热休克蛋白65及其融合蛋白Hsp65-6×P277的分离纯化和稳定性研究

来源于牛分枝杆菌的热休克蛋白65（Hsp65）在没有佐剂的情况下可作为载体分子将抗原表位递呈给免疫系统。热休克蛋白具有蛋白酶的催化活性，容易发生自溶而降解，这制约了基于Hsp65疫苗的研究。该研究中，建立了纯化Hsp65及其融合蛋白Hsp65-6×P277（P277为来源于人热休克蛋白60的肽段，线性重复6次）的方法。Hsp65与Hsp65—6×P277以可溶形式表达于大肠杆菌。在低温及添加EDTA的条件下经细胞裂解、硫酸铵沉淀及阴离子交换树脂等纯化方法，可得到电泳纯的目的蛋白。用纯化的融合蛋白Hsp65-6×P277免疫小鼠，可激发机体产生强烈的免疫应答，该融合蛋白有希望作为免佐剂的糖尿病疫苗加以进一步研究开发。     

鼻粘膜免疫融合蛋白Hsp65-6×p277预防NOD小鼠1型糖尿病的发生

目的提高多肽p277的免疫原性,从而提高其对自身免疫性糖尿病的预防作用.方法将p277 6次重复与Hsp 65融合置于pET28a中构建重组Hsp 65-6×p277表达质粒.该重组质粒在大肠杆菌BL21中以高效可溶形式表达.依次通过细胞裂解、硫酸铵沉淀、双蒸水透析、DEAE纤维素52柱层析纯化获得目的蛋白.用纯化后的融合蛋白Hsp 65-6×p277通过鼻腔给药方式,在不添加任何佐剂的情况下3次免疫4周龄雌性NOD小鼠.每月眼角取血,检测抗体和血糖浓度.结果初步药效学实验表明融合蛋白Hsp 65-6×p277可抑制NOD小鼠中1型糖尿病的发生.结论融合蛋白Hsp 65-6×p277有可能发展成为一种具有防治胰岛素依赖性糖尿病作用的疫苗.     

融合蛋白HSP65-6×P277在NOD鼠中降糖作用的机制研究

目的：探讨融合蛋白HSP65-6×P277在NOD鼠中的降糖作用机制。方法：融合蛋白HSP65-6×P277通过鼻腔给药方式,在不添加任何佐剂的情况下3次免疫4周龄雌性NOD小鼠。观察该融合蛋白对NOD小鼠血糖,细胞因子水平,抗体类型和胰腺炎严重程度的影响。结果：融合蛋白HSP65-6×P277免疫组动物血清中含有高水平的IL-4和低水平的IL-2 ,P277特异性抗体类型主要为IgGl和IgG2b,IgG2a水平较低;T细胞增殖实验的培养上清中含有较高水平的IL-10和较低水平的IFN-γ;胰腺炎的严重程度和1型糖尿病的发病率显著降低。结论：诱导了Th2免疫反应可能是HSP65-6×P277预防1型糖尿病发生的作用机制之一。     

Hsp90抑制剂的研究进展

热休克蛋白90（heat shock protein 90,Hsp90）是热休克蛋白家族中重要的蛋白之一,参与调控,维持细胞内多种蛋白的构象和功能,在调节细胞的生长、分化和凋亡等方面发挥重要的作用。热休克蛋白90抑制剂是一类能与Hsp90调节位点结合,引起Hsp90构象改变干扰其执行分子伴侣的功能,阻碍蛋白质翻译后的加工修饰,使功能蛋白丧失相应的功能甚至诱导底物蛋白降解而发挥药理作用以Hsp90为作用靶点的化合物。近年来的研究表明,很多癌基因蛋白均为Hsp90的客户蛋白,在肿瘤的发生进展方面发挥至关重要的作用,因此,通过抑制Hsp90的功能,间接干扰Hsp90客户蛋白的功能甚至促进癌基因蛋白的降解可以有效的抑制肿瘤的进展。该文主要对Hsp90抑制剂的研究进展做一综述。     

细胞因子基因佐剂对抗结核杆菌热休克蛋白65的DNA接种的影响

DNA疫苗能诱导体液免疫和强烈的细胞免疫。细胞因子似在效应T细胞亚群产生及确定对DNA疫苗的应答程度中起关键作用。作者以结核杆菌热休克蛋白65(Hsp65)作为模型抗原，比较了几种不同的Th1型细胞因子基因作为DNA疫苗佐剂的效果。     

