H-Y抗体对小鼠胚胎H-Y抗原表达的研究

BALB/C雄性小鼠脾细胞悬液腹腔注射免疫同系母鼠 ,精子细胞毒性试验筛选抗血清 ,效价高的抗血清分别用于胚胎培养的毒性试验和制备单克隆抗体再辅以间接免疫荧光和PCR对胚胎进行性别鉴别。结果表明 ,直接用H Y抗血清培养的胚胎 ,胚胎退化率达 43 3 % ,与自然性比差异不显著 ;PCR验证间接免疫荧光法鉴定的胚胎性别 ,雄性胚胎准确率为 83 % ,雌性胚胎准确率为 94%。     

H-Y抗血清的制备及检测研究

选用８ ～１２ 周龄纯系的 Ｂ Ａ Ｌ Ｂ／ Ｃ 母鼠, 用同日龄的 Ｂ Ａ Ｌ Ｂ／ Ｃ 公鼠采取皮肤移植和脾细胞注射２ 种方式免疫, 制备 Ｈ Ｙ 抗血清, 经精子微量细胞毒性试验, 筛选抗血清。皮肤移植５ 只小鼠中只有１ 只产生较好的抗血清, 脾细胞注射的４ 只小鼠都能产生较好的抗血清, 产生抗血清的小鼠占５５ ％ 。抗血清与昆明鼠正常８ｃｅｌｌ 早期桑椹胚培养５ ～６ 、１８ 和２４ ｈ 后, 退化率达４３３ ％ , 经 Ｘ２ 检验差异不显著（ Ｐ ＞ ００５） , 符合自然性比例。     

H-Y单抗检测方法初探

优化间接ELISA条件 ,提高灵敏度 ,建立检测H Y抗体的检测方法。利用BALB/c公鼠免疫同系母鼠 ,制备H Y单抗。PCR验证间接免疫荧光法鉴定胚胎性别准确率。结果表明 :鉴定雄性胚胎的准确率为 83% ( 1 5 / 1 8)。鉴定雌性胚胎的准确率为 94 % ( 1 5 / 1 6)。     

对虾白斑综合征病毒单抗介导间接ELISA的建立

从白斑综合征病毒（WSSV）青岛株感染的克氏原螯虾（Canbarus proclarkii）中提纯病毒，用纯化病毒免疫BALB／c小鼠，采用细胞融合法获得4株阳性杂交瘤细胞，分别命名为1B1、1E4、4E6和4E5。4株单抗均为IgM。4E5株单抗在免疫转印中与37500左右的病毒蛋白条带呈阳性反应。用此株单抗作一抗，建立检测病毒蛋白的间接ELISA。该方法用于人工感染WSSV的螯虾组织样品中病毒的检测，48h后即有阳性检出，而正常螯虾组织均呈阴性。     

单抗捕获ELISA检测PRRSV抗体的方法的建立

以国内刚刚研制出的ＰＲＲＳＶ单克隆抗体为基础，建立了检测ＰＲＲＳ病毒抗体的单克隆抗体辅获抗原的ＥＬＩＳＡ法，其单抗包被浓度为１．１６μｇ／ｍＬ，粗提病毒反应浓度为１６．５０μｇ／ｍＬ，血清稀释度为１：４０。经与中和试验以及进口ＥＬＩＳＡ试剂盒比较，证明该法敏感性高，特异性良好，是一种有应用前景的方法。     

氨基脲单克隆抗体制备及其ELISA检测方法的建立

以氨基脲(SEM)和对醛基苯甲酸(CP)为原料合成半抗原(CP-SEM),将半抗原和载体蛋白偶联后免疫Balb/C小鼠,应用杂交瘤技术建立稳定分泌抗氨基脲的杂交瘤细胞株。常规制备腹水,用辛酸-硫酸铵法纯化,并对纯化的mAb进行特异性鉴定。通过对不同抗体组合的分析和条件的优化,建立检测氨基脲的间接竞争ELISA方法。利用对醛基苯甲酸衍生草鱼肌肉提取的氨基脲,用建立的ELISA方法进行检测,并计算回收率和最低检测限。经细胞融合、筛选及克隆化,共获得7株稳定分泌抗氨基脲的杂交瘤细胞株,其中4株亲和力较高。建立了间接竞争ELISA检测方法,该方法灵敏度达到0.1ng/mL,平均回收率为98.47%,在草鱼组织中的最低检测限为0.76ng/g,回收率为70.55-100.56%,可用于肌肉中氨基脲残留的检测。     

