小鼠miR-155基因启动子分析及转录活性鉴定

目的：鉴定小鼠miR-155基因启动子转录活性区域,预测转录因子结合位点,探讨miR-155在巨噬细胞极化中表达失调的转录调控机制。方法：分别构建小鼠miR-155基因表达质粒和miR-155基因启动子连续截短片段的荧光素酶报告载体。将miR-155表达载体与miR-155启动子荧光素酶报告载体瞬时共转染人胚肾上皮细胞293T,48 h后检测双荧光素酶活性。选取miR-155基因转录起始位点(TSS)上游2 000 nt作为启动子区,生物信息学预测该区域可能结合的转录因子,并在体外极化的M1型和M2型巨噬细胞中检测结合的相关转录因子的表达。结果：成功构建小鼠miR-155基因表达质粒和miR-155基因启动子连续截短片段的荧光素酶报告载体。双荧光素酶试验结果显示,小鼠miR-155基因TSS上游1～500 nt、1～1 000 nt及1～2 000 nt片段均存在转录激活作用,提示小鼠miR-155基因TSS上游1～2 000 nt均为miR-155基因的启动子区域,其中1～500 nt为启动子核心区域。转录因子的生物信息学预测结果显示,miR-155基因TSS上游1～2 000 nt...     

人同源盒基因NKX3.1内含子及5′上游10 kb调控区功能的初步分析

目的 检测人同源盒NKX3.1基因内含子及5'上游10 kb调控区对启动子活性的影响,分析其雄激素反应性和组织特异性,为进一步研究该基因表达调控机制奠定基础.方法 利用基因重组技术分别构建5'上游10 kb调控区/内含子-NKX3.1基本启动子-荧光素酶报告基因质粒.转染雄激素依赖性前列腺癌细胞株LNCaP后,检测荧光素酶表达活性,观察内含子及5'上游调控区对NKX3.1启动子活性的影响;加入雄激素类似物R1881刺激,进一步检测其雄激素反应性;通过转染不同细胞分析其组织特异性.结果 荧光素酶报告基因分析表明,NKX3.1基因5'上游-7 681 ～-6 483 bp可以增强其启动子活性2.6倍,但该增强作用并不具有组织特异性.内含子及5'上游10 kb其他区域对NKX3.1启动子活性未见明显的增强作用.R1881刺激并不能使内含子及5'上游10 kb调控区活性明显增强.结论 NKX3.1基因内含子及5 '上游10kb调控区不具备雄激素反应性,5'上游-7 681 ～-6483bp可以增强NKX3.1启动子活性,但其组织特异性增强元件并不存在于该片段.     

小鼠PGC-1α基因启动子的转录调控功能分析

目的 克隆小鼠PGC-1α基因的启动子并分析其转录调控模式.方法 设计引物,以小鼠肝脏组织DNA 为模板,PCR扩增PGC-1α基因启动子区并克隆入荧光素酶报告基因表达载体pGL3-Basic 中,构建具有PGC-1α启动子转录活性的报告质粒pGL3-PGC-1α-Luc.通过特异性引物,引入替换碱基突变相关转录因子调控模序,构建点突变融合载体,并将其转染1c1c7 及c2c12 细胞系,检测荧光素酶的表达情况.结果 构建的pGL3-PGC-1α-Luc 系列报告质粒经过酶切鉴定及DNA 测序分析都显示正确;PGC-1α基因启动子区域（-2533~＋78）具有较强的转录活性;突变失活PGC-1α基因启动子区域中的CRE及IRE反应原件导致转录活性明显降低.结论 成功构建小鼠PGC-1α基因启动子报告质粒,PGC-1α基因上游区域（-2533~＋78）具有较强的启动子活性;启动子区域中的CRE和IRE反应原件为主要转录调控位点.     

