抗弓形虫表膜抗原P30单克隆抗体的制备与鉴定

为制备抗弓形虫主要表膜抗原P30单克隆抗体并进行鉴定,进而为弓形虫病诊断、抗原的提纯及亚单位疫苗的制备等提供可靠依据。用弓形虫速殖子膜蛋白为免疫原免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合,筛选出能够稳定分泌高滴度抗P30单克隆抗体的杂交瘤细胞株,并测定单克隆抗体免疫球蛋白亚类和抗体效价,用IFAT进行单抗识别的抗原定位,并通过SDS-PAGE和Western-Blot分析鉴定。结果获得了两株抗P30抗原的杂交瘤细胞株E3和G2,其分泌的抗体与肺孢子虫、隐孢子虫等抗原均不发生交叉反应。2株单抗均属IgG1亚类,且识别的抗原定位于速殖子表膜。结果表明,制备的抗P30抗原的杂交瘤细胞株能分泌高滴度和特异性的单克隆抗体。     

恶性疟原虫乳酸脱氢酶单克隆抗体的制备及其鉴定

[目的 ]制备抗恶性疟原虫乳酸脱氢酶 (LDHp)单克隆抗体 (McAb) ,并对其特异性进行鉴定。[方法 ]用纯化的LDHp重组抗原免疫BALB/c小鼠 ,采用杂交瘤技术制备McAb ,筛选分泌高滴度McAb的杂交瘤细胞株 ,测定其免疫球蛋白亚类及其效价 ,ELISA、Westernblot试验分析其特异性。 [结果 ]筛选出 2A5和1H10两株能稳定分泌抗LDHpMcAb的杂交瘤细胞株 ,两株单抗均为IgG2b,2A5和 1H10培养上清的ELISA效价分别为 1∶5 12和 1∶2 5 6 ,腹水效价分别为 1∶2 5 6 0 0和 1∶12 80 0 ,两株单抗与间日疟原虫、红细胞、弓形虫、日本血吸虫等抗原均不发生交叉反应 ,能识别恶性疟原虫 33kDa的虫源蛋白。 [结论 ]制备的抗LDHp杂交瘤细胞株能分泌高滴度和高特异性的单抗     

抗重组日本血吸虫P38抗原单克隆抗体的制备与鉴定

目的?摇在大肠埃希菌中可溶性表达日本血吸虫P38（SjP38）抗原分子，并以其纯化产物为抗原，制备抗SjP38单克隆抗体(McAb)。 方法 将pET32(a)-P38重组质粒转化大肠埃希菌BL21(DE3)，在1 mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导下表达，超声破菌后获得可溶性表达产物，通过镍柱一步法纯化，以纯化的重组SjP38为抗原，免疫BALB/ｃ小鼠，采用杂交瘤技术制备McAb，用ELISA和有限稀释法筛选出高分泌滴度McAb杂交瘤细胞株，测定其免疫球蛋白亚类及其效价，蛋白质印迹法（Western blotting）分析其特异性。 结果 筛选出能稳定分泌抗重组SjP38单克隆抗体的8株杂交瘤细胞株，均为IgG1； Western blotting 分析显示8株单抗能与日本血吸虫虫卵抗原中的天然P38发生特异性结合。 结论 制备的抗P38杂交瘤细胞株能分泌高滴度、高特异性的McAb。     

2株重组弓形虫P30抗原单克隆抗体的制备和鉴定

目的制备重组P30抗原单克隆抗体,研究其生物活性。方法重组质粒pET28b-P30经BL21（DE3）表达,纯化、复性后免疫BALB/c小鼠,运用杂交瘤技术制备单克隆抗体。ELISA筛选阳性克隆,经亚克隆建株。体内诱生腹水法制备抗体,测定其亚类、效价,Western blot分析其特异性,双单抗夹心-ELISA测定其敏感度。双单抗夹心-ELISA法检测弓形虫感染鼠血清中的CAg。结果筛选出2株抗重组P30的单克隆抗体9D7、2H9,抗体重链分别为IgG2a、IgG1,轻链均为κ链,Western blot显示2株单抗均能识别弓形虫速殖体天然P30抗原。双单抗夹心-ELISA检测抗原量为0.5μg/ml;同法检测鼠血清中的CAg,感染第4、6、8 d的阳性率分别为20%、60%、60%。结论制备的P30抗原单克隆抗体具有较高的敏感性和特异性,为其应用研究打下了基础。     