犬瘟热病毒单克隆抗体夹心ELISA检测方法的建立

为建立方便快捷的犬瘟热病毒(CDV)检测方法,本实验应用杂交瘤细胞融合技术,建立了4株分泌抗CDV单克隆抗体(MAb)的杂交瘤细胞株,分别命名为A2、F7、H4和G12.相加ELISA试验显示4株MAb作用于CDV不同的抗原表位.选取相加指数较高的两株MAb G12和A2分别作为捕获抗体和酶标检测抗体,建立检测CDV的夹心ELISA检测方法,并对实验条件进行了优化.结果显示,该方法与犬细小病毒、犬副流感病毒、犬腺病毒1型、犬冠状病毒等犬类病毒无交叉反应,敏感度为5 μg/mL,变异系数小于6％.利用该方法与RT-PCR方法同时检测57份临床样品,两种方法的符合率为100％.本实验建立的MAb夹心ELISA方法具有特异、敏感、方便快捷等优点,适用于大批量临床样品检测.     

应用单克隆抗体ELISA阻断试验快速检测兔出血症病毒抗体的研究

利用抗兔出血症病毒(RHDV)的特异性单克隆抗体(McAb)建立了ELISA阻断试验用以检测血清抗体,并与血凝抑制(HI)和琼脂扩散试验(ID)进行了比较。结果ELISA阻断试验敏感性超过HI,更远胜于ID,具有灵敏、特异、准确等优点,适于大批血清样品的快速检测。     

莱克多巴胺单克隆抗体间接竞争ELISA检测方法的建立

用混合酸酐法将莱克多巴胺(Rac)与匙孔蓝蛋白(KLH)、牛血清白蛋白(BSA)偶联,经紫外光谱扫描确定偶联成功,测得偶联物Rac-KLH浓度为3.6 mg/mL,Rac-BSA浓度为6.2 mg/mL。以偶联物Rac-KLH作为免疫原,免疫6～8周龄雌性BALB/c小鼠,取小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞SP2/O-Ag-14进行融合。以Rac-BSA作为包被抗原,经间接ELISA筛选出阳性细胞株,再用有限稀释法进行多次亚克隆,获得稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株1D9、1F3、2C11、5C3、3A10、4A8、6B7、6D5、7C11、7D3。其中单克隆抗体5C3和3A10间接ELISA效价1∶500 000,对莱克多巴胺的半数阻断浓度(IC50)均为3.98 ng/mL,对盐酸克伦特罗和沙丁醇胺的IC50均大于2 000 ng/mL;对盐酸克伦特罗和沙丁醇胺的交叉反应率均小于0.2%。间接竞争ELISA检测莱克多巴胺在0.5～100 ng/mL范围内为线性分布,确定的最低检测限为0.5 ng/mL。     

检测流感病毒H5亚型抗体竞争ELISA方法的建立及初步应用

本研究采用灭活的H5亚型禽流感纯化病毒包被ELISA反应板,以辣根过氧化物酶标记的HA蛋白单克隆抗体作为竞争检测抗体,建立了检测H5亚型流感病毒抗体的竞争ELISA(C-ELISA)方法.实验结果表明:抗原最佳包被浓度为8.27ug/mL(1:800),酶标抗体最佳稀释倍数为1:800,待检血清最佳稀释倍数为1:10.对已知阳性样品的检测结果表明,本研究中所建立的竞争ELISA方法的敏感性高于经典的血凝抑制方法(HI).特异性试验表明该ELISA方法仅能检测H5亚型流感病毒抗体,具有良好的特异性.对临床样品检测表明C-ELISA与HI 方法的符合率达到93%以上.该方法可以对不同种属动物血清H5亚型流感病毒抗体进行快速定量的检测,为H5亚型流感病毒流行病学调查与抗体的检测提供了一种快速、方便、敏感的方法.     

