快速选育抗黄瓜花叶病毒的转基因烟草纯合品系

以来源于烟草推广品种ＮＣ８９花药的单倍体苗为转化受体，同时导入了黄瓜花叶病毒（ＣＭＶ）的外壳蛋白（ＣＰ）基因和卫星ＲＮＡ（Ｓａｔ—ＲＮＡ）基因，在获得的共１１２株转化植株中，有３株在人工接种浓度高达２００μｇ／ｍｌ的ＣＭＶ时仍不发病。通过０．４％秋水仙素处理使之加倍并收获种子，而后连续两代在大田条件下鉴定其ＣＭＶ抗性及综合农艺性状，并与单独导入了ＣＭＶＣＰ基因或ＣＭＶＳａｔ—ＲＮＡ基因的转基因ＮＣ８９品系及未转化的对照ＮＣ８９进行了比较。结果表明，同时表达ＣＭＶ外壳蛋白和卫星ＲＮＡ的双单倍体转基因植株，在Ｒ—１代即表现出一致的可稳定遗传的ＣＭＶ抗性，抗性水平较单独表达ＣＰ或Ｓａｔ—ＲＮＡ的转基因ＮＣ８９提高１倍左右。     

抗虫转基因烟草8611纯合系的选育

对获得的表达江豆胰蛋白酶抑制剂的转基因８６１１进行了抗虫性研究，从转基因当代植株中筛选出两株高抗单株８６１１－６、８６１１－１１，在用其离体叶片饲养烟方虫８天后，对烟青虫的杀死率分别达到５０％和４０％。在田间接种及自然（不施药）条件下，８６１１－６、８６１１－１１子代植株的虫害指数分别为６３．５％、６９．３％（接种后１５天）和３７．７％、３９．８％（移栽后２５天），而未转基因对照植株的虫害指数分别为９３．５％和５７％。     

农杆菌介导快速、高效获得转基因烟草纯合株系

利用植物表达载体PBI121空载体,对农杆菌介导法转化烟草技术体系进行了综合改进,探索激素配比、侵染时间、分化和生根培养阶段卡那霉素的筛选压对烟草(Nicotiana tabacum cv.Petit Havana SR1)植株再生和转化效率的影响;同时根据孟德尔显性性状杂合子自交后代遗传分离规律,在转基因株系后代扩繁时用卡那霉素筛选分离,可以在T2代较快得到纯合株系.本研究通过使用整个叶片浸染、高的卡那霉素筛选剂浓度、控制生长条件以及强化管理,极大地缩短了获得纯合株系的时间,确立了该烟草品种快速、高效获得大量转基因阳性植株及快速获得转基因纯合株系的转化体系,其转化周期可减少至5-6个月,转基因植株阳性率可达到90％,其中60％的转基因植株后代卡那霉素抗性性状分离比例接近3:1.     

烟草抗花叶病新品系“转墓因NC89”选育技术的研究

本文报导了国内首例抗烟草花叶病毒（ＴＭＶ）和黄瓜花叶病毒（ＣＭＶ）的转基因双抗烟草新品系的选育方法，获得了具有抗ＴＭＶ和ＣＭＶ的双抗优质新品系。在新品系第４—６代的田间试验中，验证了其抗病毒特性的遗传稳定性；与对照品种ＮＣ８９在农艺性状、品质和烘烤特性等方面进行比较，证明转基因抗病新品系除抗病性显著增强外，其它特性均略优于原ＮＣ８９良种。１９９２年在河南省示范推广６６６７ｈｍ~２，转基因抗病新品系对烟草花叶病的相对控制效果为５０％－７０％，防病增产的经济效益显著。     

沉默2b基因获得抗黄瓜花叶病毒(CMV)的转基因烟草

  目的  本研究利用dsRNA技术沉默2b基因,获得烟草品种云烟85的T₁代转基因抗CMV株系。  方法  构建含有CMV 2b部分序列反向重复的植物表达载体pBIN-2b（r）-In-2b（i）,以农杆菌介导的叶盘法转化普通烟草（Nicotiana tabacum）品种云烟85。  结果  抗性筛选获得112株T₀代转基因阳性植株,接种CMV进行抗病性鉴定,发现有46株T₀代转基因植株表现为抗病,其他66株表现为感病。Tas-ELISA检测表明,T₀代抗病烟株的病毒积累量显著低于感病烟株。选取10个T₀代抗病株系繁殖,接种CMV鉴定T₁代抗病性,发现部分T₁代烟株发生一定比例的抗感分离,T₁代抗性株率为46.7%~100%。Real-time PCR检测T₁代烟株,发现T₁代抗病烟株CMV 2b基因RNA积累水平显著低于感病烟株。  结论  基于以上策略及实验,获得抗CMV转基因烟草株系。      