POMC基因5‘上游近端片段的转录调控作用初探

目的　建立阿片黑皮质素原 (POMC)基因 5′上游近端转录调控体系并初步探讨其作用特点。方法　采用 DNA重组技术构建一系列受大鼠 POMC基因 5′上游近端不同长度片段介导的荧光素酶报告基因质粒 ,以lipofectam ine 包裹质粒转染垂体 ACTH瘤细胞系 (At T2 0 ) ,然后测定荧光素酶活性。结果　成功地构建了含POMC基因 - 34 / 6 3bp、- 16 5 / 6 3bp、- 32 3/ 6 3bp和 - 480 / 6 3bp片段的 4种报告基因质粒 ,其荧光素酶相对表达活性分别为 1、2 .1± 0 .3、3.3± 0 .3和 3.7± 0 .5 ,阳性对照为 4.8± 0 .8。结论　 POMC基因的核心启动子比较弱 ,提示 POMC基因可能存在多个转录起始位点 :At T2 0细胞中 POMC基因持续表达的近端组织特异性调控元件主要集中于 - 34 / - 16 5 bp范围内。上述结果为进一步研究各种调节因子对该基因的表达调控打下基础     

白细胞介素2受体α基因表达中两组近端启动子活性的研究

淋巴细胞表面的高亲和力白细胞介素2受体(IL-2R)由α、β和γ三个亚基组成.其中α亚基只在激活淋巴细胞上表达,并且只能与IL-2特异性结合.因此,IL-2Rα基因的活化过程参与决定淋巴细胞增殖和免疫应答强度的调控.IL-2Rα基因至少存在两组近端启动子,即分别位于-58(5')及+1(3')转录起始位点及其各自上游30 bp附近的两个TATA盒.为探讨它们在PHA激活前后的淋巴细胞中IL-2Rα基因表达中的作用,应用PCR及分子重组技术构建了两组分别受IL-2Rα基因片段驱动的荧光素酶(Luciferase,Luc)报告基因质粒:     

人EFTUD2启动子的鉴定及初步分析

目的：鉴定并分析EFTUD2（elongation factor Tu GTP?binding domain?containing 2）基因的启动子区域。方法：应用生物信息学技术对EFTUD2基因结构及潜在启动子区域进行分析,预测4个EFTUD2启动子序列。使用全基因合成技术以及高保真PCR扩增得到目的启动子序列,通过BglⅡ和NheⅠ双酶切,将目的条带克隆到双荧光素酶报告基因载体psiCHECK?2中,得到4个长度不同并覆盖EFTUD2基因转录起始位点附近约2 kb的EFTUD2基因启动子双荧光素酶报告基因重组体。荧光素酶分析检测启动子活性。结果：经酶切、测序鉴定,成功构建了人EFTUD2启动子荧光素酶报告基因重组质粒。通过荧光素酶活性检测,重组体EFTUD2?0.5的相对荧光素酶活性增加（P < 0.05）,提示EFTUD2基因核心启动子序列位于转录起始位点附近约500 bp的区域内。结论：EFTUD2基因转录起始位点上游500 bp具有启动子活性,初步判定其核心启动子位于该区域。     

