实验,于2006-03/2007-10在武汉大学人民医院神经科实验室和丝宝药业有限公司博士后科研工作站完成.材料:选取清洁级成年SD大鼠60只,按随机数字表法分为模型对照组、假手术组和干细胞移植组,每组20只.方法:另取2月龄SD大鼠4只用于制备骨髓基质干细胞,骨髓基质干细胞悬液用5-溴脱氧尿嘧啶核苷法标记.假手术组大鼠麻醉后分离结扎右侧颈内总动脉;其余大鼠制备右侧大脑中动脉缺血模型,造模后24 h向干细胞移植组大鼠左侧侧脑室推注20 μL5×105的骨髓基质干细胞,模型对照组推注等量磷酸盐缓冲液.主要观察指标:每组大鼠于移植前、移植后7,14,21,28 d应用免疫组织化学法检测脑梗死灶周边区生长相关蛋白43的表达和移植细胞的存活及迁移情况,并记录神经功能缺损评分.结果:培养的骨髓基质干细胞经5-溴脱氧尿嘧啶核苷标记后移植到大鼠左侧侧脑室,可迁移到梗死灶周围,移植后7 d在梗死灶能检测到5溴脱氧尿嘧啶核苷标记的阳性细胞,移植后14 d增多达高峰,移植后28 d逐渐减少并消失.免疫组织化学图像分析结果显示干细胞移植组大鼠在移植后7,14 d脑梗死灶周边区生长相关蛋白43免疫活性高于模型对照组(P<0.05).假手术组大鼠无神经损伤症状,神经功能评分均为0分;随时间的推移,模型对照组和干细胞移植组动物的神经功能评分逐渐降低,从移植后14 d开始,干细胞移植组的神经功能评分均明显低于模型对照组(P<0.05).结论:骨髓基质干细胞移植能上调局灶性脑缺血大鼠脑梗死灶周边区生长相关蛋白43的表达,与大鼠神经功能的恢复趋势相符.     

诱导骨髓基质细胞表达神经细胞标记物Nestin,NSE和GFAP:脑源性神经节苷脂定向诱导细胞分化作用的研究

目的：研究脑源性神经节苷脂诱导成年大鼠骨髓基质细胞定向分化为神经前体细胞的作用。方法：成年大鼠骨髓基质细胞传代纯化后，分别在无血清、无外源性生长因子、含2％t327的Neurobasal-A培养基及含20％胎牛血清的DMEM培养基中添加脑源性神经节苷脂作为诱导物，观察细胞的形态变化。结果：在无血清、无外源性生长因子、含2?7的Neurobasal-A培养基中，脑源性神经节苷脂能诱导骨髓基质细胞定向分化为神经前体细胞，其形态发生显著变化，胞体逐渐变小、折光性增强，突起逐渐增多、延长，部分细胞间可见突起连接、细胞核和核仁；诱导第5d免疫细胞荧光染色显示，神经前体细胞标记物Nestin染色阳性，同时部分细胞可见神经元特异性标记物NSE及星形胶质细胞标记物GFAP染色阳性，而少突胶质细胞标记物Nogo-A染色阴性。在含20％胎牛血清的DMEM（高糖）培养基中，脑源性神经节苷脂的这种诱导、分化作用明显被抑制，表现为细胞形态变化不明显，Nestin、NSE及GFAP染色均为阴性。两组对照组细胞形态无变化、上述染色均为阴性。结论：脑源性神经节苷脂具有诱导骨髓基质细胞成为神经前体细胞的作用，这种作用不需要外源性生长因子存在，血清可抑制这种作用，脑源性神经节苷脂在成体干细胞可塑性研究中有重要价值。     

骨髓间充质干细胞定向移植局灶性脑缺血大鼠的行为学变化

背景:骨髓间充质干细胞移植已经应用到神经损伤修复领域,脑内立体定位移植和经血管移植均为其移植途径.目的:经立体定位将骨髓间充质干细胞注入大鼠脑梗死灶周边区,通过前肢不对称应用试验及姿势反射试验观察大鼠神经功能障碍的改善情况. 设计:随机对照动物实验.单位:吉林大学第一医院神经内科.材料:实验于2006-10/2007-04在吉林大学人兽共患病研究所,人兽共患病教育部重点实验室进行.健康雄性Wistar大鼠由吉林大学实验动物中心提供,体质量250～280 g,清洁级,实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准.方法:采用密度梯度分离法、贴壁筛选法体外培养扩增健康成人志愿者骨髓间充质干细胞,采用流式细胞仪鉴定其免疫表型.将Wistar大鼠随机分为正常对照组、假手术组、模型组、模型 无血清DMEM组、模型 骨髓间充质干细胞组,每组10只.采用Longa等改良线栓法制备大鼠右侧大脑中动脉闭塞脑缺血再灌注模型,正常对照组无任何处理,假手术组手术操作至暴露颈内外动脉后即缝合,其余处理同模型组.骨髓间充质干细胞立体定向移植:缺血90 min再灌注后1 h,采用立体定位仪取大鼠右侧大脑缺血周边区为移植点:前囟旁开3 mm、尾侧1 mm、深4 mm.缓慢注入5 μL经BrdU标记的骨髓间充质干细胞(4×1011 L-1)无血清培养基悬液于模型 骨髓间充质干细胞组大鼠,模型 无血清DMEM组大鼠注射5 μL无血清培养基,注射后留针5 min,缓慢退针,防止液体随针道返流.采用免疫组化技术检测骨髓间充质干细胞在大鼠体内存活情况,并于移植后1,3,7,28 d采用前肢不对称应用试验及姿势反射试验观察大鼠行为学变化.主要观察指标:①以流式细胞仪鉴定骨髓间充质干细胞免疫表型.②移植大鼠脑内骨髓间充质干细胞的存活情况.③大鼠行为学变化.结果:50只大鼠全部进入结果分析.①实验获得了高纯度的骨髓间充质干细胞,流式细胞仪检测显示,CD44、CD29均呈阳性,CD34、CD45、CD31均呈阴性.②模型 骨髓间充质干细胞组移植的骨髓间充质干细胞在脑缺血周边区聚集并存活.③模型 骨髓间充质干细胞组大鼠行为学评分较其他各组降低明显 (P < 0.05),并随着细胞移植后时间延长逐渐降低,并且移植后7 d行为学评分低于同组内其他时间点(P < 0.01).结论:除正常对照组外,其他组大鼠神经功能均有所恢复,但各组恢复情况明显不同,脑梗死周边区域注射骨髓间充质干细胞组大鼠功能恢复明显好于各对照组.