人源热休克蛋白HSC70与HPV16型E7融合蛋白在大肠杆菌中的表达、纯化和活性检测

目的 克隆人热休克蛋白HSC70的N端具有ATPase活性的结构域(简称为A基因)与HPV 16型E7的融合基因,在大肠杆菌中表达,并纯化获得有生物活性的AE7融合蛋白.方法 利用PCR方法扩增获得A基因片段,插入原核表达载体pET29b中,再通过PCR方法扩增HPV 16型E7基因片段,插入A基因的3′端,构建原核表达质粒pET29b-AE7,并转化大肠杆菌BL21(DE3),表达产物经离子交换层析和金属螯合层析纯化后,在一定的剂量下皮下免疫小鼠,检测对HPV-16的E7基因感染的预防及治疗作用.结果 重组质粒pET29b-AE7经DNA序列测定确认.SDS-PAGE检测,表达产物分子量为66kD,大部分为包涵体.纯化后产物经SDS-PAGE电泳分析纯度>90%.纯化产物AE7在一定的剂量下皮下免疫小鼠,对HPV-16的E7基因的感染有预防及治疗作用.结论 AE7融合蛋白的获得为进一步临床研究奠定基础.     

以热休克蛋白90为靶点的抗肿瘤药物研究进展

热休克蛋白90(Hsp90)是ATP依赖性的分子伴侣,参与客户蛋白(client protein)激活并促进其成熟,维持细胞多种蛋白的构象和功能,与细胞的增殖、凋亡、癌变和肿瘤发展密切相关,是很有希望的抗肿瘤药物的作用靶点之一。目前已有多个抗肿瘤Hsp90抑制剂进入Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ 期临床试验。该文综述以Hsp90为靶点的抗肿瘤药物研究进展。     

热休克蛋白70及其抑制剂的研究进展

热休克蛋白70（heat shock protein 70,Hsp70）是一种在应激条件下诱导表达的伴侣蛋白,能帮助细胞内新生蛋白折叠,蛋白细胞内运输、蛋白装配和降解,并能在应激状态下维持蛋白质构象。研究表明,Hsp70与许多疾病有关,如癌症、神经退行性疾病、异源移植的排斥、感染等,有望成为新的药物作用靶点。本文综述了Hsp70的结构、家族成员、协同伴侣（co-chaperones）成员及其功能研究进展,并介绍Hsp70抑制剂的研究现况。     

以热休克蛋白90为靶点的抗肿瘤药研究进展

热休克蛋白90作为分子伴侣在调节细胞生长、分化、凋亡等方面发挥重要的作用,逐渐成为肿瘤治疗的重要靶点。许多Hsp90抑制荆作用于Hsp90N-端ATP结合域,此外Hsp90还有许多易被攻击的位点,如本文所阐述的作用于Hsp90-端的抑制剂及翻译后Hsp90修饰的抑制剂。     

重组蛋白HSP65-6×(IA2-P2)-His的构建、表达及分离纯化

目的构建HSP65-6×(IA2-P2)-His表达载体并研究其在大肠杆菌中的表达及分离纯化。方法通过酶切酶连的方法将6×(IA2-P2)-His替换pET-28a-HSP65-6×P277中的6×P277,构建好的载体经DNA测序分析构建成功。乳糖诱导表达的蛋白经Ni+柱分离纯化。最后用SDS-PAGE及Western blot鉴定目的蛋白。结果 HSP65-6×(IA2-P2)-His最高表达量占菌体总蛋白的65%,超声破碎后蛋白以可溶性的形式存在于裂解上清中。Ni+柱纯化后蛋白纯度可达80%电泳纯以上。最后West-ern blot鉴定目的蛋白具有抗原性和His标签。结论重组载体pET-28a-HSP65-6×(IA2-P2)-His成功转入BL21中,以可溶性的形式高效表达,该工作为进一步验证融合蛋白的生物学活性奠定了一定的基础。     

