番茄黄化曲叶病毒石家庄分离物的分子鉴定及序列分析

根据番茄黄化曲叶病毒（Tomato yellow leaf curl virus,TYLCV）基因组序列的复制酶保守区设计1对引物JC1,对石家庄具有典型番茄黄化曲叶病毒症状的番茄样品进行检测,经PCR扩增得到626 bp的片段,序列分析比对表明其为TYLCV的一部分。根据上述序列设计1对特异引物QC,通过PCR分离石家庄的TYLCV全长序列并进行测序。同时利用已报道的DNA-B的通用引物CR01/CR02进行PCR扩增。结果表明石家庄分离物只含有DNA-A组分,全长为2 781 bp（GenBank登录号：KF612971）,命名为TYLCV-Shijiazhuang。基因组序列比较发现,该分离物与TYLCV-Israel株系相似性为99.0%。基因组序列系统进化分析表明,石家庄病毒分离物与北京分离物TYLCV-Beijing3（GenBank登录号：GU983859）、山东分离物TYLCV-SDSG-XC（GenBank登录号：KC999851）序列相似性很高,均属于TYLCV-Israel分支。     

番茄黄化曲叶病毒的系统发育分析及多重PCR快速检测

通过对国内已报道的番茄黄化曲叶病毒（TYLCV）的DNA-A全基因组进行序列比对分析,发现TYLCV各中国分离物具有较高的相似性。TYLCV全序列及CP序列核苷酸和氨基酸系统发育分析结果显示,我国中东部及东南沿海地区为番茄黄化曲叶以色列病毒（TYLCV-IL）各分离物所侵染,而西部和西南部内陆地区为番茄黄化曲叶中国病毒（TYLCCNV）各分离物所侵染。基因多态性分析结果表明,TYLCV在进化上具有较强的保守性,但核苷酸突变位点（Pi）在染色体上的分布却具有较高的多态性,因此针对TYLCV的严格保守区设计出3对特异性引物,建立了以多重PCR技术为基础的快速、高效、特异性检测TYLCV的方法。     

番茄细菌性斑点病菌、溃疡病菌、青枯病菌和疮痂病菌的四重PCR检测方法

针对引起番茄细菌性病害的细菌性斑点病菌（Pseudomonas syringae pv. tomato,Pst）、溃疡病菌（Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis,Cmm）、青枯病菌（Ralstonia solanacearum,Rs）以及疮痂病菌（Xanthomonas campestris pv. vesicatoria,Xcv）,建立了四重PCR检测技术,为病害的快速、准确诊断提供技术支持。根据gap1基因设计Pst特异性引物BW-F/BW-R,经PCR条件优化,扩增出了375 bp的特异性片段。将设计的引物与已报道的3种细菌特异性引物组合,通过设定不同的退火温度、引物浓度、循环次数以及延伸时间,探索影响四重PCR扩增的因素,优化了其反应体系。四重PCR反应体系中的引物对BW-F/BW-R、Fan1/Fan2、RS-1-F/RS-3-R和XCVF/XCVR可分别扩增出细菌性斑点病菌、溃疡病菌、青枯病菌和疮痂病菌长度为375、146、716和517 bp的特异性目的片段,反应体系退火温度为57.1 ℃,4对引物的终浓度分别为0.24、0.16、0.16和0.08 μmol ? L-1,延伸时间45 s,35个循环。该四重PCR反应体系可快速检测田间番茄发病植株中的细菌性斑点病菌、溃疡病菌、青枯病菌和疮痂病菌,灵敏度达到10-1 ng ? μL-1。     

黄瓜棒孢叶斑病菌PCR检测方法的建立

根据黄瓜棒孢叶斑病菌多主棒孢（Corynespora cassiicola）与棒孢属下女贞棒孢（Corynesporalieustri）、威尔士棒孢（Corynespora cambrensis）和其他常见病原真菌Actin 基因序列差异,设计多主棒孢的特异性引物Caa5F/Caa5R,建立了黄瓜棒孢叶斑病菌的PCR 检测方法,可对引起黄瓜棒孢叶斑病的病原菌扩增出160 bp 的特异性条带,检测灵敏性为4 pg · μL-1 DNA,并可从接种后发病的黄瓜叶片总DNA中检测到特异条带。该引物的PCR 检测方法灵敏性较高,可直接检测植株总DNA,无需病原菌的分离培养,适用于对黄瓜棒孢叶斑病特异快速的检测。     

