肝细胞靶向性半乳糖-聚乙二醇-聚乙烯亚胺纳米基因载体的合成及其理化特性

对聚乙二醇-聚乙烯亚胺进行半乳糖化修饰，可使其成为具有肝细胞靶向性的纳米基因载体半乳糖化聚乙二醇-聚乙烯亚胺[Galactosylated poly（ethylene glycol）-grafl-polyethylenimine，Gal-PEG-PEI]。目的：合成Gal—PEG-PEI，考察其基本理化特征，为下一步的转染研究提供参考。设计、时间及地点：对比观察基因工程实验，于2007-10／2008-06在中山大学生物医学工程中心完成。材料：两步法合成Gal-PEG-PEI。方法：应用纳米粒径-zeta电位仪、透射电镜、凝胶阻滞实验和髓结合实验测定Gal—PEG-PEI与psiRNA复合物的理化性质，CCK-8法检测其细胞毒性，纳米复合物转染HepG2细胞并观察其转染效率。主要观察指标：Gal-PEG-PEI／psiRNA的粒径、zeta电位及形态；包覆效率：细胞毒性实验结果；肝脏靶向性转染结果。结果：Gal—PEG—PEI／psiRNA复合物的粒径随N／P的增大而减小，最小粒径为81．1nm，而zeta电位随Gal-PEG-PEI中氨基与psiRNA磷酸基比例的增大呈上升趋势；Gal—PEG-PEI对siRNA质粒有较好的包覆效率。Gal—PEG-PEI载体的细胞毒性小于聚乙烯亚胺而其转染效率高于聚乙烯亚胺。结论：成功合成Gal-PEG-PEI纳米基因载体，表现出良好的肝细胞靶向性，且细胞毒性较小。     

人骨髓间充质干细胞靶向纳米基因载体制备及体外细胞磁共振成像

目的 探讨靶向纳米基因载体单链神经节苷脂抗体-聚乙二醇-聚乙烯亚胺-超顺磁性氧化铁（scAbGD2-PEG-g-PEI-SPION）转染人骨髓间充质干细胞（hBMSCs）的可行性、效率及体外细胞MR显像能力。方法 合成scAbGD2-PEG-g-PEI-SPION后,采用凝胶阻滞实验评估其复合外源性基因的能力;动态光散射法测量scAbGD2-PEG-g-PEI-SPION/pDNA纳米复合物的粒径大小及表面电位;体外细胞毒性实验检测其对hBMSCs的细胞毒性。采用流式细胞仪检测scAbGD2-PEG-g-PEI-SPION靶向转染hBMSCs的效率,并设置PEG-g-PEI-SPION组、cAbGD2-PEG-g-PEI-SPION组、抗体竞争抑制（scAbGD2-PEG-g-PEI-SPION+free AbGD2）组和同型抗体（scAbIgG2a-PEG-g-PEI-SPION）组,通过激光共聚焦显微镜及普鲁士蓝染色观察hBMSCs对纳米复合物的摄入。通过体外细胞MR扫描验证scAbGD2-PEG-g-PEI-SPION的MR成像功能。结果 scAbGD2-PEG-g-PEI-SPION细胞毒性小,复合外源性基因后能够形成稳定的纳米复合物,粒径80~100 nm。在相同的N/P比值下,scAbGD2-PEG-g-PEI-SPION组的转染率明显高于其他组（P<0.001）。N/P=20时,靶向组具有最高转染率[（59.60±4.50）%]。同时,scAbGD2-PEG-g-PEI-SPION中的SPION可有效标记hBMSCs,在MR T2/T2^*加权图像上呈低信号。结论 scAbGD2-PEG-g-PEI-SPION是一种MRI可视的、可有效转染hBMSCs的靶向纳米基因载体。     

聚乙二醇-聚乙烯亚胺/四氧化三铁纳米磁流体的毒性及其生物相容性

背景:为实现纳米基因药物在治疗肿瘤中实现高靶向性,课题采用聚乙二醇和聚乙烯亚胺修饰的磁性四氧化三铁纳米粒(PEG-PEI/Fe_3O_4)作为基因药物载体,在提高载体载药能力的同时,使载体具有超顺磁性,增加药物靶向性能.目的:评价PEG-PEI/Fe_3O_4纳米磁流体体外和体内毒性.方法:对制备的PEG-PEI/_3O_4纳米磁流体进行表征达到纳米材料水平后,过滤稀释5～20倍培养7702细胞和HpG_2细胞,进行体外MTT毒性试验;通过体内溶血试验和微核试验测定生物相容性和体内毒性.结果与结论:MTT结果显示,PEG-PEI/Fe_3O_4纳米磁流体对7702细胞毒性0～1级,对正常肝细胞无害;PEG-PEI/Fe_3O_4纳米磁流体对HpG_2细胞有轻微的旁观者抑制效应;PEG-PEI/Fe_3O_4纳米磁流体溶血率为0.372%,远小于5%;微核试验结果表明PEG-PEI/Fe_3O_4纳米磁流体无致畸、致突变作用.     