hTERT启动子的克隆及其在端粒酶阳性肺癌细胞中的靶向转录活性研究

目的克隆人端粒酶催化亚单位（hTERT）启动子序列片段,并探讨hTERT启动子在肿瘤细胞中的靶向转录活性。方法用PCR方法克隆293细胞DNA hTERT 5＇端上游旁侧序列长约1．1kb的启动子片段,经测序无误后将其克隆入荧光素酶报告质粒pGL3-Basic的荧光素酶基因上游,构建pGL3-hTERTp重组质粒,瞬时转染肺癌细胞A549、SPC-A-1、LTEPα-2、NCI-H446、YTMLC-9、GLC-82、95D、A2以及正常成纤维细胞MRC-5,检测荧光素酶活性。并用RT-PCR和TRAP-ELISA方法分析各细胞hTERT mRNA的表达及其端粒酶活性。结果琼脂糖电泳显示PCR克隆的hTERT启动子片段长约1．1kb,DNA测序结果与GenBank中hTERT启动子DNA序列完全一致,位于hTERT基因转录起始位点上游1126bp（-1126～-40）,片段长度为1084bp;采用双酶切和PCR两种方法鉴定pGL3-hTERTp重组质粒,均显示构建成功;hTERT mRNA和端粒酶活性在肺癌细胞中呈不同水平的表达,而正常细胞则均为阴性;瞬时转染及荧光素酶活性检测实验显示,hTERT启动子片段在所有检测的肺癌细胞中均有高低不同的转录活性,在正常细胞MRC-5无转录活性。结论克隆的1084bp大小的hTERT启动子片段在hTERT mRNA和端粒酶阳性的肺癌细胞中有特异性的转录活性,hTERT启动子可能作为靶向性基因治疗的调控元件。     

原癌基因USP22启动子的克隆及转录活性分析

 目的克隆原癌基因USP22部分启动子序列,探讨其转录活性。方法应用cDNA 5忆末端快速扩增（5'RACE）方法定位
USP22基因转录起始点;在此基础上针对其5'端非编码区处包括转录起始点在内的-2 828~+52片段进行PCR扩增,产物克隆
入荧光素酶表达载体pGL3-Basic。重组质粒与内参质粒pRL-TK共转染HepG2 与Hela 细胞,双荧光素酶活性检测确定其转录
活性。结果成功确定USP22基因转录起始位点,酶切及测序结果证实USP22基因5'端非编码区2 880 bp 序列正确插入到荧
光素酶报告基因载体pGL3-Basic。重组质粒pGL3-USP22 promoter 转染HepG2 细胞和Hela 细胞后,检测到荧光素酶的高表达
（ P<0.05）。结论成功构建具有转录活性的USP22启动子片段,为进一步研究USP22表达调控机制奠定基础。     

BCMA基因5'上游序列定点删除突变对启动子活性的影响

目的 探索BCMA基因5]上游序列-24～-26住点删除突变对启动子活性的影响,为进一步研究BCMA基因的表达调控机制提供实验依据.方法 设计一对突变引物,采用定点删除技术,删除BCMA基因5'上游序列-24～-26住点,电转1558L细胞检测荧光素酶的表达,观察荧光素酶相对活性.结果 成功删除BCMA基因-24～-26"AAA".启动子活性明显下降.结论 BCMA基因5'上游序列-24～-26住点可能是RNA聚合酶识别的重要位点.也可能为重要转录因子结合位点.     

条件性SV40 TAg转基因小鼠模型的建立

目的 建立可调控的脑组织特异性表达SV40 TAg的转基因小鼠模型.方法 构建由大鼠神经元特异性烯醇化酶基因(rat neuron-specific enolase, NSE)启动子驱动四环素基因表达调控系统的载体,从而控制SV40 TAg基因的表达;受精卵雄原核显微注射该线性化载体制备转基因小鼠;PCR方法鉴定首建鼠;RT-PCR方法检测小鼠组织中四环素反式激活子(rtTA)及SV40 TAg基因的表达情况.结果 显微注射获得17个首建鼠,其中的6个首建鼠建系成功;1#、6#品系小鼠的脑组织中表达rtTA基因;强力霉素诱导后,可检测到6#品系小鼠脑组织中SV40 TAg基因的特异性表达.结论 可调控的脑组织表达SV40 TAg的转基因小鼠模型已经建立.     