甘肃地区番茄细菌性斑点病菌的鉴定与检测

从番茄病果上分离纯化的细菌菌株,经致病性测定、形态特征、培养特性观察及16S rDNA
序列测定,鉴定为番茄细菌性斑点病菌Pseudomonas syringae pv. tomato（Okabe）Young,Dye et Wilkie。
利用特异性引物对已鉴定菌株及番茄发病组织进行PCR 扩增,均扩增出530 bp 左右的特异性片段,印证
了可利用特异性引物MM5F/MM5R 对分离菌株或番茄发病组织进行PCR 扩增以检测番茄细菌性斑点病菌。     

番茄褐色皱纹果病毒分子检测与鉴定

利用3对番茄褐色皱纹果病毒（Tomato brown rugose fruit virus,ToBRFV）特异性引物对云南红河、宁夏银川、北京顺义疑似病毒病样本进行RT-PCR检测，分别扩增出大小为812、842、1 053 bp的特异性条带。对扩增产物进行测序及系统进化分析，发现云南、宁夏、北京的ToBRFV分离物与约旦、意大利、荷兰的ToBRFV分离物聚在同一分支上，亲缘关系较近。致病性结果显示，接种后的番茄植株表现出与田间相同的症状，且在发病组织中检测到病毒ToBRFV。表明来自云南红河、宁夏银川、北京顺义的番茄植株均被ToBRFV侵染。     

辣椒疫霉菌RT-PCR检测技术的建立及应用

根据辣椒疫霉菌（Phytophthora capsici Leonian）与致病疫霉菌（Phytophthora infestans）及其他8种常见土传病害病原菌Actin基因序列差异,设计并筛选出辣椒疫霉菌的特异性引物YM2F/YM2R,建立辣椒疫霉菌的实时荧光定量PCR检测体系,并利用该体系定量检测人工模拟带菌样品及田间发病土壤样品中的辣椒疫霉菌。试验结果表明,利用该引物建立的实时荧光定量PCR检测体系线性关系良好,灵敏度为1 × 10-1 pg ? μL-1,是普通PCR的100倍。该体系无需病原菌的分离培养即可对土壤中的辣椒疫霉菌进行快速、特异且定量检测。对田间土壤样品的检测结果表明,在一定范围内病害发生、流行程度与病原菌密度成正比,从而为该病的流行监测和早期防控提供科学依据。     

福建西番莲上首次检出东亚西番莲病毒

为明确东亚西番莲病毒（East Asian passiflora virus,EAPV）在福建西番莲上的发生情况,采用血清学和RT-PCR检测技术对采集的西番莲病样进行检测,并对阳性样品PCR产物进一步克隆、测序和序列分析。结果表明,11份样品的马铃薯Y病毒属（Potyvirus）病毒血清学检测结果为阳性,大豆花叶病毒（Soybean mosaic virus,SMV）血清学检测结果均为阴性;应用Potyvirus属通用引物从11份样品中扩增得到预期大小约660 bp的目的片段,序列比对发现,其中10份阳性样品与已报道的夜来香花叶病毒（Telosma mosaic virus,TeMV）核苷酸序列高度一致,1份样品与已报道的EAPV核苷酸序列一致性超过98.3%。针对EAPV疑似样品（命名为FJBXG-P1）,利用特异性引物扩增得到预期大小约955 bp的目的片段,获得的外壳蛋白（Coat protein,CP）基因序列全长870 bp（GenBank登录号：MG650164）。序列比对发现,EAPV分离物FJBXG-P1的CP基因序列与已报道的EAPV核苷酸序列、氨基酸序列一致性分别为81.0% ~ 97.6%和84.0% ~ 96.9%;系统发育分析结果表明,38个EAPV分离物在系统发育关系上聚为两簇（GroupⅠ和GroupⅡ）,其中GroupⅠ为AO株系,GroupⅡ为IB株系,FJBXG-P1分离物属于AO株系。福建西番莲上EPAV的检出,是该病毒在中国大陆地区发生的首次报道。     

