罂粟碱通过调节自噬对肝癌细胞放射敏感性的影响

为探究罂粟碱(Papaverine,PPV)和细胞自噬在原发性肝癌放射敏感性中的作用机理,将肝癌HepG2、Huh7细胞进行X射线照射,并将细胞分为阴性对照(NC)组、罂粟碱(PPV)组、单纯照射(IR)组，然后采用CCK8实验检测细胞的增殖情况,划痕实验检测细胞迁移情况,克隆形成实验检测细胞放射敏感性,实时定量PCR (RT-PCR)实验检测LC3B、ATG7 mRNA表达情况,蛋白免疫印迹(Western blot)实验检测自噬相关标志物LC3B、p62、p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR蛋白表达情况。研究结果显示,与NC组相比,罂粟碱对肝癌HepG2和Huh7细胞的增殖有明显的抑制作用(P<0.05),并可以抑制肝癌细胞的迁移能力(P<0.05)，显著降低肝癌细胞LC3B、ATG7 mRNA的表达水平(P<0.05)和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的蛋白表达,提高p62、p-PI3K、p-AKT和p-mTOR的蛋白表达。此外,罂粟碱还可以提高肝癌细胞的放射治疗(RT)效果。上述结果表明罂粟碱通过PI3K/AKT/mTOR通路抑制HepG2、Huh7细胞自噬,从而抑制肝癌细胞的增殖和迁移能力,并提高肝癌细胞放射敏感性。     

莪术醇通过抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路介导的自噬抑制乳腺癌细胞的增殖活性

目的 探讨莪术醇对乳腺癌细胞增殖的影响及可能作用机制。方法 MTT法检测不同浓度莪术醇对MCF-7细胞增殖的影响,计算半数抑制浓度(IC₅₀);细胞分为对照组、莪术醇组、740Y-P组和莪术醇+740Y-P组,检测细胞克隆形成能力、细胞凋亡情况、细胞自噬情况及相关蛋白表达。结果 莪术醇可抑制MCF-7细胞增殖,IC50为50.63μmol/L。与对照组比较,740Y-P组细胞克隆形成数、p62、脂酰肌醇3-激酶(PI3K)、磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)、磷酸化哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(p-mTOR)表达升高,凋亡率、Beclin1蛋白、微管相关蛋白轻链3(LC3)Ⅱ/LCⅠ降低,莪术醇组上述指标与740Y-P组趋势相反;而莪术醇+740Y-P能逆转莪术醇对细胞的抑制作用。结论 莪术醇可抑制乳腺癌细胞MCF-7增殖,可能与抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路激活自噬有关。     

蛇葡萄素对结肠癌细胞增殖抑制、自噬诱导及自噬对增殖的影响研究

明确蛇葡萄素(Ampelopsin,AMP)对人结肠癌HCT116细胞增殖的抑制,探讨自噬活化及自噬对AMP抑制细胞增殖作用的影响,为AMP临床研究抗肿瘤作用的自噬靶点提供依据.采用CCK-8法检测AMP(0～300μg/m L)作用HCT116细胞后细胞增殖变化,确定AMP的抗肿瘤作用;慢病毒感染法构建HCT116-RFP-GFP-LC3重组细胞株研究自噬标志蛋白LC3的荧光表达,结合蛋白质印迹法检测自噬标志蛋白LC3I/II和P62的表达确定细胞自噬活化状态;通过抑制剂Baf A1阻断HCT116细胞自噬晚期降解过程,比较AMP组与AMP+Baf A1组间AMP对HCT116细胞增殖的影响明确自噬对细胞增殖的影响.结果表明:AMP(150～300μg/m L)抑制细胞增殖,表明AMP具有抗肿瘤作用;对比空白对照组,AMP(50、75μg/m L)组重组细胞出现LC3荧光点状自噬体,自噬发生率分别为26.72%、19.47%; LC3II蛋白表达上调,P62下调,表明AMP诱导细胞自噬且自噬过程完整;与AMP组比较,加入Baf A1后,LC3II、P62蛋白及自噬点均显著增加,证明自噬晚期过程被阻断,但抑制自噬晚期降解过程对AMP组与AMP+Baf A1组间细胞增殖影响不显著(P0.05),说明在实验浓度范围内,阻断自噬降解过程对细胞增殖无显著影响.结论表明:AMP(0～300μg/m L)能够抑制结肠癌细胞增殖,激活细胞自噬,且自噬晚期降解过程阻断对细胞增殖无显著影响,细胞的增殖抑制可能是通过其他途径实现.     