尼莫地平对大鼠血肿周围组织热休克蛋白表达的影响

目的研究热休克蛋白（Hsp 70）在脑出血(ICH)后的血肿周围脑组织的表达，及应用尼莫地平对其表达的影响，探讨尼莫地平对血肿周围缺血脑组织的保护作用。方法120只SD雄性大鼠随机分为3组: 假手术组（n＝20）、ICH治疗组（n＝50）和ICH模型组（n＝50）。按术后6，24，48，72 h和5 d分为5个亚组。采用自体股动脉取血并向大鼠尾壳核注射方法复制脑出血模型，假手术组仅进针入尾壳核不注血，ICH模型组及 ICH治疗组于尾壳核处注自体动脉血50 μL。ICH治疗组于造模即刻腹腔内注射尼莫地平（1.6 mg·kg 1）一次，此后每天1次；ICH模型组注入等量0.9%氯化钠溶液。于造模动物醒后由“盲”合作者根据Bederson法进行神经缺陷评分，评分≥2分入选实验。假手术组全部入选。入组实验动物按以上5个时间点腹腔注射10%水合氯醛0.5 mL·（100 g） 1，0.9%氯化钠溶液200 mL心脏灌流后迅速断头取脑，经尾壳核行冠状切片，分别行脑含水量的测定及免疫组化测定Hsp 70表达。结果①脑含水量：ICH模型组脑组织的含水量6 h变化不明显，于24 h开始升高，48～72 h逐渐达高峰，之后逐渐下降；ICH治疗组脑组织含水量的动态变化与ICH模型组一致，但各时间点的值均较低（P＜0.05）；两组与假手术组比较差异有显著性（P＜0.05）。②血肿周围组织Hsp 70表达：脑出血后6 h可见Hsp 70阳性细胞表达，24～48 h达高峰，之后缓慢下降，至5 d仍保持较高水平未见消失；给予尼莫地平后表达增加，ICH治疗组与ICH模型组差异有极显著性（P＜0.01），ICH模型组及ICH治疗组与假手术组比较差异有极显著性（P＜ 0.01）。结论脑出血后Hsp 70表达升高，提示其与脑出血血肿周围组织损伤有一定关系。尼莫地平诱导Hsp 70表达增强，减轻ICH后血肿周围组织的细胞凋亡程度，对神经细胞起到保护作用。 尼莫地平降低血肿周围组织脑含水量，具有减轻ICH后脑水肿作用。     

加热对肿瘤细胞热休克蛋白70产生的影响及意义

目的探讨加热对肿瘤细胞热休克蛋白70产生的影响,为热疗治疗肿瘤提供理论依据。方法对体外培养的人肝癌细胞SMMC-7721进行加热,42℃,2h,用超声细胞破碎仪破碎已经加热的SMMC-7721细胞,高速离心,用SDS-PAGE和Western blot方法对上清中HSP70的表达进行鉴定。结果加热42℃,2h的肝癌细胞热休克蛋白70（heat shock protein 70,HSP70）有较高表达。结论经加热42℃,2h的肝癌细胞热休克蛋白70（HSP70）有较高表达,为热疗治疗肿瘤提供了实验数据。     

热休克蛋白27在食管上皮癌变过程中的表达及其意义

目的 了解热休克蛋白27(HSP27)在食管鳞癌、癌旁组织和切缘正常食管黏膜中的表达,分析其表达差异,并探讨其与食管癌发生发展的关系.方法 应用免疫组化Envision二步法,观察HSP27在食管鳞癌、癌旁组织和切缘正常食管黏膜中的表达,并比较其间是否存在差异.结果 食管鳞癌、癌旁组织和切缘正常食管黏膜中HSP27的阳性表达率分别为73.3％、53.5％和25.3％;HSP27在食管鳞癌中的阳性表达率高于在癌旁组织(P＜0.05),在癌旁组织中的阳性表达率高于在切缘正常食管黏膜(P ＜0.001).随着食管鳞癌高、中、低分化程度的不同,HSP27的阳性表达率逐渐降低,但差异无统计学意义(P＞0.05).结论 HSP27可能与食管鳞癌的发生发展有关.     

Geranylgeranylacetone protects rat and striatum neurons against heat injury via induction of Hsp70