菠萝凋萎相关病毒-3实时荧光定量PCR检测方法的建立

【目的】建立菠萝凋萎相关病毒-3实时荧光定量PCR检测方法。【方法】根据PMWa V-3外壳蛋白基因的保守区域设计特异性引物和探针,通过优化PMWa V-3实时荧光定量PCR检测体系,构建以重组质粒为标准品的标准曲线,建立起PMWa V-3实时荧光定量PCR检测方法。【结果】该方法能特异性地检测PMWa V-3,且灵敏度是普通RTPCR的10倍;该方法重复性良好,组间和组内变异系数均小于1.73。【结论】建立的实时荧光定量PCR方法是一种快速、简便、可信度高的PMWa V-3定量检测方法。     

大白菜KASP反应体系的优化与建立

以大白菜基因组DNA为模板,对影响竞争性等位基因特异性PCR（Kompetitive allele specific PCR,KASP）的反应体积、引物浓度和DNA模板用量等3个参数进行优化,建立了适用于大白菜的KASP反应体系。96孔模块最佳反应体系中,总反应体积为8 μL,其中模板DNA（60 ~ 80 ng · μL-1）1 μL,KASP Master mix（2×）4 μL,引物混合物（50 μmol · L-1）0.14 μL,ddH2O 3 μL。384孔模块最佳反应体系中,总反应体积为4 μL,其中模板DNA（60 ~ 80 ng · μL-1）1 μL,KASP Master mix（2×）2 μL,引物混合物（50 μmol · L-1）0.07 μL,ddH2O 1 μL。利用不同引物和不同的大白菜材料对优化的反应体系进行验证,均获得了较好的KASP-SNP分型,验证了该优化体系的稳定性。该反应体系可以用于大白菜遗传多样性研究、基因定位、遗传图谱构建等遗传学研究。     

马铃薯Y 病毒实时荧光定量RT-PCR 检测体系的建立及应用

根据文献报道和GenBank 已登录序列设计引物建立了马铃薯Y 病毒（potato virus Y，PVY）实时荧光定量RT-PCR 检测技术体系。该技术标准曲线循环阈值与模板浓度呈现良好的线性关系，相关系数R² 为0.991 2，可特异性检测PVY，灵 敏度达常规RT-PCR 的1 000 倍，重复性好。利用建立的检测方法对山东省、青海省、贵州省、黑龙江省和河北省5 个地区 马铃薯植株中的PVY 进行检测，检出率较常规RT-PCR 技术分别高16.00、33.33、25.00、14.29、20.00 百分点。因此，建 立的PVY 实时荧光定量RT-PCR 检测体系具有特异性强、灵敏度高的特点，可以快速、准确地检测马铃薯带病种薯和植株 中PVY 的含量，为马铃薯Y 病毒的早期监测和有效防治提供了有效的技术手段。     

番茄细菌性斑点病菌实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

以番茄细菌性斑点病病原菌丁香假单胞菌番茄致病变种(Pseudomonas syringae pv. tomato,Pst)的致病相关基因HrpZ为靶序列,设计了特异性引物Pst3F/Pst3R,能从Pst基因组DNA中特异性扩增出大小为161 bp的目的片段。建立的Pst实时荧光定量PCR检测技术体系的检测灵敏度比普通PCR高1 000倍。利用实时荧光定量PCR检测体系,检测模拟带菌种子中Pst的带菌量,检测下限为4.21 cfu·g~(-1);检测人工接种叶片组织中Pst的带菌量,检测到1级发病叶片带菌量为4.15×102 cfu·g~(-1)。对田间采集的63个番茄细菌性斑点病明显症状和疑似症状样本,分别进行了实时荧光定量PCR、普通PCR和病原菌分离检测,检测到54个样本中含有Pst,3种方法检测结果一致。结果表明,建立的Pst实时荧光定量PCR检测体系具有特异性强、灵敏度高的特点,可以快速准确地定量检测番茄种子和发病组织中Pst的含量,为番茄细菌性斑点病的早期预防和流行监测提供了有效的技术手段。     

马铃薯土传病原菌快速检测方法的比较分析及其应用

马铃薯土传病害日益严重，对病原菌进行快速检测是病害早期诊断、预测监控、综合防治的重要基础。本文综合比 较了普通PCR、巢式PCR、实时荧光定量PCR、多重PCR 和环介导等温扩增技术（LAMP）在灵敏度和特异性等方面的特点， 以及在检测马铃薯土传病害时的优缺点；总结了各病害检测报道的引物信息和检测体系的优势。同时，对各技术的应用前景 进行展望，旨在对马铃薯土传病害的快速检测方法及其发展趋势有一个全面的了解。     