Follistatin-Like 1单倍体敲除促进肺纤维化小鼠成纤维细胞自噬

Follistatin-like 1(Fstl1)是促纤维化因子,在成纤维细胞中通过调节TGF-β信号参与肺纤维化发生过程.自噬是维持细胞稳态的过程,在细胞衰老和分化中起到重要的作用.在特发性肺纤维化全肺中自噬不足.通过博来霉素处理Fstl1^+/-和Fstl1^+/+小鼠构建肺纤维化模型,研究在肺纤维化发展过程中,Fstl1对肺纤维化的效应细胞即成纤维细胞中的自噬的调节.Western blot检测自噬标记蛋白LC3和p62的表达,q RT-PCR检测自噬相关基因ATG5,ATG7,ATG12的表达.在肺纤维化发展的不同时期成纤维细胞的自噬处于动态变化过程,在第7 d时成纤维细胞自噬降到最低,随后逐渐恢复.在未经肺纤维化诱导的小鼠中,Fstl1单倍缺失不影响成纤维细胞自噬;在博莱霉素处理的小鼠中,Fstl1单倍缺失提高了成纤维细胞自噬.     

幽门螺杆菌VacA通过SIRT1/FOXO1信号轴促进胃癌细胞的自噬

纯化幽门螺杆菌空泡毒素A(VacA)蛋白后与人体胃癌细胞(SGC7901)共培养,蛋白质印迹法检测SGC7901细胞中沉默调节蛋白1(SIRT1)、叉头框蛋白O(FOXO)1及自噬相关蛋白(P62)的表达情况,并通过RNA干扰(siRNA)技术沉默SIRT1的表达,研究SIRT1/FOXO1信号轴与自噬的相互关系.研究结果显示,VacA蛋白处理胃癌细胞后,SIRT1及FOXO1蛋白表达水平升高,P62蛋白表达水平降低,SGC7901细胞自噬增强.通过干扰SIRT1表达,能够降低FOXO1蛋白表达,增强P62的表达,VacA蛋白诱导的SGC7901细胞自噬受到抑制.提示幽门螺杆菌VacA能够通过调节SIRT1/FOXO1信号轴促进胃癌细胞的自噬.     

低氧预适应对小鼠海马神经保护作用机制研究——基于TSC1/mTOR/自噬信号通路

 为研究低氧预适应（HPC）对小鼠海马神经保护作用的机制，采用Western Blot方法检测对照组、低氧组、低氧预适应组3组实验小鼠的TSC1、mTOR和磷酸化mTOR及LC3蛋白的表达，验证TSC1/mTOR/自噬通路是否参与HPC对小鼠海马的神经保护作用。通过体外HT22细胞转染TSC1-peGFP，给予低氧刺激后，采用MTS法检测细胞活性，进一步确定TSC1在低氧条件下的神经保护作用。结果显示，HPC可增加小鼠低氧耐受时间；与对照组相比，HPC组TSC1蛋白表达升高，磷酸化mTOR蛋白表达下降；体外转染eGFP-TSC1质粒组与空载组相比，细胞活性增强。结果表明HPC可能通过上调TSC1表达，下调mTOR磷酸化水平激活自噬对小鼠海马发挥神经保护作用。     