抗弓形虫表膜抗原P30单克隆抗体的制备与鉴定

为制备抗弓形虫主要表膜抗原Ｐ３０单克隆抗体并进行鉴定，进而为弓形虫病诊断、抗原的提纯及亚单位疫苗的制备等提供可靠依据。用弓形虫速殖子膜蛋白为免疫原免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠，取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞ＳＰ２／０融合，筛选出能够稳定分泌高滴度抗Ｐ３０单克隆抗体的杂交瘤细胞株，并测定单克隆抗体免疫球蛋白亚类和抗体效价，用ＩＦＡＴ进行单抗识别的抗原定位，并通过ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和Ｗｅｓｔｅｒｎ－Ｂｌｏｔ分析鉴定。结果获得了两株抗Ｐ３０抗原的杂交瘤细胞株Ｅ３和Ｇ２，其分泌的抗体与肺孢子虫、隐孢子虫等抗原均不发生交叉反应。２株单抗均属ＩｇＧ１亚类，且识别的抗原定位于速殖子表膜。结果表明，制备的抗Ｐ３０抗原的杂交瘤细胞株能分泌高滴度和特异性的单克隆抗体。     

抗弓形虫重组SAG1抗原单克隆抗体的制备与鉴定

目的制备抗弓形虫SAG1单克隆抗体(McAb)。方法将pET32(a)-trSAG1重组质粒转化EscherichiacoliBL21(DE3),用0.1mmol/LIPTG诱导表达,超声破菌后获得可溶性表达产物,通过Ni-NTA一步法纯化,以纯化的rSAG1为抗原,免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备McAb,用ELISA和有限稀释法筛选出分泌高滴度McAb杂交瘤细胞株,测定其免疫球蛋白亚类及其效价,Western blot分析其特异性。结果筛选出能稳定分泌抗rSAG1单克隆抗体的5株杂交瘤细胞株,抗体重链均为IgG1,轻链均为κ链;Western blot分析显示,5株单抗均能与弓形虫速殖子超声抗原中的天然SAG1发生特异性结合。结论制备的抗rSAG1杂交瘤细胞株能分泌识别SAG1的高特异性单抗,为进一步研究其在弓形虫病免疫诊断中的应用奠定了基础。     

抗弓形虫重组SAG1抗原单克隆抗体的制备与鉴定

目的制备抗弓形虫SAG1单克隆抗体（McAb）. 方法将pET32（a）-trSAG1重组质粒转化Escherichia coli BL21（DE3）,用0.1 mmol/L IPTG诱导表达,超声破菌后获得可溶性表达产物,通过Ni-NTA一步法纯化,以纯化的rSAG1为抗原,免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备McAb,用ELISA和有限稀释法筛选出分泌高滴度McAb杂交瘤细胞株,测定其免疫球蛋白亚类及其效价,Western blot分析其特异性. 结果筛选出能稳定分泌抗rSAG1单克隆抗体的5株杂交瘤细胞株,抗体重链均为IgG1, 轻链均为κ链;Western blot 分析显示,5株单抗均能与弓形虫速殖子超声抗原中的天然SAG1发生特异性结合. 结论制备的抗rSAG1杂交瘤细胞株能分泌识别SAG1的高特异性单抗,为进一步研究其在弓形虫病免疫诊断中的应用奠定了基础.     

刚地弓形虫P30（SAGl）基因的克隆与表达

目的 构建弓形虫P30基因表达载体并获得重组表达蛋白。方法 将弓形虫P30基因的开读框用PCR扩增，NcoⅠ和Hind Ⅲ酶切后，与同样酶切的表达质粒pET-30a( )经T4连接酶连接，然后转化到DH5a中。菌液经PCR扩增和质粒酶切及基因测序鉴定后，将阳性重组质粒转化到大肠埃希菌BL21(DE3)中，经IPTG诱导，表达产物用SDSPAGE和Western blot进行鉴定。结果 扩增的P30基因片段为750bp，重组质粒诱导表达产物分子质量单位为30ku，与理论值相符。Western blot确认重组质粒表达蛋白与小鼠抗弓形虫单克隆抗体(P30McAb)发生特异性反应。结论 成功构建重组体并获得弓形虫主要表面抗原P30的高效表达产物，为弓形虫病的诊断和疫苗研究奠定了基础。     