Repair effect of purple sweet potato anthocyanin on intestinal barrier injury in mice with ulcerative colitis induced by DSS

AIM To explore the repair effect of purple sweet potato anthocyanin on intestinal barrier injury of ulcerative colitis mice induced by dextrin sulfate sodium （DSS）. METHODS The mice were randomly divided into normal drinking group， DSS model group， different doses of purple sweet potato anthocyanin （12.5， 25， 50 and 75 mg/kg） groups， and 5-aminosalicylic acid （5-ASA） positive drug control group. Except using normal drinking water for control group， the mice in the other groups were treated with 2.5% DSS in drinking water for 7 days to induce the ulcerative colitis model. The mice in purple sweet potato anthocyanin treatment group and the 5-ASA positive drug control group were given the drug by intragastric gavage on the first day of modeling. The body weight of the mice and the hematocheziawere recorded every day. After continuous administration for 8 days， the mice in each group were killed and colon tissue was retained. Immunohistochemical technique （IHC） was used to detect the expression of tight junction protein ZO-1 and occludin and inflammatory factors tumor necrosis factor-α （TNF-α） and interleukin-6 （IL-6） in the colon of mice. The expression of mucin in goblet cells of colon tissue was observed by glycogen PAS staining. The protein expression of ZO-1， occludin， TNF-α were determined by Western blot， Sirius red staining was used to detect colonic fibrosis in mice. RESULTS Compared with control group， the disease activity index and histological injury of DSS model mice were significantly increased（P<0.01）. Compared with model group， the disease activity index scores of the mice in different dose groups of purple sweet potato anthocyanin were decreased. The expression and distribution of ZO-1 and occludin in colon tissues were increased， and the expression and distribution of TNF-α and IL-6 in colon tissues were decreased. Glycogen PAS staining showed a significant increase in the distribution and expression of mucin in goblet cells of colon tissues in the purple sweet potato anthocyanin treatment group. Sirius red staining also showed that the degree of fibrosis in the purple sweet potato anthocyanin treatment groups was lower than that in model group. CONCLUSION Purple sweet potato anthocyanins has therapeutic effect on ulcerative colitis in mice induced by DSS， mainly through up-regulating the expression of tight junction proteins ZO-1 and occludin， to protect the integrity of intestinal barrier， inhibiting the expression of inflammatory cytokines TNF-α and IL-6 and intestinal fibrosis， to suppress the development of colonic inflammation.     

A stem-loop primer probe PCR method for measurement of hepatitis B virus miR-3

AIM To establish an absolutely quantitative PCR method for hepatitis B virus （HBV）-encoded microRNA， HBV microRNA-3 （miR-3）， by widely screening specific primer-probe combinations. METHODS We designed the stem-loop primers and tested their performance in the SYBR Green-based qPCR settings. Those primers with high specificity were tested in combination with TaqMan MBG probes for optimized measurement of HBV miR-3. RESULTS In all， 25 sets of stem-loop primers were designed and tested. Using SYBR Green-based RT-qPCR method， 6 primer sets with acceptable specificity were found. Through testing with their corresponding probes， we identified a primer-probe set that achieved a dynamic range of 10²~10⁸ copies per PCR for quantification， with almost 88% of amplification efficiency. CONCLUSION We established a primer-probe set that could be used for precisely and specifically quantifying HBV miR-3.     

葡萄蚕豆萎蔫病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法及应用

建立了葡萄蚕豆萎蔫病毒（Grapevine fabavirus，GFabV）的实时荧光定量RT-PCR（RT-qPCR）检测技术。该技术标准曲线循环阈值与模板浓度呈良好的线性关系（扩增效率103.8%，相关系数0.998），灵敏度是常规RT-PCR的1 000倍，并具有特异性。采用RT-qPCR和常规RT-PCR方法对葡萄不同发育时期及不同部位的316个样品进行检测，结果表明RT-qPCR方法对GFabV的检出率（96.8%）明显高于RT-PCR（70.8%）。RT-qPCR对休眠枝条中GFabV的检出率达100%，对其他部位样品的检出率均在92%以上，明显高于RT-PCR（42% ~ 97%）。各个发育时期样品GFabV的RT-qPCR检出率（85% ~ 95%）也普遍高于RT-PCR（70% ~ 90%）。该技术对于田间样品的检测适用范围广。     