mPEG-CS纳米粒介导livinshRNA基因纳米复合物的制备及转染效率

背景：作为非病毒基因转染载体,由可降解的高聚物形成的纳米载体目前被广泛由于基因转染,因为他们具有良好的缓释性,靶向性和生物相容性。目的：制备mPEG-CS纳米粒,探讨mPEG-CS作为Livin shRNA基因转染载体的可行性。方法：通过离子交联法制备mPEG-CS纳米粒,利用聚乙二醇对壳聚糖进行改性,通过静电吸附法制备载livin shRNA的基因纳米复合物。Zeta-size分析仪和透射电镜检测空白纳米粒和载livin shRNA的基因纳米复合物的形态、粒径和zeta电位,测定基因纳米复合物的包封率,凝胶电泳阻滞实验和DNase I酶消化实验验证纳米粒对基因的保护作用。利用最佳条件下制备的基因纳米复合物,转染大肠癌HT-29细胞,考察转染效率。结果及结论：成功制备出约60nm的mPEG-CS纳米粒,当纳米粒与基因体积比为3∶1时,得到的基因纳米复合物形较规则,粒径100nm左右;其包封率为（94.32±0.35）%。凝胶电泳阻滞实验表明纳米粒能够紧密结合DNA,对基因具有良好的基因保护作用。该基因纳米复合物转染大肠癌细胞的转染效率高,持续作用时间长。mPEG-CS纳米粒作为基因转染载体,对基因具有保护作用,能够将livin shRNA重组质粒高效转染入大肠癌细胞,能够在大肠癌细胞内长时间表达,克服了RNA干扰在基因治疗肿瘤中基因作用时间较短的缺点。     

叶酸-壳聚糖介导survivin shRNA基因纳米载体的制备

背景:叶酸-壳聚糖纳米粒是一种新犁的高靶向纳米载体,可进一步提高药物的靶向性,并进一步实现缓释和控释给药.目的:探讨叶酸-壳聚糖纳米粒作为survivin shRNA重组质粒载体传递系统的可行性以及对大肠癌细胞(SW480)的转染效率.设计、时间及地点:对比观察实验,于2008-06/2009-01在中南大学卫生部纳米生物技术重点实验室完成.材料:壳聚糖(脱乙酰度>90%)由上海伯奥生物科技有限公司提供,叶酸由国药集团化学试剂有限公司提供,survivin shRNA重组质粒由上海吉凯基因化学技术有限公司提供.方法:首先制备粒径均匀的叶酸偶联壳聚糖纳米粒,然后将20 mg/L survivin shRNA重组质粒和10 mg/L叶酸-壳聚糖混合制各基因纳米复合物,同时以阳离子脂质体基因复合物作为对照,将上述两者转染大肠癌细胞.主要观察指标:基因纳米复合物的理化性质及转染效率;Western blotting检测转染后肿瘤细胞中survivin蛋白的表达.结果:成功制备叶酸-壳聚糖介导的survivin shRNA重组质粒基因纳米复合物.该基因纳米复合物转染大肠癌细胞的效果强于阳离子脂质体基因复合物.且转染后大肠癌细胞中survivin蛋白的表达显著低于阳离子脂质体基因复合物.结论:叶酸-壳聚糖纳米粒作为载体系统能将survivin shRNA重组质粒商效递送到大肠癌细胞,从而诱导人大肠癌细胞的凋亡.     