编码弓形虫表面抗原P30、P22复合基因真核表达载体的构建

目的 构建编码弓形虫RH株表面抗原P30、P22复合基因的真核表达重组质粒，为进一步表达融合蛋白及研制核酸疫苗做准备。方法 用弓形虫RH株腹腔接种小鼠，收集腹水，酚／氯仿法抽提弓形虫基因组DNA；用PCR技术从基因组DNA中扩增编码表而抗原P30、P22的基因片段，分别重组入pMD18T载体中。将pMD18-T载体中的P30、P22基因片段分别酶切，定向克隆入pUC18克隆载体中，pUC18-P30-P22中的P30P22片段经酶切、纯化后，亚克隆入pcDNA3．1(-)真核表达载体，用酶切、PCR及测序的方法对重组子进行鉴定。结果 从弓形虫RH株基因组DNA中扩增出特异的P30及P22片段；大小均与预测值相符；克隆pUC18-P30P22重组质粒的酶切片段分别与P30、P22基冈大小一敛：经亚克隆、筛选鉴定获得了pcDNA3．1-P30-P22重组质粒，所测P30、P22基因序列与文献报道一致。结论 成功构建弓形虫pUC8-P30P21重组质粒和pcDNA3．1-P30-P22重组质粒，为研制弓形虫DNA疫苗奠定了基础。     

弓形虫主要表膜P30抗原的纯化与鉴定

目的　单克隆抗体免疫亲和层析技术提纯弓形虫主要表膜P30抗原SDS-PAGE进行鉴定。　方法　用已建立的能分泌抗弓形虫P30抗原的E3杂交瘤细胞腹腔注入BALB/c小鼠自腹水中收集单克隆抗体（McAb）,经饱和硫酸胺沉淀后DEAE-纤维柱层析纯化,偶联至溴化氢活化的琼脂糖4B载体上装柱,将大量的低频超声粉碎速殖子抗原反复过柱洗脱以收集纯化的P30蛋白质并通过SDS-PAGE进行鉴定。　结果　经单克隆抗体免疫亲合层析约获得了8.1mg较纯的P30蛋白质,在SDS-PAGE上呈现单一条带。　结论　单克隆抗体免疫亲合层析技术为一较好的提纯P30抗原的方法。     

弓形虫主要表面抗原1核酸疫苗与蛋白疫苗联合免疫保护作用的研究

目的 研究刚地弓形虫RH株主要表面抗原1(P30)DNA疫苗诱导BALB/c小鼠的保护性免疫作用。方法 根据弓形虫P30基因的DNA序列设计一对引物,,将PCR扩增到的P30基因克隆到真核表达载体pcDNA.3.1中。大量制备pcDNA3. 1-P30和pcDNA3.1质粒DNA。将48只 BALB/c小鼠随机分成4组,每组1 2只,空质粒对照组(A组)第O、2、4周经小鼠股四头肌注射100 μg pcDNA3.1质粒DNA;重组P30抗原免疫组(B组)第0、2、4周每鼠经背部皮下多点注射50 μg rP30+福氏完全佐剂;P30 DNA疫苗免疫组(C组)第O、2、4周经小鼠股四头肌注射100 μg pcD- NA3. 1-P30质粒DNA;P30 DNA疫苗和重组P30抗原联合免疫组(D组)第O、2周经小鼠股四头肌洼射100 μg pcDNA3. 1-P30质粒DNA,第4周每鼠经背部皮下多点注射50 μg rP30+福氏完全佐剂。末次免疫4周后每鼠用100个弓形虫速殖子经腹腔感染,观察小鼠存活时间。结果 成功构建刚地弓形虫RH株P30DNA疫苗,动物保护性实验表明,虽然与对照组相比实验组小鼠的存活时间有一定的延长,但差异无显著性。结论 pcDNA3.1-P30 DNA疫苗具有弓形虫病候选DNA疫苗分子的潜力。     