马铃薯5种病毒多重PCR检测技术的建立及应用

采用多重RT-PCR方法,建立可同时检测马铃薯X病毒（PVX）、马铃薯M病毒（PVM）、马铃薯Y病毒（PVY）、马铃薯A病毒（PVA）和马铃薯S病毒（PVS）的方法。根据 GenBank中PVX、PVM、PVY、PVA及PVS（CP）基因序列设计特异引物,对多重RT-PCR退火温度、循环次数、延伸温度、引物组合浓度进行优化,建立了能同时检测5种马铃薯病毒的多重RT-PCR方法。该方法能同时扩增出PVX、PVM、PVY、PVA及PVS特异片段,其大小分别是138、213、369、468和657 bp。测序结果表明,5种病毒的序列与相应参考序列相似性达到97%以上。灵敏度分析结果表明,多重RT-PCR方法能够检测植物组织量为10-3 mg。应用建立的多重RT-PCR检测方法对田间样品和组培苗进行检测,结果显示,该方法可以准确、快速、灵敏地同时检测单一或复合侵染的5种马铃薯病毒。     

接头连接介导的PCR 扩增马铃薯抗晚疫病基因侧翼序列研究

利用接头连接介导的PCR 技术，以前期NBS profiling 试验获得的1 条马铃薯抗晚疫病基因
片段为基础，设计巢式基因特异性引物，扩增获得两侧序列。结果表明：基因组DNA 经DraⅠ酶切后，
在已有536 bp 片段的左侧和右侧均得到序列延伸，右侧扩增得到2 301 bp，左侧扩增得到820 bp，去除
边界序列后，向左延伸789 bp，向右延伸2 273 bp，拼接后共长3 443 bp。采用GENSCAN 进行基因预测，
发现包含内含子在内的晚疫病抗性基因全长2 413 bp，在该预测基因 的UTR 区域设计特异性引物，在马
铃薯抗病和感病的基因型中扩增包含完整基因在内的2 571 bp 序列，发现该特异候选基因与晚疫病抗性相
连锁。     

莲藕GBSS基因cDNA全长的克隆与序列分析

采用RT-PCR结合RACE技术,扩增得到全长为2265bp的莲藕＂美人红＂品种的GBSS基因的cDNA序列（GenBank登录号EU938541）,其中开放阅读框（ORF）长为1848bp,共编码615个氨基酸。用DNAman软件比对,莲藕GBSS基因cDNA与金鱼草（AJ006293）、马铃薯（EU403426）、大豆（EF153101）、水稻（EU735072）Wx基因cDNA序列的同源性分别达61.2%、59.6%、64.2%、50.6%。对该基因编码的氨基酸序列进行Blastp分析发现,该序列与金鱼草的序列同源性最高,达到77%,与马铃薯、甘薯的同源性达到75%,与豆科植物的同源性在70%～75%,与禾本科植物的同源性在65%～70%。     

‘伏令夏橙’原位转化体系的建立及优化

以‘伏令夏橙’实生苗为材料进行原位转化体系建立及优化。首先，研究侵染部位对原位转化效率的影响：使用带有PBI121载体的农杆菌分别侵染5周龄‘伏令夏橙’实生苗上胚轴切口、顶芽切口（保留/去除真叶）2次，共培养3 d后进行抗性筛选及暗处理，7周后提取叶片DNA用于转基因植株PCR鉴定；之后，以上胚轴切口作为侵染部位进一步研究苗龄对原位转化效率的影响。研究结果表明，5周龄上胚轴切口再生率为93.10%，转化率为20.68%；保留/去除真叶后侵染顶芽时，再生率分别为81.74%和94.55%，转化率分别为19.09%和17.82%；4周龄和6周龄上胚轴切口再生率为94.59%和91.50%，转化率为25.42%和19.36%。可见利用农杆菌介导的遗传转化法原位转化4周龄‘伏令夏橙’的上胚轴切口可获得较高的转化效率。原位转化操作简单、周期短、转化率高，在甜橙遗传育种研究中具有重要的应用价值。