mPEG-CS纳米粒介导livinshRNA基因纳米复合物的制备及转染效率

背景:作为非病毒基因转染载体,由可降解的高聚物形成的纳米载体目前被广泛由于基因转染,因为他们具有良好的缓释性,靶向性和生物相容性。目的:制备mPEG-CS纳米粒,探讨mPEG-CS作为Livin shRNA基因转染载体的可行性。方法:通过离子交联法制备mPEG-CS纳米粒,利用聚乙二醇对壳聚糖进行改性,通过静电吸附法制备载livin shRNA的基因纳米复合物。Zeta-size分析仪和透射电镜检测空白纳米粒和载livin shRNA的基因纳米复合物的形态、粒径和zeta电位,测定基因纳米复合物的包封率,凝胶电泳阻滞实验和DNase I酶消化实验验证纳米粒对基因的保护作用。利用最佳条件下制备的基因纳米复合物,转染大肠癌HT-29细胞,考察转染效率。结果及结论:成功制备出约60nm的mPEG-CS纳米粒,当纳米粒与基因体积比为3∶1时,得到的基因纳米复合物形较规则,粒径100nm左右;其包封率为(94.32±0.35)%。凝胶电泳阻滞实验表明纳米粒能够紧密结合DNA,对基因具有良好的基因保护作用。该基因纳米复合物转染大肠癌细胞的转染效率高,持续作用时间长。mPEG-CS纳米粒作为基因转染载体,对基因具有保护作用,能够将livin shRNA重组质粒高效转染入大肠癌细胞,能够在大肠癌细胞内长时间表达,克服了RNA干扰在基因治疗肿瘤中基因作用时间较短的缺点。     

C3A细胞与L-02永生化肝细胞低温保存条件下的生物学特性比较

背景：获得大量功能良好的肝细胞是生物人工肝的核心。探索出一种可靠的肝细胞低温保存方法进而构建一个肝细胞库是目前生物人工肝研究的热点。目的：比较用UW液在4℃条件下保存已经进入Ⅲ期临床试验的C3A细胞与国内构建的永生化肝细胞株L-02细胞的生物学特性。方法：贴壁培养C3A与L-02细胞,胰酶消化,制备成细胞悬液,UW液保存。4℃低温保存0,24,48及72h后,采用流式细胞术分别测定细胞存活率与凋亡率,测定谷草转氨酶与乳酸脱氢酶释放、尿素合成功能及白蛋白分泌功能。结果与结论：随低温保存时间延长,C3A与L-02细胞存活率呈下降的趋势,但C3A细胞的存活率明显高于L-02细胞（P〈0.01）;细胞凋亡率呈上升趋势,但48h后C3A细胞同L-02细胞无差异（P〉0.05）。谷草转氨酶及乳酸脱氢酶释放呈现上升的趋势,但C3A细胞明显低于L-02细胞（P〈0.01）。白蛋白分泌功能呈下降的趋势,但C3A细胞明显优于L-02细胞（P〈0.01）。尿素合成功能呈下降的趋势,但是L-02细胞明显优于C3A细胞（P〈0.01）。结果提示,UW液4℃保存C3A细胞与L-02细胞时间不易超过48h。以C3A细胞为材料的人工肝可能更适用于肝功能衰竭合并低白蛋白血症,以L-02细胞为材料的人工肝更适用于肝功能衰竭合并肝性脑病。     

纳米石墨碳对人L-02细胞系生长状况的影响

目的研究纳米石墨碳对人正常肝细胞系L-02生长状况的影响。方法电子显微镜观察纳米石墨碳颗粒的形态,激光粒度分析仪测定其粒径及Zeta电位;流式细胞术检测纳米石墨碳作用24 h对L-02肝细胞生长周期的影响;电镜观察细胞剖面,用以考察纳米石墨碳颗粒对L-02肝细胞亚显微结构的影响。结果电镜下纳米石墨碳颗粒呈微小球形,粒径在20～50 nm,表面带负电荷,电位值为-14.8 mV;流式细胞检测结果示实验组L-02肝细胞G0/G1细胞百分数低于对照组,G2/M细胞百分数高于对照组,S期细胞百分数高于对照组;电镜观察纳米石墨碳在细胞质和细胞核内均有分布,实验组肝细胞内的线粒体与对照组无明显差异,胞膜核膜均完整。结论纳米石墨碳颗粒促进了L-02肝细胞的增殖,纳米石墨碳颗粒可以很好地进入到L-02肝细胞内部,未见其对细胞亚显微结构造成损伤。     