褪黑素单克隆抗体的制备

褪黑素（MT）广泛存在于哺乳动物体内,是一种常见的吲哚类物质,可起到清除自由基、调节免疫、调节神经等作用。本文使用褪黑素-OVA作为免疫原,免疫5 只BALB/c小鼠,5 次免疫后采血检测,通过间接ELISA方法确定抗血清针对褪黑素-OVA的滴度。经ELISA筛选,最终获得5 株可稳定表达褪黑素抗体的单克隆细胞株（3G3B2、3G3C7、3G3D1、3G3F4、3G3G3）。纯化后抗体浓度为0.28 mg/mL,经测定,褪黑素单克隆抗体滴度可达1∶64 000,为进一步开发褪黑素的快速检测方法奠定了材料基础。     

抗奶牛衣原体单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立

将奶牛衣原体抗原免疫的 Ｂ Ａ Ｌ Ｂ／ｃ 小鼠脾细胞与 Ｓ Ｐ２／ Ｏ 细胞在聚乙二醇作用下融合, 用间接 Ｅ Ｌ Ｉ Ｓ Ａ 试验筛选, 以有限稀释法克隆３ 次, 得到６ 株分泌抗奶牛衣原体单克隆抗体（ Ｍｃ Ａｂ） , 选择抗体分泌较高的 Ｇ２ 、 Ｆ２３ 、 Ａ 株进行详细的研究, 结果表明, 其核内染色体数为９０３５ 、９２１４ 、９４４２ ; 抗体属性为 Ｉｇ Ｇ２ａ 、 Ｉｇ Ｇ１ 、 Ｉｇ Ｍ, 用交叉 Ｅ Ｌ Ｉ Ｓ Ａ 法对３ 株 Ｍｃ Ａｂ 作特异性分析, 该 Ｍｃ Ａｂ 只与奶牛衣原体抗原, 猪衣原体抗原、羊衣原体抗原发生反应,而不与沙眼衣原体抗原、伪狂犬病抗原、布鲁氏杆菌抗原发生反应。     

相思子毒素-a双抗体夹心ELISA法的建立和初步应用

以已制备的抗相思子毒素-a(abrin-a)的单克隆抗体(McAb)4G1和兔源多抗建立了abrin-a双抗体夹心ELISA法。abrin-a质量浓度在15.62~250.00μg/L的范围内,质量浓度的对数值与其D450值呈直线相关,回归方程为y=1.0467x+0.5277(R2=0.9992,n=5),检测灵敏度为7.81ng/mL。该法与相思子凝集素、蓖麻毒素(ri-cin)和蓖麻凝集素无交叉反应。经初步用于人工污染abrin-a香肠样品和自来水样品检测,回收率分别为92.0%和85.0%,变异系数(CV)<6%。表明该检测方法具有快速、特异、灵敏等特点,可望用于食品、饲料和饮用水中abrin-a检验。     

血清学检测的雄性特异性抗原Fab抗体的特异性鉴定

旨在研究血清学检测的雄性特异性抗原噬菌体Fab抗体的特异性。以从噬菌体Fab抗体库中筛选到具有较高雄性特异性结合活性的重组噬菌体克隆为基础,构建Fab抗体的可溶性表达噬质粒,并诱导和纯化该抗体片段,利用免疫荧光FITC/DAPI共染技术和ELISA分析其特异性。结果表明,该抗体在约49 ku处有条带出现。在Fab抗体和H-Y抗血清的细胞免疫荧光比较分析试验中发现,从雌、雄鼠脾细胞的阳性细胞数量和平均荧光强度的角度分析,Fab抗体的雄性特异性强于抗血清。石蜡切片免疫荧光定量分析显示,Fab抗体与雄鼠肝脏的结合活性明显高于对应雌鼠,差异极显著(t=20.73,P=0.002 3<0.01),而H-Y抗血清与雄鼠肝脏的结合活性略高于对应雌鼠,差异显著(t=7.11,P=0.019 2<0.05)。以C57BL/6雄鼠脾细胞、睾丸细胞作为抗原的ELISA分析显示,Fab抗体具有雄性特异性,但Fab抗体的OD值低于抗血清。结果提示,Fab抗体的雄性特异性高于H-Y抗血清,但其雄性特异性结合活性低于H-Y抗血清,Fab抗体在具备雄性特异性的同时,仍有少量雌性非特异性结合,Fab抗体的体外亲和力成熟可作为后续研究工作,以获...     