甲基化DNA对突变的alkA基因转录的影响

目的：认识在适应应答反应中ａｌｋＡ基因表达活性与ｍＤＮＡ的关系，研究ｍＤＮＡ对突变ａｌｋＡ基因体外转录的影响。方法：以突变的ａｌｋＡ基因启动子为模板，观察ｍＤＮＡ对其体外转录产生ｍＲＮＡ量的影响。结果：ａｌｋＡ基因启动子转录体系中加入ｍＤＮＡ，产生的ａｌｋＡｍＲＮＡ是未加ｍＤＮＡ的对照组的１～８倍；ｌａｃ基因启动子转录体系中加入ｍＤＮＡ产生的ｌａｃｍＲＮＡ与对照组基本相同。结论：ｍＤＮＡ对ｌａｃ基因启动子转录无明显影响，而对突变型和野生型ａｌｋＡ基因启动子转录有明显促进作用。这种调节作用可能发生在基因启动子区     

人类β—珠蛋白基因5‘—1559bp上游转录调控区的重组及表达

目的：探讨人类β－珠蛋白基因5‘－帽位上游新转录调控元件;方法：利用重组DNA技术,构建及克隆3个含有人类β－基因不同5‘帽位上游片段的荧光素酶报告基因重组载体（pGL2-promoter/SB-β^RHB734,pGL2-promoter/SB-β^RAB573,pGI2-promoter/SB-β^RHfB263),分别将其导入Hela细胞中,采用β－半乳糖苷酶报告基因为转移效率内对照,空白的荧光素酶基因载体为基础对照,进行荧光素酶活性比较。结果：3个基因片段载体构建符合设计,其相对抑制活性分别为59．74％、80．97％、79．42％;结论：初步提示人类β－基因5‘帽位上游－2132－－1822bp片段及－1822－15559bp片段内可能存在有起负调控作用的顺式作用元件（抑制子）,而－2277bp--2132bp片段间未检出抑制子或增强子活性存在,在初步结果尚需进一步研究证实和阐明其结构与功能的关系。     

老化对磷酸烯醇型丙酮酸激酶基因转录作用的影响

使用６￣２６月龄Ｆｉｃｈｅｒ３４４禁食雄性大鼠肝脏研究了老化对磷酸烯醇型丙酮酸激酶（ＧＴＰ）（ＰＥＰＣＫ．ＥＣ．４．１．１．３２）基因表达的影响，结果表明６￣２６月龄大鼠肝脏提取物中的ＰＥＰＣＫ活力约下降５０％，且与年龄相关的ＰＥＰＣＫ活性的下降与ＰＥＰＣＫ ｍＲＮＡ水平的下降相平行。因此，ＰＥＰＣＫ活性的下降可能是因用于进行转译作用的ｍＲＮＡ的转录作用下降，且６月龄到２６月龄大鼠肝脏的ＰＥＰＣＫ     

人脑胶质瘤P73等位基因缺失及转录水平的实验研究

目的 :探讨P73等位基因缺失及转录水平是否与胶质瘤发生有关。方法 :运用DNA限制性酶切片段长度多态性 ,在 5 6例胶质瘤 正常组织标本对中进行P73等位基因杂合子的鉴定并确定胶质瘤中P73等位基因杂合性缺失率 ;运用半定量RT PCR分析P73 mRNA在胶质瘤中的相对表达水平。结果 :胶质瘤中P73等位基因杂合性缺失率为 14 .3 % ;胶质瘤与正常对照中P73 mRNA的表达水平无显著差别。结论 :人脑胶质瘤的发生可能与P73基因异常无关。     

组成型αB晶体蛋白在热休克蛋白核转录因子1敲除小鼠心肌中的表达

目的:了解热休克蛋白核转录因子1(HSF1)对小鼠心肌组成型αB晶体蛋白(αB-Crystallin,αBC)表达的影响.方法:用western blot和免疫组织化学的方法,测定组成型αBC在HSF1基因野生型(hsf1+/+)和HSF1基因敲除型(hsf1-/-)小鼠心肌中的表达.结果:αBC在hsf1-/-和hsf1+/+小鼠心肌表达量分别为68.42±4.16和100.00±7.58(心肌可溶性组分,P＜0.05),20.35±1.01和37.55±1.91(心肌不可溶性组分,P＜0.05);免疫组化显示αBC在hsf1-/-心肌细胞内的表达信号较hsf1+/+明显减弱.结论:HSF1基因是介导组成型αBC基因表达重要的、但不是惟一的因子.     