纳米高聚合物转导Survivin反义寡核苷酸对大肠癌的体内杀伤作用

背景:近年来纳米载体已被视为突破基因转移瓶颈最有前途的技术之一.聚酰胺-胺型树枝状高聚合物(polyamidoamine,PAMAM)是一种新型的纳米材料,体内外实验表明,PAMAM比其他阳离子载体的基因转染效率高、细胞毒性低.目的:探讨PAMAM介导Survivin反义寡核苷酸(Survivin antisense oligonucleotide,Survivin-asODN)对结直肠癌裸鼠移植瘤的抑制作用.设计、时间及地点:肿瘤基因治疗体内实验,于2008-02/08在上海交通大学微纳米科学技术研究院生物纳米工程研究室及南方医科大学珠江医院中心实验室完成.材料:人结直肠癌细胞株SW620购自中科院上海细胞所,PAMAM树形分子由上海交通大学微纳米研究院生物纳米工程研究室提供,脂质体Lipolifectmain~(TM)2000购自美国Invitrogen公司.Survivin-asODN 由上海生工公司合成.方法:将PAMAM和阳离子脂质体分别与Survivin-asODN混合得到载反义基因转染复合物.透射电镜观察复合物的形态,激光散射粒径分析仪测定粒径,zeta电位分析仪测定复合物的zeta电位,离心法和紫外分光分度仪测定复合物的包封率和体外DNA释放速度.将对数生长期的人结直肠癌细胞SW620细胞接种于18只Balb/C裸鼠皮下建立结直肠癌裸鼠皮下移植瘤模型.随机均分为脂质体组、PAMAM组和空白对照组.分别注射脂质体-survivin-asODN转染复合物、PAMAM-survivin-asODN转染复合物、血清培养液,观察两组移植瘤体积,Western bloting方法检测移植瘤组织中survivin基因的表达.主要观察指标:阳离脂质体-survivin-asODN复合物及PAMAM-survivin-asODN复合物的粒经,zeta电位,基因载药率,包封率,释放率,转染后survivin表达率及对凋亡的诱导率,种植肿瘤生长抑制率,移植瘤细胞Survivin蛋白的表达及活性.结果:PAMAM-survivin-asODN复合物的粒径小于脂质体-survivin-asODN复合物的粒径(P<0.01),而zeta电位高于PAMAM-survivin-asODN复合物zeta电位(P<0.05),基因包封率两组差异无显著性意义.PAMAM对DNA持续释放达14 d,但脂质体复合物只持续5 d.PAMAM-survivin-asODN复合物治疗组裸鼠移植瘤survivin蛋白表达低于脂质体-survivin-asODN复合物组(P<0.05).PAMAM-survivin-asODN复合物治疗组移植瘤体积低于脂质体-survivin-asODN复合物组(P<0.05).结论:PAMAM能将Survivin-asODN高效递送到结直肠癌移植瘤细胞,降低survivin蛋白的表达,抑制移植瘤生长.     

壳聚糖球形多孔微载体支持下培养的肝细胞功能及其代谢活性检测

背景：在肝细胞移植及生物型人工肝研究中,肝细胞培养仍然是其关键,如何方便地获取足够数量、活性较好、功能良好的肝细胞已经成为其首要问题。微载体培养技术作为一项体外高密度细胞培养技术,近年来已在肝细胞的体外培养中得到应用。目的：对壳聚糖球形多孔微载体培养的人肝细胞L-02进行定时的细胞功能和代谢活性检测。方法：对以自制的壳聚糖球形多孔微载体样本为支架培养的人肝细胞L-02进行定时的细胞功能检测（包括测定谷草转氨酶,谷丙转氨酶和乳酸脱氢酶质量浓度）和代谢活性检测（包括检测培养基中白蛋白、尿素、葡萄糖含量）,其中实验组为壳聚糖球形多孔微载体支持下培养人肝细胞L-02,对照组为无壳聚糖球形多孔微载体支持下培养人肝细胞L-02,检测时间点为人肝细胞L-02培养的第1,2,3,4,5天。结果与结论：实验组和对照组测定的谷草转氨酶、谷丙转氨酶和乳酸脱氢酶活性在前3d持续下降,第3天降到最低,而从第4天开始重新反弹上升;但白蛋白、尿素和葡萄糖水平在前3d持续上升,第3天升到最高值,而从第4天开始逐渐下降,实验组每天测定上述各项水平始终明显高于对照组（P〈0.05）,提示实验组中的人肝细胞L-02代谢活性较对照组增强。     