弓形虫昆山分离株P30蛋白的纯化、复性和鉴定

目的表达并纯化弓形虫昆山分离株膜蛋白P30。方法将构建的pET28b-P30重组质粒转入大肠埃希菌BL21,挑重组菌于LB培养基中增菌,IPTG诱导其表达,然后纯化包涵体,用尿素溶解包涵体,Ni2 螯合柱纯化产物,以透析法复性蛋白,并用SDS-PAGE和Western blot进行鉴定。结果大肠埃希菌表达的P30蛋白以包涵体的形式存在,P30蛋白经Ni2 螯合柱纯化后纯度大于95%。经Western blot鉴定,复性蛋白能被弓形虫感染的鼠血清识别。结论得到了纯度高的膜蛋白P30。     

编码弓形虫表面抗原P30、P22复合基因真核表达载体的构建

目的　构建编码弓形虫RH株表面抗原P30、P22复合基因的真核表达重组质粒, 为进一步表达融合蛋白及研制核酸疫苗做准备。　方法　用弓形虫RH株腹腔接种小鼠,收集腹水,酚/氯仿法抽提弓形虫基因组 DNA;用 PCR技术从基因组DNA中扩增编码表面抗原 P30、P22 的基因片段,分别重组入 pMD18 T载体中。将 pMD18 T载体中的P30、P22基因片段分别酶切,定向克隆入 pUC18克隆载体中, pUC18 P30 P22 中的 P30 P22 片段经酶切、纯化后,亚克隆入 pcDNA3.1( )真核表达载体,用酶切、PCR及测序的方法对重组子进行鉴定。　结果　从弓形虫 RH株基因组DNA中扩增出特异的P30及P22片段;大小均与预测值相符;克隆 pUC18 P30 P22 重组质粒的酶切片段分别与 P30、P22基因大小一致;经亚克隆、筛选鉴定获得了 pcDNA3.1 P30 P22重组质粒,所测P30、P22基因序列与文献报道一致。结论　成功构建弓形虫 pUC18 P30 P22重组质粒和 pcDNA3.1 P30 P22 重组质粒,为研制弓形虫 DNA疫苗奠定了基础。     

截短的弓形虫P30基因在E.coli中的高效表达及纯化条件的探索

目的：构建能在E.coli中高效表达的弓形虫主要表面抗原（P30）基因的重组表达质粒,并对纯化条件进行优化。方法：对已知的弓形虫P30基因序列进行部分取舍,用PCR技术从弓形虫ZS1株的基因组DNA中扩增出截短的P30基因片段,插入载体pET－30(a）中,转化大肠杆蓖DH5α,IPTG诱导表达,包涵体经洗涤、变性、复性及不同程度的浓缩后,进行SDS－PAGE及免疫印迹分析。结果：从弓形虫ZS1株基因组DNA中扩增出截短的P30基因片段,成功构建重组表达质料粒pET－P30;SDS－PAGE显示蛋白表达带的分子量约为31kD,表达量占菌体总蛋白的31.58％,经1M及2M尿素洗涤后,其纯度分别达63.42％及75.7%;免疫印迹显示,该纯蛋白能被弓形虫病人阳性血清所识别,产而且当浓缩至初始体积的1／3－1／6时,纯化蛋白与DNA免疫鼠血清的反应最强。结论： 成功构建重组质粒pET-P30,并以融合蛋白的形式进行了高效表达,经变 性、复性后,该蛋白具有特异的免疫反应性,为弓形虫诊断试剂盒的研制打下基础。     

弓形虫P30基因重组质粒的构建及其免疫效果

目的　通过构建含弓形虫P30不同表达形式 (膜型、分泌型及细胞内型 )的重组质粒 ,并将其用于免疫小鼠 ,测定抗体水平 ,以期初步筛选出一种对弓形虫感染具有良好保护作用的核酸疫苗。　方法　利用PCR技术和亚克隆技术分别构建弓形虫表膜型P30基因重组质粒 (含完整的P30编码序列 ,包括信号肽及疏水尾 )pcDNA3 P30Mb ,分泌型P30基因重组质粒 (含完整的P30编码序列 ,不包括疏水尾 )pcDNA3 P30Se以及细胞内型P30基因重组质粒 (含完整的P30编码序列 ,但不包括信号肽 )pcDNA3 P30In。将以上 3种重组质粒分别与脂质体混合后免疫小鼠 ,ELISA及免疫印迹测定小鼠血清中特异的IgG抗体。　结果　成功构建了弓形虫P30基因 3种表达形式的重组质粒 ,经双酶切鉴定及DNA序列测定 ,3种重组质粒中的插入片段确为P30的编码基因 ,且读码框架正确 ;抗体测定显示 :3个免疫组均能诱导小鼠产生特异的IgG抗体 ,但各组之间IgG出现的时间及强度有一定的差异。　结论　用编码弓形虫P30抗原的重组质粒进行核酸免疫 ,能诱导免疫小鼠产生特异性的IgG抗体 ;膜型及分泌型免疫小鼠的特异IgG抗体出现的时间早于细胞内型免疫鼠 ,但 4wk后 3组间差异无显著性。     