藻蓝色素蛋白通过调控miR-642a-5p抑制LTEP-a2细胞的增殖和迁移

研究藻蓝色素蛋白抑制非小细胞肺癌LTEP-a2体外增殖迁移的机制.以LTEP-a2细胞为模型,采用高通量miRNA转录组学对藻蓝蛋白处理后细胞中差异表达的miRNA进行了筛选;对筛选出的差异miRNA,利用体外转染mimics的方法对细胞的增殖、迁移能力进行验证.研究结果显示,藻蓝蛋白处理LTEP-a2细胞后能够显著增加细胞内miR-642a-5p的表达水平;过表达miR-642a-5p能够显著抑制细胞的体外增殖、迁移能力;此外,藻蓝蛋白可以通过上调miR-642a-5p表达抑制核受体NF-κB信号通路,降低蛋白磷酸化水平,进而抑制LTEP-a2细胞的增殖迁移能力.研究能够为藻蓝色素蛋白的应用以及非小细胞肺癌的治疗提供一定的理论基础.      

二甲双胍通过AMPK/FoxO3a信号通路对创伤性脑损伤后炎症因子的调节作用

为探究二甲双胍是否通过腺苷单磷酸活化蛋白激酶(AMPK)/FoxO3a途径发挥对创伤性脑损伤(traumatic brain inju-ry,TBI)后神经细胞分泌炎症因子的影响.通过将实验小鼠(雄性,C57BL/6)随机分为二甲双胍组、生理盐水组、复合物C组、野生型组和基因敲除组(FoxO3a敲除小鼠),每组20只.并建立伪手术模型,6、12、24 h的TBI模型.应用蛋白质印迹法(Western Blot)、免疫荧光双染检测的方法,研究了AMPK、FoxO3a、自噬相关蛋白(LC3,P62)和炎症因子(NLRP3,IL-1β)的表达情况,以及LC3和IL-1β的细胞核、细胞质的分布情况.结果表明:与生理盐水组相比较,二甲双胍组p-AMPK/AMPK比值增加,p-FoxO3a/FoxO3a比值降低,自噬水平升高,炎症因子表达降低,而复合物C组则相反;与野生型组相比较,结果提示FoxO3a基因敲除组自噬水平降低,而炎症因子表达水平显著增高.LC3主要表达在细胞质,IL-1β在整个细胞均有分布.可见AMPK的激活和FoxO3a蛋白有利于自噬的发生,二甲双胍可能通过AMPK/FoxO3a信号通路发挥对TBI后炎症因子的抑制作用.     

美洲大蠊多肽和顺铂联用对HepG2细胞凋亡及自噬的影响

采用MTT法检测美洲大蠊多肽（PAP-3）与不同浓度的顺铂（DDP）单用或联合使用对人肝癌HepG2细胞增殖的影响；采用流式细胞术检测PAP-3、DDP单独或联合给药干预对HepG2细胞凋亡的影响；Western Blot检测PAP-3、DDP单独或联合给药后HepG2细胞内自噬相关蛋白p62、LC3、Beclin-1、Atg5及PI3K的表达。实验结果显示，与DDP单独给药相比，PAP-3与DDP联合给药对HepG2的细胞的抑制作用更强；PAP-3与DDP联合给药组中细胞的凋亡率与DDP和PAP-3单独给药组相比均有升高（P ＜ 0.05)。与对照组相比，DDP组中，p62蛋白水平降低，LC3II蛋白水平升高，LC3II/I的比例也升高，表现出细胞自噬流的活化；与DDP组相比，联合给药组中p62蛋白水平回升，LC3II蛋白水平和LC3II/I的比例均有回落。且联合给药组中PI3K、Atg5、Beclin-1等自噬相关蛋白的量均较DDP组减少，而凋亡相关的Caspase-3蛋白的表达量则较DDP组增加。据此推测，PAP-3和DDP的联用可以通过抑制HepG2细胞自噬相关蛋白的表达水平，抑制DDP带来的细胞自噬水平的升高，增加细胞对DDP的敏感性，从而诱导HepG2细胞凋亡。     