转fps基因烟草纯合系的获得及其特性分析

携带有外源法呢基焦磷酸合酶（fps）基因和卡那霉素抗性基因（Npt—Ⅱ）的烟草种子在含卡那霉素（300mg／L）的培养基上能够正常地萌发和生长，对照种子虽能萌发，但幼苗形态与对照有着明显的差异。转fps基因植株所具有的卡那霉素抗性和与其抗病性之间密切相关，由此建立了一种鉴定转基因烟草后代纯合度的简易方法，得到4个fps转基因烟草纯合系（K-4、K-6、K-17、K-35），并对其农艺性状、田间抗性、化学成份和品质进行了评估，其中K-4转基因品系的综合性状较原有品种有所提高。     

转抗虫基因烟草NC89纯合品系的获得及大田抗虫试验

经过连续三代抗虫性鉴定，选育出了表达直豆胰蛋白酶抑制剂（ＣＰＴＩ）的广谱抗虫转基因烟草ＮＣ８９纯合品系ＮＣ８９Ｌ２７－１９和ＮＣ９８Ｌ２７－２１。在大田对两个纯合系的抗虫性状进行了研究。①人工接种烟青虫；②害虫自然发生，不施杀虫剂；③在同一虫害防治阈值时施用杀虫剂。结果表明：转基因品系可稳定表达抗虫性状。在不施用杀虫剂时，田间相对抗虫效果在６４．７％～７０．５％之间；在施用杀剂时，可减少用药量４０％左右。转基因品系仍维持原ＮＣ８９主要植物学特性及农艺性状，为ＮＣ８９品种的抗虫改良品系。     

利用花药培养系统选育烟草抗赤星病品系

在接种有烟草赤星病菌的双层培养基上及含赤星病菌毒素的选择培养基上，获得了烟草推广品种ＮＣ８９的花药培养苗。温室内采用离体叶片法对这些花培苗进行了赤星病抗性鉴定，结果约１８％－４２．９％的植株抗性较对照ＮＣ８９有所提高。选其中４株抗性较高且农艺性状与对照ＮＣ８９相近的单株经秋水仙素加倍后收获了种子，然后于１９９２、１９９３年分别在赤星病病圃及大田条件下对其Ｒ—１代、Ｒ—２代植株进行了赤星病抗性及农艺性状测试。两年试验结果一致表明：在染色体加倍以后，所选植株的后代在基因型上已完全纯合，赤星病抗性较对照ＮＣ８９有较大提高，农艺性状也有所改善，而且均稳定遗传，是不同于原ＮＣ８９的烟草新品系。其中两个品系对赤星病的田间相对防效分别达５７．８％和５３．４％，且农艺性状优异，在生产上具有广泛应用前景。     

水杨酸和氨基酸对烟草黄瓜花叶病毒病防治效果的研究

研究了植物内源生理活性物质水杨酸和氨基酸对烟草黄瓜花叶病毒病（ＣＭＶ）的防治效果。叶面ＣＭＶ接种后的次日，叶面分别以水杨酸、水杨酸和氨基酸混合溶液以及水杨酸和氨基酸配合微量元素进行一次叶面处理。上述药剂处理对改善烟草营养生长、提高光合作用活性有积极作用。同时提高了叶片组织中具有抗病保护功能的过氧化物酶活性，使感染ＣＭＶ的烟草发病率和病情指数下降。其中氨基酸与水杨酸混合处理效果最好，一次叶面处理后ＣＭＶ防治效果达５０％。水杨酸对烟草病毒病（主要是ＴＭＶ）防治效果已有研究，但氨基酸的病毒病防治作用尚未见报道，值得今后进一步研究。     

烟草转基因检测方法的研究

通过试验研究,提出了烟草转基因检测方法和标准,首先提取样品DNA采用260－280nm波长扫描测定提取物DNA浓度和纯度,并利用叶绿体不编码蛋白基因序列PCR扩增确定模板质量,同时进行35s启动于,NOS终止子的PCR扩增,对于未出现特异性扩增的样品进行35s和NOS的巢式PCR反应,对于出现目标长度片段扩增的样品再次提取DNA重复检测,并利用限制性内切酶酶切、巢式PCR、探针杂交和目的基因序列扩增进行验证,确定所转目的基因种类。并应用竞争性PCR测定样品中转基因阳性成分含量。     

烟草转基因内标准定量检测中竞争性模板的制备

以转基因烟草为材料，通过DNA提取、PCR扩增获得NOS终止子片段产物，以重叠延伸扩增法制备该片段的竞争性模板，并进行酶切验证。     

转基因烟草品系的农艺性状的评估

由于植物转基因技术的发展,使烟草获得马铃薯Y病毒（PVY）抗性成为可能。然而,一个转入基因的存在可能会使除了目标性状以外的其它性状也发生改变。因此,对获得的转基因株系的农艺性状和生物学性状进行评估就显得很有必要。在这项研究中,我们研究了属于由3种遗传结构修饰的4个栽培品种的烟草转基因株系。     