WT1基因表达下调对K562/A02细胞阿霉素敏感性的影响

目的 探讨WT1基因表达下调对人红白血病耐药细胞系K562/A02阿霉素敏感性的影响.方法 将WT1mRNA的短发夹RNA(short hair RNA,shRNA)构建至真核表达载体后转染K562/A02细胞,流式细胞术检测转染效率;荧光定量RT-PCR和Western blot法分析WT1基因在转染前后表达的差异;pWT1shRNA转染K562/A02细胞48 h并经阿霉素作用后,MTT法检测各组细胞阿霉素IC50值;流式细胞术检测细胞阿霉素累积量及细胞凋亡率.结果 与未转染对照组及空载体组相比,转染WT1shRNA质粒的K562/A02细胞WT1mRNA和蛋白水平均明显降低;经阿霉素诱导24 h后,其对阿霉素的敏感性明显增高,相对逆转率为71.5%,细胞内阿霉素的累积量较各对照组明显增高(P值均<0.05),细胞凋亡率明显升高(P<0.05).结论 靶向WT1shRNA干扰质粒可有效抑制K562/A02细胞WT1基因表达,增强K562/A02细胞对阿霉素的敏感性.     

A new synthesis of galactose-poly(ethylene glycol)-polyethylenimine for gene delivery to hepatocytes.

A synthesis method of conjugating polyethylenimine (PEI) derivatives with terminally galactose-grafted poly(ethylene glycol) (PEG) was developed by using a bifunctional PEG derivative containing both an alpha-vinyl sulfone (VS) and an omega-N-hydroxysuccinimidyl (NHS) ester groups (VS-PEG-NHS). VS-PEG-NHS is commonly used as a crosslinker to modify proteins with ligands by first coupling amine groups to the NHS ester, followed by coupling sulfhydryl groups to the VS ester, because the reaction of VS groups with amine groups of proteins is suppressed below pH 8. However, the 1H-NMR determination of the conjugated products of branched PEI (M(w)=25 kDa) with VS-PEG-NHS at pH 6.0-8.0 indicated that the VS groups were completely bound to the amine groups of PEI as well as the NHS groups. At pH 7.0, all VS groups reacted with the primary, secondary, or tertiary amine groups of PEI in 2 h. Such different reaction behaviors would be due to a higher density of amine groups of PEI as compared with those of proteins. In contrast, the reactions with a small molecular monoamine, such as p-aminophenyl beta-D-galactopyranoside, showed that the NHS groups selectively coupled with the amine groups, and the VS groups remained completely intact. The NHS groups of VS-PEG-NHS were selectively conjugated to amine groups of p-aminophenyl beta-D-galactopyranoside (VS-PEG-Gal). Then, the VS groups of Gal-PEG unit were completely conjugated with the primary, secondary, or tertiary amine groups of PEI. Thus, the use of only two reaction steps could conveniently carry out the conjugation of terminally galactose-grafted PEG to 1 and 5 mol.% of amine functions in PEI. The gel retardation assay of the complexes between Gal-PEG-PEI and plasmid DNA indicated that these polymeric gene carriers possess the potent ability to condense plasmid DNA electrostatically as well as PEI. The transfection efficiency with 1% Gal-PEG-PEI in human hepatocyte-derived cell lines (HepG2), a model of parenchymal cells in liver (hepatocytes), was superior to that of PEI at their corresponding optimal ratios of polymer to plasmid DNA. In HepG2 cells, luciferase activity with 1% Gal-PEG-PEI at an N/P ratio of 20 was 2.1-fold greater than that of PEI at an N/P ratio of 5. In mouse fibroblasts (NIH3T3) that have no ASGP receptors, the transfection efficiency with 1% Gal-PEG-PEI drastically decreased to 1/40 of that with PEI. These data indicate that a new synthesis method can produce polyethylenimine derivatives with terminally galactose-grafted poly(ethylene glycol) for specific gene targeting to the liver.     

脂质体介导法转染mIMCD-3细胞的可行性及最佳转染条件

背景:近年来阳离子脂质体成为基因转移较为常用的载体,但应用脂质体对mIMCD-3细胞株进行转染的相关报道较少。目的:探讨脂质体法转染mIMCD-3细胞株的可行性,并通过优化脂质体转染效率的影响因素,获得mIMCD-3的最佳转染条件。方法:以绿色荧光蛋白作为报告基因,采用脂质体LipofectamineTM2000包裹pIRES2-EGFP质粒转染mIMCD-3细胞,分别按照细胞接种密度、DNA用量、DNA与脂质体的比例、不同的质粒抽提方法、血清有无设定分组,观察以上因素对mIMCD-3细胞转染效率的影响。结果与结论:采用脂质体LipofectamineTM 2000转染mIMCD-3细胞,在2×108L-1细胞接种浓度、1μgDNA用量、1:3的DNA与脂质体比例时,转染效率最高。采用美国OMEGA公司生产的E.Z.N.A. Endo-Free Plasmid Mini Kit抽提的质粒能获得更高的转染效率。转染前漂洗细胞后换入无血清培养基比有血清组转染效率高(P<0.01),而转染后6h加入血清不影响转染效率。结果显示,脂质体法转染mIMCD-3细胞株是可行的,通过优化脂质体转染效率的影响因素,获得了mIMCD-3的最佳转染条件,可作为有关研究或应用的参考。     