5十七烷基间苯二酚对三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖的抑制作用

为研究5-十七烷基间苯二酚(AR-C17)对人乳腺癌MDA-MB-231细胞的作用及其潜在机制,采用CCK-8方法检测不同处理下的细胞存活率变化;DCF-DA荧光探针法检测活性氧(reactive oxygen species, ROS)变化情况;流式细胞术测定胞内肿瘤增殖标记物Ki-67的表达,细胞凋亡的变化,线粒体膜电位的变化及自噬体的形成情况;蛋白印迹法检测Bax、Bcl-2、LC3-Ⅱ等凋亡、自噬相关蛋白的表达情况。结果表明,与对照组相比,AR-C17显著抑制了MDA-MB-231细胞存活率,促进胞内ROS的生成,降低肿瘤增殖标志物Ki-67的表达,降低线粒体膜电位,上调Bax/Bcl-2的蛋白表达比率,增加活性Caspase的表达量,诱导MDA-MB-231细胞发生线粒体途径的凋亡;同时,AR-C17能够增加LC3-Ⅱ蛋白表达量,促进自噬体形成,诱导细胞发生自噬;此外,采用自噬抑制剂与AR-C17共同作用能够降低细胞存活率,进一步促进细胞凋亡。研究结果表明,AR-C17能够诱导人乳腺癌MDA-MB-231细胞发生凋亡和自噬,达到抑制乳腺癌细胞增殖的作用。     

壳寡糖对HeLa细胞和A549细胞自噬性死亡的影响

为了探讨壳寡糖(COS)对He La细胞和A549细胞自噬性死亡的影响,利用不同浓度COS处理细胞后MTT法检测细胞的增殖抑制情况,采用MDC染色法观察自噬泡的形成,免疫荧光法检测LC3在细胞内的表达,Western-blot分析COS处理He La和A549细胞不同时间后细胞内LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ变化。结果表明,5.0 mg·m L-1COS对两种细胞的增殖抑制率最大,分别为52.15%和57.63%(P0.01)。与阴性对照相比,经COS处理后的细胞MDC染色细胞内荧光强度增加,且阳性信号聚集于核周区域;免疫荧光检测发现LC3阳性颗粒数明显增加,表明细胞内自噬体的数量增多。Western-blot检测分析随着COS处理细胞时间延长,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值逐渐增大,显示细胞内自噬活性增强。由此推测COS能够通过诱导He La和A549细胞的自噬性死亡来抑制细胞增殖,为COS的抗肿瘤作用机制的研究提供理论依据。     

风车子抑素A4对人脐静脉内皮细胞的抑制增殖与诱导自噬作用研究

目的研究自噬在风车子抑素A4(Combretastatin A4,CA4)抑制人脐静脉内皮细胞(HUVECs)增殖中的作用,探讨CA4抑制血管生成的机制。方法体外培养HUVECs,采用不同浓度的CA4处理HUVECs,药物作用不同时间后用MTT法检测CA4对细胞存活率的影响,MDC染色检测10n M CA4处理不同时间自噬小体变化的情况,RT-PCR检测自噬相关基因LC3B和Beclin 1基因转录水平的变化,Western Blot检测LC3B和Beclin1的蛋白表达水平的变化。结果 CA4能抑制HUVECs增殖并在一定范围呈浓度依赖性和时间依赖性;10n M CA4处理12小时和24小时自噬小体显著增加,诱导HUVECs自噬;荧光定量PCR结果显示自噬相关基因LC3Ⅰ表达下调、LC3Ⅱ表达上调,LC3Ⅰ/LC3Ⅱ比值显著上调,Beclin 1表达上调;Western Blot结果与荧光定量PCR结果一致,但m TOR蛋白未见明显变化。结论 CA4能显著抑制HUVECs增殖和诱导HUVECs自噬。     

不同时间的热处理对大鼠肌肉Akt/mTOR信号途径的影响

热处理会诱导骨骼肌中肌肉蛋白的合成及肌肉肥大,同时刺激细胞信号途径.另外,有报道表明38℃以上的热处理以温度依赖性方式激活细包内信号途径.然而,骨骼肌细胞中热刺激对信号途径的持续性影响方面鲜有报道.因此,分析了热处理对大鼠骨骼肌中信号途径的作用.利用Western blot技术检测热处理后不同时间点(30,60和90min)的腓肠肌及比目鱼肌中Akt/mTOR信号途径蛋白Akt,mTOR,p70S6K及4E-BP1的磷酸化水平及热激蛋白HSP72的表达水平.结果表明,Akt及mTOR的磷酸化水平没有变化,磷酸化的p70S6K及4E-BP1水平有所上调,而热激蛋白HSP72的水平有所下调.     