L-精氨酸对大鼠尾核一氧化氮合酶基因表达的影响

目的 研究尾核中一氧化氮在痛觉调制中的作用机制.方法 大鼠尾核内微量注射L-精氨酸、Nω-硝基-L-精氨酸甲酯、生理盐水,应用逆转录-聚合酶链反应测定4,8,12,24和48 h大鼠尾核nNOS mRNA表达的变化;新生Wistar大鼠尾核神经元原代培养液中加入L-精氨酸、Nω-硝基-L-精氨酸甲酯、生理盐水,观察给药12 h尾核nNOS mRNA表达的变化.结果 大鼠尾核给药24 h内L-精氨酸组nNOS mRNA表达较正常增强(P＜0.05),而Nω-硝基-L-精氨酸甲酯组nNOS mRNA表达较正常减弱(P＜0.05),48 h恢复正常.体外尾核原代神经元培养,nNOS mRNA表达的变化趋势和在体实验相一致.结论 中枢神经系统尤其是尾核中NOS活性是一氧化氮作为神经递质或调质参与中枢痛觉调制的关键因素之一.     

游泳应激对下丘脑室旁核CRH/AVP基因转录的影响及糖皮质激素的作用

目的阐明游泳应激后下丘脑室旁核(PVN)促肾上腺皮质激素释放激素(CRH)和血管加压素(AVP)基因转录的变化以及非生理剂量地塞米松对两基因转录的调节作用。方法生理盐水(100μl)或地塞米松(0.3mg/kg)腹腔内注射2h后,强迫游泳10min分别立即断头取血;血中促肾上腺皮质激素(ACTH)水平应用放射免疫分析法(RIA)测定。合成[35S]标记的RNA探针,应用原位杂交组织化学方法及放射自显影的方法检测CRH mRNA、CRH hnRNA、AVP mRNA及AVP hnRNA的表达量,放射自显影图像应用NIH Image软件系统解析。所有数据均输入数据库,以statview软件进行统计分析。结果强迫游泳10min血中的ACTH明显升高,而地塞米松可部分抑制这种由于游泳应激引起的血中ACTH升高。游泳应激10min时PVN内的CRH hnRNA表达量明显升高,地塞米松的投与完全抑制了CRH hnRNA的增加(P<0.01,n=5)。在单纯生理盐水和地塞米松注射组PVN小细胞内AVP hnRNA的表达量极少,游泳应激10min小细胞内AVP hnRNA的表达量无明显变化,地塞米松对此也无任何影响。结论糖皮质激素可以抑制急性应激所致的CRH基因转录。与此不同的是强迫游泳应激后PVN小细胞区AVP基因转录水平却并未立即增加,说明虽然AVP与CRH基因均表达于PVN区同一神经元,但是其转录调控机制却不尽相同。     

差示逆转录-聚合酶链反应技术定量检测柯萨奇B组病毒核酸方法的建立

目的　建立对患者体内病毒水平进行客观定量检测的方法。方法　采用差示逆转录 -聚合酶链反应 ,共同扩增柯萨奇B组病毒 (CVB)目的基因和参照模板Mmyogene ,建立一种检测CVB复制水平的定量方法 ,并对苦瓜素体外抗CVB3感染疗效进行初步评价。结果　该方法成功检测到CVB3RNA水平 ,且苦瓜素处理组CVB3RNA水平明显低于对照组。结论　该方法具有简便、快速、可靠、重复性好等优点 ,同时检测多份样本 ,非常适合于大样本药物筛选 ,可为抗CVB病毒感染疗效的评价提供一个有效指标