不同超声辐照时间和微泡剂量介导HepG2细胞基因转染的实验研究

目的 探讨不同超声辐照时间和微泡剂量与基因转染效率之间的关系,初步摸索适宜转染的参数条件.方法 质粒DNA用增强型绿色荧光蛋白质粒(pEGFP),以人肝癌细胞(HepG2)为研究对象.超声频率1 MHz.声强0.5 W/cm2,对加入pEGFP和不同剂量微泡的HepG2细胞辐照不同的时间,24 h后用荧光显微镜观察绿色荧光蛋白表达情况,流式细胞仪检测基因转染率,台盼蓝染色检测细胞存活率.结果 各实验组均可见不同程度荧光蛋白表达,辐照时间为20 5和微泡剂量为60μl时可达到较理想的转染效率.结论 在超声频率和声强一定的条件下,不同超声辐照时间和微泡剂量有不同的基因转染效率,20 s、60 μl是一个较理想的参数,为基因治疗进一步研究提供了参考.     

聚酰胺纳米分子介导survivin反义寡核苷酸诱导结肠癌细胞凋亡

背景:传统的病毒载体及非病毒载体在基因治疗中均存在明显的缺点,采用纳米材料作为反义寡核苷酸载体有望获得更好更安全的基因转导,提高基因治疗的有效性和安全性.实验拟采用聚酰胺纳米分子介导反义寡核苷酸阻断survivin表达,诱导大肠癌凋亡.目的:探讨聚酰胺树形分子高聚合物介导survivin反义寡核苷酸(survivin antisense oligonucleotide,survivin-asODN)转染结直肠癌SW620细胞的可行性以及对结直肠癌SW620细胞survivin表达、细胞凋亡的影响.设计、时间及地点:肿瘤基因治疗体外实验,于2007-09/2008-05在上海交通大学微纳米科学技术研究院生物纳米工程研究室及南方医科大学珠江医院中心实验室完成.材料:人结直肠癌细胞株SW620购自中国科学院上海细胞研究所,聚酰胺树形分子由上海交通大学微纳米研究院生物纳米工程研究室崔大祥教授提供,转染试剂脂质体LipofectamineTM 2000购自美国Invitrogen公司.survivin-asODN由上海生工公司合成.方法:采用300 μg/L survivin-asODN和4.06 μg/L聚酰胺制备聚酰胺反义基因复合物,同时制备阳离子脂质体反义基因复合物作为对照.透射电镜观察复合物的形态,激光散射粒径分析仪测定粒径,zeta电位分析仪测定zeta电位,离心法和紫外分光光度仪测定复合物的的包封率、载药率和体外DNA释放速度.将上述两种基因转染复合物转染结直肠癌细胞,测定其转染效率;Western blotting检测转染后细胞中survivin蛋白的表达:流式细胞术检测两组细胞的凋亡率.主要观察指标:阳离子脂质体-survivin-asODN复合物及聚酰胺-survivin-asODN复合物的粒经,zeta电位,基因载药率,包封率,释放率,转染后survivin表达率及对凋亡的诱导率.结果:聚酰胺-survivin-asODN复合物的粒径小于脂质体-survivin-asODN复合物的粒径(P<0.01),但zeta电位高于后者(P<0.05);基因载药率、包封率两组差异无显著性意义:聚酰胺对DNA持续释放14 d,但脂质体只持续5 d.聚酰胺-survivin-asODN转染结直肠癌细胞的效果强于脂质体survivin-asODN(P<0.05).转染后结直肠癌细胞survivin蛋白的表达低于脂质体复合物(P<0.05),细胞的凋亡率高于脂质体复合物(P<0.05).结论:聚酰胺能将survivin-asODN高效递送到结直肠癌SW620细胞,降低survivin蛋白表达并诱导结直肠癌细胞凋亡.     