岩藻黄素抗D-gal诱导SH-SY5Y细胞衰老作用及机制研究

衰老相关的神经退行性疾病发病率不断增高,严重影响老年人生活质量,为探讨岩藻黄素(Fucoxanthin, FUCO)对神经细胞的抗衰老作用及其机制,采用D-gal诱导人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y细胞)衰老,然后在细胞培养基中添加FUCO对细胞进行干预,检测其细胞活力、SA-β-半乳糖苷酶活性及细胞内丙二醛(MDA)含量,细胞内自噬体形成及自噬(Autophagy)相关蛋白的表达。研究结果显示,5,10μmol/L FUCO可明显抑制D-gal诱导的细胞衰老,显著提高SH-SY5Y细胞活力(P0.05),降低SH-SY5Y细胞内SA-β-半乳糖苷酶的活性(P0.05)和MDA含量(P0.05),但20μmol/L FUCO的抑制作用不明显(P0.05)。光学显微镜观察结果显示,5,10,20μmol/L FUCO组细胞内自噬体数量明显比模型组增多;Western blot检测结果显示,与模型组比较,10,20μmol/L FUCO组自噬相关蛋白ATG5表达增多、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ增大、p-mTOR/mTOR减小(P0.05)。表明FUCO具有抗D-gal诱导的SH-SY5Y细胞衰老的作用,其作用机制可能与适度调节自噬途径有关。     

不同温度热处理对大鼠骨骼肌Akt/mTOR信号通路的影响

热处理会诱导应急蛋白,从而促进细胞蛋白质合成并进一步导致肌肉肥大.但热处理对细胞内蛋白质合成中主要信号通路Akt/mTOR信号途径的影响鲜有报道.本研究分析了热处理对大鼠骨骼肌中Akt/mTOR信号途径的作用.利用Western blot技术检测了不同温度(37℃、38℃、39℃、40℃)的热处理对大鼠腓肠肌及比目鱼肌中Akt/mTOR信号途径蛋白Akt,mTOR,p70S6K及4E-BP1的磷酸化水平及热激蛋白HSP72的表达水平.结果表明39℃、40℃的热处理能够激活Akt及下游p70S6K的活性而对于热激蛋白HSP72的表达水平没有影响.     

NVP-BEZ235诱导自噬在肝癌细胞凋亡中的作用研究

目的 以Hep3B和PLC/PRF/5两种肝癌细胞为研究对象,探讨自噬在NVP-BEZ235中引起细胞凋亡的作用.方法 人类肝癌细胞Hep3B和PLC/PRF/5在含有10%FBS的DMEM培养基中进行培养,然后再进行细胞活性检测,用于Western blotting检测及线粒体膜电位(MMP)分析.结果 NVP-BEZ235能够有效增加LC3-Ⅱ的表达,并同时降低p62的表达,由此推断,NVP-BEZ235也能够诱导产生自噬,与Atg5的siRNA或自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)联合应用时,肝癌细胞的生长被抑制.结论 NVP-BEZ235与Atg5的siRNA或者3-MA的联合应用能够促进细胞凋亡,NVP-BEZ235和自噬抑制剂的联合应用可为肝癌和其他恶性肿瘤临床治疗提供新的方法.     