阪崎肠杆菌单克隆抗体制备及ELISA检测方法的建立

试验旨在制备抗阪崎肠杆菌的单克隆抗体,初步建立其ELISA检测方法。以灭活的阪崎肠杆菌全菌体为抗原免疫BALB/c小鼠,筛选血清效价高的小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行细胞融合,制备杂交瘤细胞,并用间接ELISA法选取阳性杂交瘤细胞,扩大培养后测定单克隆抗体的效价,进行特异性及抗体间的配对,使用mAb亚类检测试剂盒鉴定单克隆抗体的亚型,并利用得到的抗体建立双抗体夹心ELISA检测方法。本试验得到3株具有良好特异性能稳定分泌单克隆抗体的阳性细胞株5C10、2B6和Ab02,经两两配对,据阳性D_{450 nm}值及P/N值选择1：20000稀释的5C10作为包被抗体,1：40000稀释的Ab02作为酶标二抗,建立ELISA检测法,应用建立的方法与荧光定量PCR方法检测动物实验室保存的20份进出口送检奶粉样品,结果显示试验结果一致。本试验成功制备阪崎肠杆菌的单克隆抗体并建立其ELISA检测法,为大批量快速检测阪崎杆菌奠定了基础。     

应用单克隆抗体酶联免疫斑点试验检测抗传染性喉气管炎抗体

本文提出以硝酸纤维膜作为固相载体,辣根过氧化物酶标记的抗传染性喉气管炎病毒（ＩＬＴＶ）的单克隆抗体（ＭｃＡｂ）,邻苯二胺为底物,检测ＩＬＴＶ抗体的免疫斑点试验方法（Ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ）。该方法较常规方法敏感,特异、省时。该方法的建立为鸡群疫病监测,免疫鸡群抗体水平的检测提供了新的可靠方法。     

单克隆抗体捕获ELISA检测鸡多杀性巴氏杆菌IgM抗体

应用抗鸡ＩｇＭ单克隆抗体建立了检测鸡抗多杀性巴氏杆菌（Ｐ．ｍ．）血清中特异性ＩｇＭ抗体的单克隆抗体捕获ＥＬＩＳＡ,其敏感性、特异性、重复性优于间接ＥＬＩＳＡ。用于检测鸡抗Ｐ．ｍ．的特异性ＩｇＭ抗体发现：鸡在注射免疫Ｐ．ｍ．灭活苗后第４天即可检测到ＩｇＭ抗体,并且上升较快,峰值在第２周为１：５１２０;鸡在口服免疫Ｐ．ｍ．弱毒活苗后ＩｇＭ抗体上升缓慢,峰值在第４周左右,滴度较低为１：３２０;鸡在由不同途径感染不同的Ｐ．ｍ．强毒后第８天时,ＩｇＭ抗体滴度都明显上升。同时应用间接ＥＬＩＳＡ检测ＩｇＧ抗体滴度进行比较。本项研究对建立检测鸡抗其它病原微生物特异性ＩｇＭ抗体方法具有借鉴意义。     

鸡新城疫酶联免疫诊断试剂盒的研制

将ＥＬＩＳＡ检测鸡新城疫病毒特异性ＩｇＭ抗体的方法试剂盒化，确定其外包装材料、规格、盒内组成，并对酶标板的包被、质量控制、保存期，酶标抗鸡ＩｇＭ（μ链）单克隆抗体的冻干、保存，组盒后的ＥＬＩＳＡ诊断试剂盒的特异性、敏感性、符合率、可重复性、保存期等作了详细的研究。先后制备试剂盒１８个批次，用于全国９个省的２９个大型鸡场或兽医诊断站，检测血样３６２８份，其中阳性２９５９份。