GGA (geranylgeranylacetone) may induce Hsp70 synthesis, thus contributing to the protective effects of GGA in several disease states. This study evaluated the protective effects of GGA against heat injury to rat and striatum neurons in terms of mechanisms. Rats were exposed to 41.5 °C for 35 min to induce heatstroke; the protective effects of GGA were then evaluated by change in rectal temperature (Tre) during heat exposure and survival time after heatstroke. Primary cultured striatum neurons were incubated with GGA for 24 h, and then heat-treated at 43 °C for a further 1 h. The viability, membrane surface ultrastructure and Hsp70 expression of striatum neurons were all observed. Furthermore, the effects of quercetin an inhibitor of Hsp70 synthesis were also investigated. Compared to the heatstroke group, GGA delayed Tre in reaching 42.1 °C (P < 0.05) and prolonged the survival time after heatstroke (P < 0.01). The LDH releasing percentage decreased in GGA groups (P < 0.05, P < 0.01) compared to the heat-treatment group and increased in quercetin groups (P < 0.05) compared to GGA group. Results from AFM showed that GGA protected membrane surface ultrastructure against heat injury. In addition, results from Western blot showed that GGA-induced Hsp70 expression of neurons both in normal and heat-treatment conditions (P < 0.01, P < 0.05) and quercetin inhibited GGA-induced Hsp70 expression (P < 0.05). Therefore, GGA had protective effects against heat injury in striatum neurons and rat heatstroke. Quercetin inhibited GGA-induced Hsp70 expression and prevented GGA-protective effects, which indicated that this protection was dependent on the Hsp70 synthesis.     

糖尿病与非糖尿病急性创伤病人热休克蛋白72不同表达对预后的影响

目的 研究急性创伤病人应激早期各时段糖尿病组和非糖尿病组中性粒细胞中热休克蛋白72（HSP72）编码基因的表达,以探讨热休克蛋白72不同表达对于两组病人预后的影响以及其他相关因素。方法随机选取收入ICU的A—PACHEⅢ评分≥18分的病人38例,分为糖尿病组和非糖尿病组,分离创伤后0～1天、2～6天、7～14天的中性粒细胞,RT—PCR方法检测HSP72m RNA含量,比较各组间的变化,记录病人2个月存活率。研究HSP72增高与预后的关系。结果HSP72在急性应激后表达明显增强,表达高峰在2～6天,非糖尿病人组较糖尿病组,HSP72的表述水平明显增高,且存活率较高。结论HSP72的基因水平检测可以作为判断重症病人预后的客观指标。     

热休克蛋白73在中毒性急性肾小管坏死动物模型中的表达及其意义

目的 观察热休克蛋白73(HSP73)在庆大霉素(GM)诱发的中毒性急性肾小管坏死动物模型中的表达并探讨其意义。方法 给成年Wistar大鼠皮下注射(GM400mg/kg·day)2d,对照组用生理盐水。在首次注射GM后不同时相点,观察尿量(UV)、尿蛋白(UP)、血肌苷(Cr)、血尿素氮(BUN)、肌苷清除率(CCr)、及钠排泄分数(FENa),同时,用免疫组织化学方法检测紧组织中HSP73的分布及强度。结果 在使用GM后,UV、UP、Gr、BUN和 FENa增加,但 CCr降低。HSP73从胞核弥散至胞浆中,并以颗粒的形式积聚于近曲小管上皮细胞中。这些颗粒于首次注射GM后12h出现,表达增强直至第2d,第5d已减少,但第8d时又增强,第11d完全消失。结论(1)HSPs可作为急性肾中毒损伤的最早标志之一。(2)HSPs可能发挥细胞保护作用。     

HSP70单克隆抗体诱导宫颈癌细胞凋亡的实验研究

目的:体外培养宫颈癌细胞株,免疫化学方法检测阻断HSP70前后的表达;方法:TUNEL技术观察不同浓度热休克蛋白70单抗对细胞生长的影响.探讨热休克蛋白70(HSP70)单抗对宫颈癌HeLa细胞凋亡的诱导作用;结果:经不同浓度热休克蛋白70单抗后,免疫化学方法检测HSP70的表达显著受到抑制.TUNEL技术检测出细胞凋亡;结论:表明热休克蛋白70单克隆抗体明显诱导宫颈癌细胞调亡.     

De Novo Design,Synthesis, and Mechanistic Evaluation of Short Peptides That Mimic Heat Shock Protein 27 Activity

We report the first small molecule peptides based on the N-terminal sequence of heat shock protein 27 (Hsp27, gene HSPB1) that demonstrates chaperone-like activity. The peptide, comprising the SWDPF sequence located at Hsp27’s amino (N)-terminal domain, directly regulates protein aggregation events, maintaining the disaggregated state of the model protein, citrate synthase. While traditional inhibitors of protein aggregation act via regulation of a protein that facilitates aggregation or disaggregation, our molecules are the first small peptides between 5 and 8 amino acids in length that are based on the N-terminus of Hsp27 and directly control protein aggregation. The presented strategy showcases a new approach for developing small peptides that control protein aggregation in proteins with high aggregate levels, making them a useful approach in developing new drugs.