High-efficiency transfer of cystic fibrosis transmembrane conductance regulator cDNA into cystic fibrosis airway cells in culture using lactosylated polylysine as a vector

To find more efficient vectors for the transfer of CFTR cDNA, lactosylated polylysine was explored for transfer into airway epithelial cells in primary culture. The efficacy and high efficiency of transfection were shown by several criteria: expression of both mRNA and protein for CFTR and the functional correction of the Cl- channel activity. Using specific combinations of agents to enhance the transfection, an efficiency of 90% was obtained as detected by in situ hybridization with digoxigenin-labeled probes generated against exon 14 of CFTR. The highest efficiency was observed by adding E5CA peptide (10 microg) and 5% glycerol to the transfection mixture. The degree of transfection could be controlled by the enhancing agents, thus modulating the efficiency of transfection. The highest level of transfection efficiency is equivalent to that reported for viral vectors. None of the agents or their combinations in the concentrations used were cytotoxic to the primary cells. Antibody pAb3145 was used to detect the expression of the CFTR protein in the cells. When an N-terminal GFP-CFTR fusion gene was used to transfect the CF cells a functional correction of the CFTR Cl- channel was detected by patch-clamp electrophysiology. The high efficiency of CFTR gene transfer with lactosylated polylysine leads to the conclusion that lactosylated polylysine is a promising vector to transfer the CFTR gene into human airway cells in culture.     

胶质细胞源性营养因子及内皮素B受体基因共转染小鼠神经干细胞

背景:胶质细胞源性神经营养因子与内皮素B受体基因的缺失将导致肠神经系统发育异常.神经干细胞移植不仅可以从解剖和功能上修复神经系统,还可以作为基因转染的载体.目的:拟将携带胶质细胞源性神经营养因子和内皮素B受体基因的重组腺病毒转染至小鼠神经干细胞,并观察目的基因的表达.设计:细胞-基因学观察.材料:新生昆明小鼠由华中科技大学同济医学院动物实验中心提供.jetPEI转染试剂为PolyPlus公司产品;携带绿色荧光蛋白的胶质细胞源性神经营养因子、内皮素B受体基因共表达腺病毒由本室孙念峰博士和张景辉博士构建并惠赠.方法:无菌条件下取新生小鼠脑组织,制备单细胞悬液.取携带绿色荧光蛋白的胶质细胞源性神经营养因子和内皮素B受体基因共表达腺病毒,溶解于NaCI中制备JetPEI/DNA复合体.用DMEM/F12完全培养基调整次代神经干细胞密度为5×10~8L~(-1),向24孔板中每孔加入400 μL细胞悬液、100 μL、JetPEI/DNA复合体,置37℃、体积分数为5%的CO_2培养箱中,分别于转染24,48,72 h后收集神经干细胞.主要观察指标:采用荧光显微镜、流式细胞仪检测转染效率,RT-PCR检测目的基因在神经干细胞内的表达.结果:转染24 h后即可在荧光显微镜下观察到绿色荧光蛋白的表达,转染24,48,72 h后绿色荧光蛋白阳性率分别为15.36%,24.67%,25.73%.各转染时间点神经干细胞均表达胶质细胞源性神经营养因子及内皮素B受体基因,转染24 h条带亮度较低,72 h时外源基因表达水平最高.结论:运用jetPEI试剂成功将目的基因转染至小鼠神经干细胞内,且胶质细胞源性神经营养因子和内皮素B受体基因在靶细胞中得到有效转录和表达.     