转基因烟草定性检测方法的研究

本文总结多年的试验研究结果,提出了一套较为完善的转基因烟草定性检测技术,应用该技术,能使转基因烟草的检测精确度由常规PCR的0.1%提高到0.005%。该技术在两次CORESTA转基因烟草盲检合作试验及多年的进出口烟叶、卷烟制品的转基因检测工作中得到广泛的验证。      

基于SLAF-seq技术的烟草抗CMV主效QTL定位

烟草花叶病（CMV）是烟草主要病害之一,筛选与CMV抗病QTL紧密连锁的分子标记是烟草抗病分子育种的重要部分。本研究以抗病材料台烟8号和感病材料NC82为亲本,获得BC1群体,构建抗、感池。采用BSA和SLAF-seq技术开发CMV抗病相关SNP分子标记,共获得180 370个SLAF标签,经分析后获得6156个多态性SNP标记。利用SNP-index分析方法,发现两个与CMV抗病高度关联的区域。利用这些分子标记成功定位到了两个CMV抗病相关QTL,其中一个QTL定位于Chr01上的55.72~60.44 Mb区间内,区间大小为4.72 Mb;另一个则定位于烟草Chr18上的44.21~48.70 Mb区间内,区间大小为4.49 Mb。在关联到的QTL区间内设计分子标记可以用于烟草抗CMV育种的辅助选择。     

烟草与黄瓜花叶病毒互作中过氧化氢酶活性的变化

研究了12个不同抗性水平的烟草品种接种黄瓜花叶病毒前后过氧化氢酶活性的动态变化及其与烟草抗病性的关系。结果表明,接种病毒后抗、感品种的过氧化氢酶活性总体水平比对照降低,但酶活性的动态变化规律与烟草抗病性之间的相关性并不显著。利用DPS数据处理系统分析表明:酶活性变化差值及其平均值与病情指数之间均不存在显著相关性,说明以接种前后植物体内酶活性的变化值作为抗病性鉴定的指标在烟草-黄瓜花叶病毒体系中是不可行的。     

烟草体细胞杂交优质抗病株系的选育

为了选育抗花叶病的烟草新品种 ,用G 140与抗花叶病的野生波叶烟草 (N .undulata)进行了体细胞杂交 (即两种烟草的体细胞原生质体融合 ) ,其后代经过形态学鉴定 ,过氧化物酶同功酶酶谱鉴定、细胞学染色体数目检测 ,确定为体细胞杂种植株。采用定向筛选和回交手段选育体细胞杂种植株 ,经过 3年的田间筛选鉴定 ,得到了体细胞杂交单株自交系 ,从中再经筛选和攻毒试验获得了几个综合农艺性状好 ,抗或耐花叶病的优良单株和株系     

TaNAC提高转基因烟草的抗旱功能

NAC (NAM-ATAF-CUC)转录因子在植物逆境胁迫应答反应中发挥重要作用。通过同源克隆的方法从小麦中分离得到一个编码NAC转录因子的基因--TaNAC,该基因编码的蛋白序列结构特殊,N端为保守性差的NAC保守域,只包含A,B,D三个亚结构域,进化关系上与DREB家族更近,其C端共同享有多个基序。实时荧光定量PCR实验证实TaNAC基因受干旱诱导24 h后强烈表达。将该基因构建到PBI121双元植物表达载体的35S启动子下游,通过农杆菌介导的叶盘转化法转入烟草,获得T1代转基因苗。模拟干旱胁迫处理实验表明,过量表达TaNAC的转基因烟草表现出明显优于野生型对照的抗旱功能,说明TaNAC基因的过量表达能够提高烟草抗旱能力,TaNAC可以作为烟草抗旱育种的优良候选基因资源。      

烟草转基因检测标准及PCR反应体系的研究

通过对PCR体系和反应条件的优化,确定了针对35s启动子序列进行转基因检测的最佳反应体系和反应条件,利用纯阳性模板经PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳确认1ng模板DNA为纯阳性样品理想扩增下限,同时以不同阳性含量的干烟叶为材料,确定了烟叶转基因检测的标准为0.1%,建立了转基因外标定量法,并通过已知阳性含量样品的检测对该反应体系和检测标准进行了结果验证      

油纤兼用抗枯萎病亚麻新品种伊亚2号的选育

伊亚２号是以油用品种喀什７４５９－１２为母本，高抗枯萎病的油纤兼用加拿大品种红木６５为父本，经杂交单株选择和集团选择，南繁加代异地鉴定选育而成，该品种具有籽粒产量，原茎产量，含油率高，高抗枯萎病和工艺长度长特点，在华北，西北确认为综合性状超标，具有推广价值的新品种。