弓形虫P30基因原核表达载体的构建

为获取具有生物学活性的弓形虫 P30蛋白 ,采用定向克隆的方法 ,自行设计引物通过 PCR扩增得到 P30基因片段 ,用 Eco R 和 Sal 双酶切后 ,连接到同样双酶切的原核表达载体 (p BV2 2 0和 p MAL P2 )上 ,转化大肠杆菌 DH5 α,分别得到含重组质粒 p BV2 2 0 - P30和 p MAL P2 - P30的工程菌。扩菌提取质粒经过酶切分析和 PCR扩增鉴定后 ,证实 P30基因的两个原核表达载体构建成功 ,为其在原核系统中的表达作准备     

重组质粒PcDNA3．1-P30-P22-CTXA2／B在Hela细胞中表达的研究

目的观察重组质粒 pcDNA3.1-P30-P22-CTXA_2/B 在 Hela 细胞中的表达情况,并检测其表达的融合蛋白 P30-P22-CTXA_2/B 免疫学活性。方法脂质体介导重组真核表达质粒 pcDNA3.1-P30-P22-CTXA_2/B 转染 Hela 细胞,G418筛选稳定转染的细胞株,收集蛋白行 SDS-PAGE 和 Westem-Blot 分析,检测融合蛋白的免疫学活性。结果经重组质粒 pcDNA3.1-P30-P22-CTXA_2/B 稳定转染的 Hela 细胞表达了分子量约64KD 的融合蛋白,经 Western-Blot 检测证实该融合蛋白具有 P30免疫原性。结论在HeLa 细胞中成功表达了具有 P30免疫原性的融合蛋白 P30-P22-CTXA_2/B,为下一步动物实验奠定了基础。     

含有弓形虫表面抗原P22、P30复合基因的载体构建

目的　选择弓形虫表面抗原P2 2、P30的有效基因片段 ,共同构建在同一克隆载体pUC19和表达载体 pGE MEXTM- 1上 ,并保证其连接方向及开放读码框的正确。方法　根据已发表P30基因序列 ,用PCR技术调取所需基因片段 ,P2 2基因片段来自重组质粒pGEX - 2T -v2 2 ,将两片段定向克隆于克隆载体 pUC19及表达质粒pGEMEXTM- 1上 ,用酶切及测序的方法对重组子进行鉴定。结果　酶切产物经电泳显示条带清晰 ,P2 2、P30基因片段的泳动位置分别在 4 4 6bp和 86 0bp的位置 ,与预计结果一致 ;测序结果表明插入的复合基因片段方向及序列均正确。结论　成功构建的含有P2 2、P30基因片段的质粒重组体 ,保证了两基因连接方向、序列及开放读码框的正确 ,为今后两基因的进一步复合表达研究奠定了基础。     

弓形虫主要表面抗原P30的克隆、表达与纯化

目的通过分子克隆技术获取弓形虫主要表面抗原P30蛋白。方法自行设计引物,通过PCR扩增获得P30基因片段,采用EcoRⅠ、XhoⅠ双酶切,定向克隆到载体pThioHis中,转化大肠杆菌Top10,利用酶切、DNA序列分析鉴定阳性克隆,异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达,融合蛋白通过镍结合树脂(ProBond~(TM)Resin)进行纯化,并用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质印迹(Westernblotting)鉴定。结果PCR、酶切、连接的产物经电泳鉴定,均与预期设计相符合。DNA序列分析结果表明,除一个同义突变,其余均与文献报道相符。IPTG诱导表达后经层析纯化获得46kDa含P30的融合蛋白。结论通过定向克隆、表达与纯化,获得含P30的融合蛋白。