碱性成纤维细胞生长因子基因转染对鼠眼外肌成肌细胞生物学行为的影响

背景:实验证明外源性的碱性成纤维细胞生长因子可以增强骨骼肌成肌细胞的生长及成活,内源性碱性成纤维细胞生长因子对肌肉修复也有明显作用。但如将其基因转染到眼外肌中也有相同的效果吗?目的:探讨碱性成纤维细胞生长因子基因转染对鼠眼外肌成肌细胞生物学行为的影响。设计:单一样本观察。单位:青岛大学医学院附属医院眼科。材料:原代大鼠眼外肌成肌细胞为前期培养得到,纯度大于90%,并成功构建人PEGFP-N3-bFGF真核表达载体(另文发表)。方法:实验于2005-09/2006-12在青岛大学医学院附属医院中心实验室完成。①实验干预及分组:实验分为试验组:用重组PEGFP-N3-bFGF转染的细胞;对照组1:空载PEGFP-N3转染的细胞;对照组2:培养皿中只加入F-10培养基(体积分数为0.1的胎牛血清)培养的细胞。采用脂质体转染技术,将重组PEGFP-N3-bFGF质粒转染体外培养的大鼠眼外肌成肌细胞中。③实验评估:用免疫组织化学法观察碱性成纤维细胞生长因子表达;用荧光显微镜检测转染效率;在培养的第1,3,5,7,9,11,13,15,21,28天采用ABC-ELISA法检测各组成肌细胞碱性成纤维细胞生长因子蛋白的分泌;采用四甲基偶氮唑盐法检测各组眼外肌成肌细胞增殖情况;根据已知一定浓度标准品的A值计算各组细胞肌酸激酶活性。主要观察指标:①观察碱性成纤维细胞生长因子基因转染体外培养的大鼠眼外肌成肌细胞的效率;转染后的表达情况。②转染后碱性成纤维细胞生长因子蛋白的分泌情况;对大鼠眼外肌肌原细胞生长和分化的影响。结果:①碱性成纤维细胞生长因子基因转染体外培养的大鼠眼外肌成肌细胞的转染率达(42.8±1.2)%。②免疫组织化学检测试验组呈现阳性反应。③转染细胞能够分泌碱性成纤维细胞生长因子蛋白,第5天最高达662.935ng/L。④转染细胞增殖活性明显提高,其A值均比同一时相点的对照组明显增高(P<0.05)。⑤转染后细胞从第5天始至终,肌酸激酶值高于对照组(P<0.01)。结论:碱性成纤维细胞生长因子基因转入大鼠眼外肌的成肌细胞中,能够使大鼠眼外肌的成肌细胞分泌碱性成纤维细胞生长因子,具有促进细胞增殖,提高其成活率,促进其分化能力。     

神经营养素3基因转染神经干细胞及其表达

背景:应用包括神经营养素3的神经营养因子促进周围神经再生是当今周围神经再生研究的热点之一,但是临床应用上缺乏安全、有效的给药途径.基因转染技术为神经营养因子的临床应用提供了新的思路和途径.目的:用神经营养素3基因修饰神经干细胞,并观察在转染后的神经干细胞内的表达情况.设计:完全随机试验.单位:广西医科大学第一附属医院创伤骨科手外科和华中科技大学同济医学院附属协和医院手外科.材料:实验选用健康SD大鼠3只,鼠龄4个月,雌雄不拘,由华中科技大学同济医学院动物房提供.用于转染神经干细胞的重组腺病毒表达载体由华中科技大学同济医学院协和医院骨科实验室构建,浓度为0.15 g/L.方法:实验于2002-12/2004-03在华中科技大学同济医学院协和医院骨科实验室和同济医院中心实验室完成.采用阳离子脂质体介入法,将含绿色荧光蛋白(GFP)基因的组组质粒pAd-神经营养素3转染原代培养的神经干细胞,转染72 h后采用荧光倒置显微镜观察绿色荧光蛋白在神经干细胞上的表达,测定转染率.采用免疫细胞化学染色法和反转录-聚合酶链反应检测转染72 h,1,5周后神经营养素3基因在神经干细胞中的表达和转录情况.主要观察指标:神经营养素3基因在转染后的神经干细胞内的表达情况.结果:①重组质粒pAd-神经营养素3转染神经干细胞:转染72h绿色荧光蛋白在部分神经干细胞上有表达,转染率为40%.5周后仍可见绿色荧光蛋白的表达.②神经营养素3基因在神经干细胞中的转录与表达:转染72 h,1,5周后神经干细胞中均有神经营养素3 mRNA的转录,转染5周后仍有神经营养素3 mRNA的表达.结论:神经营养素3基因以阳离子脂质体为载体,通过腺病毒的介导,可有效的转染培养的神经干细胞并长期表达.     

Efficient transfection of MG‐63 osteoblasts using magnetic nanoparticles and oscillating magnetic fields

Aims: To examine the potential of magnetic nanoparticles (MNPs) in transfecting human osteosarcoma fibroblasts (MG‐63) and investigate the effects of a novel non‐viral oscillating nanomagnetic gene transfection system (magnefect‐nano?) in enhancing transfection efficiency (TE). Methods: MG‐63 cells were transfected using MNPs coupled with a GFP‐carrying plasmid. The magnefect‐nano system was evaluated for transfection efficiency and potential associated effects on cell viability. Results: MG‐63 cells were efficiently transfected using MNPs and the magnefect‐nano system significantly enhanced overall transfection efficiency. MNPs were not found to affect cell viability and/or function of the cells. Conclusion: Non‐viral transfection using MNPs and the magnefect‐nano system can be used to transfect MG‐63 cells and assist reporter gene delivery on a single cell basis, highlighting the wide potential of nanomagnetic gene transfection in gene therapy. Copyright © 2012 John Wiley & Sons, Ltd.