细胞自噬对拟南芥种子萌发的影响

自噬在植物生长发育过程发挥着至关重要的作用，但是植物中自噬与种子萌发的关系尚不明确。为了探究自噬对种子萌发的影响，通过基因表达检测、蛋白免疫印迹实验和种子萌发速率比较，分析了细胞自噬对拟南芥(Arabidopsis thaliana)种子萌发的影响。研究结果表明细胞自噬在植物种子萌发过程中发挥重要作用:(1)自噬基因的表达在种子萌发过程中明显上调，且ATG8蛋白在种子萌发过程中逐渐积累，表明种子萌发过程中细胞自噬被激活；(2)细胞自噬抑制剂3-methyladenine (3-MA)能够显著地抑制拟南芥野生型种子的萌发，拟南芥自噬突变体种子的萌发速度比野生型种子的慢，表明细胞自噬途径在种子萌发过程中发挥正向调控作用但不是种子萌发所必需的。     

HeLa细胞中激酶NUAK1调控Tuberiun的磷酸化

NUAK1是LKB1的下游激酶之一,可被LKB1磷酸化而激活,但对其在LKB1相关信号通路中的功能仍缺乏了解.本研究发现在HeLa细胞中重建LKB1表达后NUAK1与tuberin蛋白免疫共沉淀,提示在野生型LKB1存在时NUAK1与tuberin可能存在直接相互作用.进一步的激酶活性测定和in vivo蛋白磷酸化实验表明:在HeLa细胞中葡萄糖匾乏条件下,野生型LKB1可显著激活NUAK1的激酶活性;而被激活的NUAK1可明显提高tuberin 的磷酸化水平,使用NUAK1 siRNA pool干扰NUAK1的表达则几乎将tuberin的磷酸化水平降低为零.上述结果表明NUAK1可能介导了LKB1对tuberin磷酸化的调节,进而下调mTOR通路,抑制蛋白质合成与细胞生长增殖.     

新鲜冰冻血浆（FFP）通过AMPK/Akt/eNOS通路促肺内皮细胞一氧化氮释放及机制研究

探讨新鲜冰冻血浆(FFP)对人肺正常微血管内皮细胞(HPMECs)一氧化氮(NO)释放的影响及其机制.采用NO/Nitrite/Nitrate分析法检测了体外培养内皮细胞HPMECs经FFP处理后不同时间点细胞上清NO含量.结果显示:与培养基空白对照组相比,FFP显著增加内皮细胞NO生成;采用磷酸化蛋白激酶抗体芯片和免疫印迹方法筛选和鉴定FFP处理后内皮细胞相关蛋白激酶磷酸化,结果为FFP显著增加内皮细胞AMPKα1,Akt1和eNOS蛋白的磷酸化.进一步分别采用Compound C(AMPK抑制剂),LY294002(PI3K/Akt抑制剂)或L-NAME(NOS抑制剂)预处理细胞,阻挡AMPKα1/Akt1/eNOS信号转导通路.结果显示上述三种抑制剂均能抑制FFP诱导eNOS激活和NO生成,表明AMPKα1/Akt1/eNOS信号转导通路介导FFP诱导NO分泌参与血管保护.     

辛伐他汀对小鼠结肠癌细胞CT26凋亡的诱导作用及机理研究

考察了辛伐他汀对小鼠结肠癌细胞CT26生长率的影响,并探究其对CT26细胞凋亡的诱导作用及机理。以四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法测定辛伐他汀对CT26细胞生长的抑制情况;以蛋白质免疫印迹法测定细胞凋亡和增殖的标志蛋白PARP、Cleaved-PARP、P21和磷酸化的P53的蛋白表达水平;以AMPK的抑制剂Compound C来阻断AMPK信号途径后,观察辛伐他汀对CT26细胞中Cleaved-PARP表达的影响;以Compound C处理CT26细胞后,以RT-PCR和蛋白质免疫印迹法测定辛伐他汀在CT26细胞中诱导KLF2和KLF4的情况.辛伐他汀可以明显抑制CT26细胞生长,可以诱导CT26细胞中的凋亡相关的Cleaved-PARP蛋白上升,并且其作用机理可能和KLF4的上升有关.